質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

この手順の全体的な目標は、放出水素重水素交換と側鎖溶解標識と質量分析を組み合わせて、タンパク質の構造を高分解能で監視することです。これは、最初に凍結乾燥、異なる賦形剤の存在下でのタンパク質によって達成されます。固体水素重水素交換では、凍結乾燥タンパク質は、制御された相対湿度と温度の下で密封された乾燥剤中の酸化重水素蒸気にさらされます。

溶解標識のために、タンパク質は賦形剤と光反応剤で凍結乾燥されます。次に、バイアルにUV光を照射して、薬剤をタンパク質に共有結合します。各分析法について、サンプルを再溶解し、質量分析計を使用してインタクトタンパク質レベルとペプチドレベルの両方で分析します。

これら 2 つの方法は、補完的な情報を提供します。タンパク質構造が高度に保持されている製剤は、重水素の取り込みが減少し、溶解性標識が増加するのに対し、摂動構造を持つ製剤は、重水素の取り込みが増加し、溶解性標識が減少します。水素重水素交換や光架橋などの化学標識と質量分析の組み合わせは、最近、活性支持体におけるタンパク質の構造と相互作用の研究に適応しています。

これらの手法がCDやFDIR分光法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、タンパク質の構造と環境を固体状態で高分解能でプローブできることです。まず、200ミリリットルの酸化重水素を乾燥剤の下部コンパートメントに置き、400グラムの炭酸カリウムを追加します飽和溶液を作るには、磁器の乾燥プレートを内側に置き、乾燥剤を気密に密封します。摂氏5度で平衡化させて、43%に近い安定した相対湿度に達する次に、凍結乾燥タンパク質を含むキャップされていないバイアルを乾燥剤の上部コンパートメントに置き、乾燥剤をシールし、摂氏5度でインキュベートします。

水素重水素交換反応を開始してサンプルを収集するには、乾燥物から取り出した直後にバイアルをキャップし、バイアルと液体窒素を急速凍結して反応を急冷します。バイアルは、質量分析まで摂氏マイナス80度で保管してください。高分解能質量分析を使用してサンプルを分析し、バック交換を最小限に抑えます。

冷蔵ボックス内の液体クロマトグラフィーシステムはどうですか?装置を最初にセットアップするには、サンプルループとタンパク質トラップを、脱塩プロセスと溶出プロセスを制御するバルブに接続します。次に、低濃度のチューニングミックスを質量分析計に注入し、質量と電荷比の範囲を200〜3, 200に設定して、システムを校正します。

次に、冷蔵システムを摂氏約0度の安定した動作温度に冷却します。0.2%ギ酸と5%メタノールを水に含んだクエンチングバッファーを調製し、氷上で冷却します。サンプルを液体窒素に移した後、バイアルを慎重に取り出し、2ミリリットルのクエンチングバッファーを添加してサンプルを再構成します。

次に、適切なHPLCおよび質量分析法をロードします。ここでサンプルを分析するには、20ピコモルのミオグロビンをタンパク質トラップで5%アセチルニトリルと0.1%ギ酸で1.7分間脱塩します。次に、タンパク質を3.3分間のグラジエントで溶出させ、80%アセトニトリルと0.1%ギ酸に増やします。

サンプルを注入し、200〜3、200質量対電荷比の範囲で質量スペクトルを収集します。インタクトタンパク質の質量を基準として測定するには、過度に評価されたタンパク質サンプルで同じ方法を使用します。データ解析ソフトウェアを使用して生スペクトルをデコンボリューションすることにより、タンパク質の質量を取得します ミオグロビンサンプル分析の場合、質量範囲を15〜18に設定し、キロダルトンの質量分解能を1ダルトンに、ピークカイトを90%に ペプチド分析の場合は、インタクトタンパク質の場合と同じプロトコルを使用してサンプルを調製します。

サンプルを分析する準備ができたら、固定化されたピピンカラムと分析カラムをバルブに接続し、タンパク質トラップをペプチドトラップに交換します。ペプチドのシステムのキャリブレーションは、無傷のタンパク質に対して実行されていますが、質量を100〜1700の電荷比範囲に設定してから、冷蔵システムを約0度の安定した動作温度に冷却します。システムのキャリブレーションが完了したら、適切なHPLCおよび質量分析メソッドをプログラムします。

ここでは、水中の0.1%ギ酸を含むPepinカラム上の20ピコモルのミオグロビンを消化し、ペプチドトラップ内のペプチドを10%アセチルニトリルと0.1%ギ酸で1.7分間トラップして脱塩する方法をプログラムし、60%アセチルニトリルと0.1%ギ酸に増加するグラジエントで4分でペプチドを溶出します。次に、サンプルを注入し、100〜1700の質量電荷比の範囲でマススペクトルを収集します。タンデム質量分析法で年代不明のペプチドサンプルを分析し、消化性フラグメントを同定します。

次に、実験的に決定されたフラグメントを、ソフトウェアで生成された予測質量とクロスチェックします。次に、質量カットオフを 10 ppm に設定して、一致するペプチドの誤差が高い質量を排除します。ペプチド配列のチャージ状態と保持時間に注意してください。

データ解析ソフトウェアを使用して、消化性フラグメントあたりに組み込まれる重水素の平均数を計算するためにコンパイルされたペプチドデータを使用しますまず、テキストプロトコルに示されているように、賦形剤とルシンでタンパク質を凍結乾燥します。サンプルの調製後、365ナノメートルのUVランプを含むUV架橋剤のスイッチを入れます。ランプを5分間温めます。

ランプが温まったら、ランプをオフにし、製剤を含むキャップされていないバイアルを架橋剤チャンバー内に置きます。サンプルにUV光を40分間照射し、フォトロイシンを含まないサンプルをコントロールとして含めます 照射後キャップをし、バイアルをマイナス20°Cで質量分析まで保存します。質量分析グレードの蒸留水を加えて分析用のサンプルを調製し、最終タンパク質濃度を2マイクロモルにします。

次に、インタクトな重水素化タンパク質と同じ質量分析法を使用してサンプルを分析します。ただし、冷蔵LCシステムは使用しないでください。非標識タンパク質サンプルの質量分析データを取得し、タンパク質の天然質量を決定します。

ペプチドレベル解析用のDERATEDサンプルと同様にデータ解析を行います。まず、無傷のタンパク質で固体フォトライトの標識を行い、マイナス20°Cで保存します。次に、サンプルを100ミリモルの重炭酸アンモニウム緩衝液で再構成し、最終タンパク質濃度を10マイクロモルにします。

サンプルをトリプシンとトリプシンを10対1モル比で混合し、この混合物を摂氏60度で16時間インキュベートします。その間に、サンプルループ、ペプチドトラップ、分析カラムをHPLCシステムバルブに接続します。タンパク質を消化した後、0.1%ギ酸を水に添加して反応を急冷し、最終タンパク質濃度を2マイクロモルにします。

次に、HPLCおよび質量分析法を使用してシステムをプログラムします。ここでは、消化されたミオグロビンの20ピコモルをペプチドトラップに5%アセトニトリルと0.1%ギ酸で1.5分間注入および脱塩し、グラジエントを22分間で55%アセチルニトリルに増やしてペプチドを溶出し、100〜1700質量電荷比の範囲で質量スペクトルを収集します。オンラインツールを使用して、ペプチドの理論質量を計算します。

インタクトタンパク質分析から以前に得られたフォトロイシンの数を含むフォトロイシン付加体。少なくとも4つの欠落した胸の谷間を含めます。Excelでペプチドフォトロイシン付加物の質量リストを作成します。

次に、カットオフポイントを設定して、理論上の質量リストを実験的に観測された質量と一致させ、誤差の少ない質量を特定します。水素重水素交換中に、タンパク質をアンフォールディングすると、水素を重水素タンパク質に置き換えることができ、重水素交換を受けにくい構造を保持しています。固体水素重水素交換質量分析をタロース含有ミオグロビン製剤およびソルビトール含有ミオグロビン製剤で行ったところ、ソルビトール含有製剤は重水素の取り込みが46%増加し、ソルビトール中のミオグロビンの構造が溶解プロセス中により摂動されることを示唆しています。

写真ロイシンは、アクセス可能なアミノ酸側鎖への架橋です。ソルビトールおよびミオグロビン製剤を含むTLOの固体光分解質量分析では、TLO製剤におけるフォトアイネの取り込みが対応するものよりも多く示されました。これは、側鎖がTLOの定式化でアクセス可能なままであったことを示唆しています。

水素重水素交換と溶解標識はどちらも、市販の領域と容易に入手できるMS装置を使用して、任意の製剤の固体状態のタンパク質を特徴付けます。サンプル調製から完全なデータ解析までの合計記録は2週間未満です。このビデオを見れば、タンパク質の構造に関する高解像度の情報を取得する方法と、安定した凍結乾燥タンパク質製剤の設計におけるその重要性について十分に理解できるはずです。