調製とキャラクタリゼーション個々のとマルチ薬ロード物理的に捕捉さ高分子ミセル
2015年8月28日
このプロトコルの目標は、両親媒性ブロック共重合体で構成されるミセル薬物送達システムにおける物理的に閉じ込められた難水溶性薬物の調製と特性評価を記述することです。
次の実験の全体的な目標は、関心のある疾患状態で評価する前に、薬物をロードした細胞を調製し、特性評価する段階的なプロセスを概説することです。これは、研究用の再現性のあるMy細胞を生成するために、溶媒鋳造法によってMy細胞を調製することによって達成されます。第2のステップとして、細胞のローディングの安定性とサイズが評価され、これにより、私の細胞が臨床的に関連性のある濃度をロードして保持する能力が決定されます。
次に、in vivo の安定性を評価する前に、My 細胞が適切な in vitro 放出特性を持つことを確認するために、My 細胞からの薬物放出速度を決定します。この結果は、再現性のある安定したmy細胞が、ここで紹介した評価技術に基づいて、さまざまな疾患状態で薬物送達を追求するためのプラットフォームを提供できることを示しています。この技術や平衡ローディング法や透析法などの既存の方法の主な利点は、再現性のある薬物ローディングとサイズでミオシンをはるかに迅速に調製できることです。
この技術の意味は、ナノスケールの医薬品が従来の形態を超えた機会を提供するため、さまざまな病状の治療や診断にまで及びます、一般的に始めたばかりの個人は、これらの技術に苦労する可能性がありますが、それらは単純ですが、それでもリリース研究を行うことができるため、実際にはバースト効果を評価することはできません。これらの手順を実証するのは、シャーマンデューク、私の大学院生、およびディーパ私の共同研究者であり、まず、DTXの1ミリグラム、EVRの1ミリグラムとペグ4、000ブロックPLA 2200の15ミリグラムの重量を量る私の細胞またはDDMの二重薬のための。秤量した後、薬剤とポリマーを0.5ミリリットルのアセトニトリルに溶解し、次いで溶液を5ミリリットルの丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレータを使用して減圧下で薬物ポリマーアセト溶液を蒸発させることにより、薄い薬物分布ポリマーフィルムを形成する。
これに続いて、50°Cに予熱した0.5ミリリットルの脱イオン水で薬物ポリマーフィルムを再水和し、50°Cの水浴中でフラスコを静かに振とうしてマウス細胞を形成します。溶液を遠心分離管に加え、Gの7,200倍で3分間回転させます。針で溶液を汲み上げ、得られたミセラ溶液を0.2ミクロンのナイロンフィルターを使用して新しい1.5ミリリットルの遠心分離管にろ過し、未解決の薬物や汚染物質を除去しますこの時点で、アセチルI試験の移動相と水で新たに調製したマイセルを水で希釈し、アセチルI試験の移動相で摂氏40度で平衡化したC 8カラムで逆相HPLC分析を行います。逆相HPLCで分析する前に、1対100の比率で、初期薬物負荷を決定します。
希釈していない細胞を室温で48時間保存した後、新鮮な希釈サンプルを調製して逆相HPLCで再評価し、48時間にわたる細胞の薬物安定性を決定します。227ナノメートルと279ナノメートルのDTXとDVRのピークを、それぞれ1.7分と5.7分の保持時間で監視します。データを、薬物負荷の平均プラスまたはマイナス標準偏差として表示します。
次に、新たに調製した細胞と脱イオン水を1〜20の比率で希釈し、最終ポリマー濃度を1ミリグラム/ミリリットルにします。溶液を獣医に移し、動的光散乱測定を行います。ヘリウムネオンレーザーの強度を173度で測定して、散乱を決定します。
データを平均 Z サイズ、標準偏差、プラスまたはマイナス標準偏差、および分布の多分散指数または PDI として表示します。前述のようにDDMを調製した後、2.5ミリリットルのmy細胞を分子量カットオフが7, 000グラム/モルの3ミリリットルの透析カセットにロードします。次の間隔で、カセットを2.5リットルの10ミリモルpH7.4リン酸緩衝液に入れます。
150マイクロリットルの溶液を引き出し、150マイクロリットルの新鮮なバッファーと交換します。バッファを 3 時間ごとに交換して、同期条件を確保します。逆相HPLCを使用してサンプルを分析し、薬物濃度曲線を決定します。
統計ソフトウェアD-T-X-E-V-Rを使用して、1つの位相指数関連を持つ単純な拡散モデルに基づいて薬物放出データを適合させると、DDMはPEG 2000ブロックPLA 1800またはPEG 2000ブロックPLA 2200で48時間にわたって同様の安定性を示しました。私の細胞は、室温で48時間で初期負荷の97%以上を保持していました。動的光散乱の結果に基づくと、すべての細胞はPDI値が0.2未満の単峰性分布を示しました。
データに基づくと、個々のマイセルとDDMからのDTX放出は、48時間で約60%でした。個々のmy細胞からのEVR放出とDDMは、それぞれ60%と50%でした。ここでは、個々の細胞とDDMからの50%の薬物放出に必要な時間と、適合データの良さを示します。
EVRの個々の、私の細胞を除くすべての私の細胞のための曲線フィッティングの良さは、私の細胞は0.950以上であり、これは一次放出の仮定が個々の私の細胞とDDMからの薬物放出を説明するための良い近似であることを意味します一度習得すると、これらの技術は、数時間から数週間で私の細胞として薬物やポリマーのライブラリで日常的に行うことができます。この手順に参加する際には、これらの手順に従って細胞培養または動物モデルにアクセスする前に、my細胞を完全に特性評価することを覚えておくことが重要です。リポソーム送達システムのような他の送達システムも、治療の有効性における薬物送達システムの役割についての質問に答えるために評価または特徴付けることができます。
このビデオを見た後、疾患で細胞を評価する前に、薬物ローディングの調製方法と特性評価の方法を十分に理解しているはずです。関心のある状態。
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概要
本プロトコルでは、溶媒キャスト法を用いた薬剤担持my cellsの調製および特性評価について概説します。本研究では、さまざまな疾患状態において効果的な薬剤送達を実現するための、my cellsの再現性と安定性を重視しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- ドラッグデリバリーシステム
- 薬学
- バイオテクノロジー
背景
- 薬物の溶解性は、ドラッグデリバリーにおける極めて重要な因子です。
- ミセルシステムは、難水溶性薬物の溶解性を向上させることができます。
- 薬物封入システムの特性評価は、その有効性を評価するために不可欠です。
- 薬物封入の再現性は、臨床応用において極めて重要です。
研究目的
- 薬物送達用細胞を調製し、その特性を評価する。
- 薬物を搭載した細胞の安定性とサイズを評価する。
- 細胞による薬物のin vitro放出特性を評価する。
使用した方法
- 細胞調製のための溶媒キャスト法。
- 細胞の封入安定性とサイズの評価。
- 細胞からの薬物放出速度の測定。
- 細胞のin vivo安定性の評価。
主な結果
- 安定した細胞を再現性高く作製できる。
- 細胞において効果的な薬剤の充填および保持が確認された。
- in vitroでの放出特性が、さらなる研究に適している。
- 従来の方策と比較して、この手法は時間が短縮される。
結論
- 再現性高く作製された筋細胞は、薬剤輸送のための実行可能なプラットフォームを提供します。
- 本研究では、薬剤を封入した筋細胞を調製するための信頼性の高い手法を提示します。
- 今後の応用として、本手法を用いてさまざまな疾患状態を探索することが可能です。
よくある質問
産業上の実用的意義
本プロトコルは、疎水性薬剤を可溶化するための高分子ミセルの再現性のある調製および特性解析を可能にし、初期段階の製剤開発における主要なボトルネックを解消します。薬剤の封入量、安定性、サイズ、および放出キネティクスを評価するための標準化された手法を提供することで、前臨床候補化合物の選択における予測的な信頼性を向上させます。このアプローチは、コストのかかるin vivo試験に投資する前に製剤の変動に伴うリスクを低減し、開発の継続可否（go/no-go）の判断を容易にします。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ドセタキセルやエベロリムスのような難水溶性化合物の製剤化を可能にし、ターゲットエンゲージメント研究への適用を実現する。
- 運用の価値： ソルベントキャスティング法により、迅速かつ再現性のあるミセル生成が可能となり、薬物担持量はDTXで最大1.86 mg/mL、EVRで最大1.85 mg/mLに達する。
- 予測的価値： 高い薬物保持率（48hで97%超）により、後続の有効性評価アッセイにおいて信頼性の高い投与が可能となる。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： PDI <0.2、粒子径 50 nm 未満のミセルは、ハイスループットスクリーニングにおける均一な薬物配送を保証します。
- 運用の価値： 動的光散乱法により、バッチ間の整合性を確認するための迅速なサイズ検証が可能です。
- アッセイの準備状況： シンク条件下（pH 7.4, 37°C）での透析法による放出プロファイリングにより、SAR解析のための定量的な拡散駆動放出データが得られます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：一次放出速度論（適合度 >0.95）によりin vivoでの挙動が予測され、用量外挿が支持されます。
- 前臨床段階のリスク低減：安定性と放出特性の評価により、薬物動態試験に向けた製剤選択の根拠が得られます。
- 疾患関連システム：プラットフォームの適応性が高いため、ミセルの性能が検証されれば、さまざまな疾患モデルでのスクリーニングが可能です。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ヒット化合物の検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、製剤化によって不溶性化合物の生物学的評価が可能になります。
- 探索生物学：溶媒キャスト法を用いることでミセルの迅速な調製が可能となり、製剤上の制限による偽陰性を排除して標的仮説を検証できます。
- スクリーニング：標準化されたサイズ（<50 nm）と低い多分散性は、細胞ベースのアッセイにおける再現性のある化合物デリバリーをサポートします。
- 分析：HPLCベースの封入量および放出量の測定により、製剤比較のための重要な品質特性が得られます。
- トランスレーショナルリサーチ：予測可能な放出プロファイルにより、前臨床モデルにおける薬物動態学的期待値との整合が可能になります。
- 企業での再利用：本プロトコルはポリマーや薬剤の種類に依存しないため、複数のプロジェクトや治療領域にわたって適用可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：拡散制御放出モデリングによるメカニズム的なリスク低減により、in vivoでの性能予測が向上します。
- 運用的価値：ソルベントキャスト法は、平衡負荷法に比べて調製時間を短縮し、ライブラリースクリーニングのスループットを向上させます。
- 戦略的価値：再現性のある負荷量と粒子径により、処方に起因する変動が抑制され、ターゲット検証におけるデータ品質が向上します。
- ポートフォリオへの影響：安定かつ放出可能な処方を早期に特定することで、リスク調整に基づいた候補薬の推進が可能になります。
実施上の検討事項
- 高分子化学、溶媒操作、およびHPLC分析の専門知識が必要です。
- エバポレーター、遠心分離機、動的光散乱装置、および透析セットアップが必要です。
- チーム間での標準化には、一貫した溶媒キャストパラメータと水和温度（50°C）が必要です。
- 他のポリマーや薬剤に適応させるには、溶媒比率と膜厚の再最適化が必要となります。
- 実用的制限：本手法はアセトニトリル中での薬剤の安定性を前提としており、溶媒蒸発中の潜在的な分解については考慮されていません。
バイオ医薬品に関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
1:42
Preparation of Individual and Multi-drug Loaded Micelles by Solvent Casting Method
2:56
Assessment of Drug Loading and Stability in Micelles Using Reverse-phase High Performance Liquid Chromatography
3:52
Assessment of Micelle Particle Size by Dynamic Light Scattering
4:29
Assessment of In Vitro Drug Release from Individual Micelles and Dual Drug Micelles
5:21
Results: Preparation and Characterization of Poorly Water Soluble Drugs in Micelles
6:29
Conclusion
