水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

次の実験の全体的な目標は、環境、リガンド結合、またはタンパク質タンパク質相互作用に応答したタンパク質の確かな柔軟性とその変化を分析することです。これは、リガンド結合など、タンパク質の確認に影響を与えると疑われるさまざまな条件下で、目的のタンパク質を事前にインキュベートすることによって達成されます。次に、反応混合物を酸化重水素に希釈し、異なる時間間隔でインキュベートした後、液体クロマトグラフィー質量分析法で分析して、ペプチド骨格への重水素の取り込みの程度を決定します。

アミド基は、保護領域が重水素の取り込みを減少させたため、結合パートナーの不在下と存在下で実験のペプチドスペクトルを比較すると、陽子と重陽子との間の重量差によるスペクトルのOIDのシフトが明らかになる。結合パートナーの添加後に顕著な保護を示す領域は、潜在的な結合部位です。配列のカバー率とオーバーラップするペプチドの利用可能性に応じて、結合部位を数個のアミノ酸に絞り込むことができます。

この方法は、タンパク質がどのように折り畳まれるか、どのように折り畳まれるか、温度上昇や重金属などの物理的および化学的影響にどのように反応するかなど、タンパク質のフォールディングとタンパク質ダイナミクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。結合とタンパク質間相互作用の比較がタンパク質の確認にどのように影響するか。また、タンパク質医薬品の開発において、適切なフォールディングの検証や一般的な品質管理のためにも非常に重要です。

一般に、この方法に不慣れな個人は、いくつかの困難に遭遇する可能性があります。例えば、タンパク質がペプシンによって十分に消化されない場合、配列カバレッジは低くなります。タンパク質が非常に凝集しやすい場合、インキュベーション中またはクエンチバッファーの添加後に凝集する可能性があり、質量分析計のシグナル強度が低下します。

このデモンストレーションでは、水素交換質量分析STY oneがHP 90に結合し、HB ninetyのABA活性を阻害することによりクライアントの結合を促進する水素交換質量分析STY oneを使用して、酵母分子シャペロンHP 90とそのcos chaperone Styoneへの結合を調査します。この手順は、テキストプロトコルに詳述されているバッファー、サンプル、およびビーズの調製から開始します。アミド水素交換用のカラムを準備するには、ガードカラムの片側を緩め、フィルターをしっかりと取り外します。

パッキングファンネルをカラムの開放端にねじ込みます。16インチアダプターを使用して、空の5ミリリットルシリンジをカラムの下部出口に取り付けます。ガードコラムに気密

漏斗の上に数滴のスラリービーズ材料を塗布します。シリンジのプランジャーを引いて、漏斗を通してスラリーを吸引してガードカラムに入れます。漏斗にさらにスラリービード材料を塗布し、ガードカラムがビード材料で完全に満たされるまで手順を続けます。

次に、漏斗を取り外してから、フィルターとフィルターリングを開放端にしっかりと配置します。カラムキャップをガードカラムにねじ込み、シリンジを反対側から取り外します。ガードコラムの両端をプラグで閉じます。

水素交換質量分析システムをセットアップするためのカラム材料の乾燥を避けるため。まず、トラップカラムを高速液体クロマトグラフィーまたはHPLCシステムに接続します。ポンプ A の流量を 0.1% ギ酸溶媒として毎分 0.4 ミリリットルに設定して、カラムを平衡化します。

質量分析計の校正後、HPLCの出口を質量分析計のソースに接続します。消化性ペプチドを測定するには、まずPepinカラムを接続し、次に分析カラムをシステムに接続します。制御ソフトウェアでクロマトグラフィーと質量分析のパラメータを設定するには、グラジエントタイプと質量分析法を選択します。

良好なクロマトグラフィー分離を確保するために、長いグラジエントを選択してください。質量分析計でタンデム質量スペクトルを有効にします。100マイクロリットルのH 2 L緩衝液中に100〜200ポモのヒートショックタンパク質90またはHSP90を調製します。

100マイクロリットルのクエンチバッファーを加え、ピペッティングで上下に混合します。200マイクロリットルのサンプルをハミルトンシリンジで注入バルブの注入ポートに注入します。注入バルブを注入位置に切り替え、クロマトグラフィープログラムを開始します。

次に、得られたペプチドをデータベースで検索することにより、ヒートショックタンパク質90の消化ペプチドを同定する。氷水を追加して、システム温度を摂氏0度に下げます。タンデム質量分析を行わず、実際の水素交換実験に使用されるグラジエントを使用して、このステップを繰り返します。

ヒートショックプロテイン 90 および STI One の場合、90% 溶媒、10% 溶媒 B から 45% 溶媒 A、A 55% 溶媒 B までの 10 分間のグラジエントを使用し、使用したグラジエントで同定された消化性ペプチドの保持時間を決定し、ペプチド配列、ペプチド電荷、状態、および保持時間を含むリストを作成します。これは、水素交換実験後に各ペプチドを同定するために使用されます。タンパク質タンパク質相互作用界面を同定するには、まずグラジエントおよび質量分析法を設定します。

制御ソフトウェアで、90%溶媒、10%溶媒B、45%溶媒から10分間の線形グラジエントを使用します。A 55%溶媒Bは、300〜1,500質量対電荷比での検出に最適化された質量分析法をロードしますが、ほとんどのペプチドは1000質量対電荷比を下回ります。インジェクションバルブを負荷位置にセットし、6ポートバルブをセットします。

ローディング脱塩位置では、ローディングポンプの流量を毎分0.4ミリリットルに設定してください。テキストプロトコルに記載されているように、変更されていないリファレンスと100%コントロールサンプルを実行した後、1〜5マイクロリットルの容量で20〜100ピコモルの熱ショックタンパク質90を調製します。温度調整された酸化重水素緩衝液を添加して、サンプル量を最大100マイクロリットルまでインキュベートし、テキストプロトコルに記載されているように以前に定義された正確な時間インキュベートします。

交換のダイナミックレンジを決定するときは、100マイクロリットルの氷冷を追加し、バッファーを急冷し、ピペットを上下に2回すばやく200マイクロリットルをHPLCの注入バルブに注入します。注入バルブを注入位置に切り替え、すぐにクロマトグラフィープログラムを開始します。2分後、6ポートバルブを脱塩負荷位置から溶出位置に切り替えます。

これを各タンパク質について個別に行い、相互作用タンパク質の非存在下で各ペプチドへの重陽子の取り込みを決定し、相互作用表面を混合し、熱ショックタンパク質90と少なくとも2倍過剰のSTIと混合して平衡を結合状態にシフトさせ、複合体形成が平衡状態になるまで所望の温度でインキュベートした。インキュベーション後、温度調整された酸化重水素バッファーを添加してサンプル量を最大100マイクロリットルにし、正確に定義された時間インキュベートします。次に、100マイクロリットルの氷冷クエンチバッファーを追加し、ピペットを上下に2回すばやくタンパク質を注入して、以前と同じように実行します。

取得したデータを適切なソフトウェアで解析し、決定された保持時間を使用して、解析中の各ペプチドを見つけます。未変化タンパク質と水素交換実験の同位体分布のOIDを計算し、標的タンパク質のみの重水素の取り込みと過剰な結合パートナーとの共産比を比較します。これは、市販のソフトウェアで自動的に行うことも、スプレッドシートプログラムMを使用して手動で行うこともできますが、HS P 90とSTI Oneとの間の直接的なタンパク質相互作用は、酸化重水素標識後のHS P 90の非存在下と存在下でSTI Oneペプチドスペクトルを比較することによってテストされました。

結果として得られる差分プロットは、TPR 2 AおよびTPR 2 BのほとんどのペプチドがHS P 90の存在下で強力な防御を示すことを示しており、これらの領域がHS P 90と相互作用していることを示しています。TPR 2 Aの保護は、STY one TPR two A TPR two BとHS P 90ペプチドと複合体を形成し、DEUTEROの取り込みから保護されるアミロイドプロトンの数に応じて着色されることから、容易に合理化することができます。タンパク質タンパク質相互作用におけるこのような明確な保護は、常に観察されるわけではありません。

STI Oneの存在下でのHSP 90の保護は、STI Oneほど顕著ではなく、局所的ではありません。すべてのペプチドは、重水素の取り込みによる保護がわずかに増加しています。ここに示されているのは、重陽子の取り込みから保護されるアムリ陽子の数に応じて着色された酵母HS P 90の漫画表現であり、STY 1は、タンパク質の領域がその存在においてより柔軟性を示すため、HS P 90をグローバルに安定化します。

この還元された重陽子の取り込みが、sty oneとの直接的な相互作用によるものなのか、それともアロステリック効果によるものなのかは明らかではありません。HSP 90の連続標識の確認では、水素交換、質量分析を使用して、さまざまなタンパク質領域のダイナミクスを研究しました。ここに示されているのは、HSP 90のヌクレオチド結合ドメインからのペプチド43〜62のスペクトルです。

STI 1の存在下と非存在下では、ペプチドスペクトルは、インキュベーション時間が長くなるにつれて増加する重水素の時間依存的な取り込みを示します。保護の程度はインキュベーション時間を通じて変化し、インキュベーション時間が短いほど大きな差が見られ、最も長い時点ではほぼ同様の交換レートを示します。これは、安定化の度合いが低いか、頻繁な解離と解離を伴う動的相互作用の領域を示唆しています。

この手順を試みる際には、条件を細心の注意を払って一定に保ち、交換反応を開始する前にすべての準備を整えておくことを忘れないでください。この手順に続いて、他の方法を使用して、タンパク質複合体の相互作用部位の位置などの追加の質問に答えることができます。