光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化
2014年2月18日
ここでは、下流の調節エレメント拮抗モジュレータ、マイクロ秒およびミリ秒ダイナミクスおよびニューロンカルシウムセンサーへのカルシウムアソシエーションに関連付けられている構造変化のエネルギー論をモニターするために、DM-nitrophen、ケージドカルシウム化合物と組み合わせて光熱ビーム偏向技術の適用を報告。
次の実験の全体的な目標は、カルシウムトランスデューサーへのリガンド結合に関連する確認変化をサブミリ秒の時間スケールで特徴付けることです。APOタンパク質からカルシウム結合タンパク質への確認的な移行は、ケージに入れられたカルシウム化合物カルシウムDMニトロの光切断によって引き起こされ、遊離カルシウムの光放出につながります。反射率の関連する変化は、4重位置感度検出器を使用してプローブビームの変位として測定されます。
次に、光熱ビームの偏向トレースを、サンプルとリファレンスの両方の温度の関数として測定します。フォトビームの偏向トレースの化合物解析により、カルシウムによる反応量やエンタルピー変化の確認スイッチのメカニズムを解明することができます。トップフローなどの既存のマストに対する光熱ビームの偏向の主な利点は、この技術により、サブミリ秒のタイムスケールで体積とエントロピーの変化を同時に検出できることです。
この手法の視覚的なデモンストレーションは、機器の正確な位置合わせが熱力学的パラメータの回復に重要であるため、必要です。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるウォルター・ゴンザレスで、 サンプル調製とすべてのサンプル操作を暗室で行い、不要なアンケージングを防ぎます。このビデオでは、撮影目的で光の中で手順を示しています。
DM Nitro を 50 ミリモル ヒープで 100 ミリモル塩化カリウム (pH 7.0) のバッファーに溶溶化し、最終濃度 400 マイクロモルにします。0.1モルストック溶液から塩化カルシウムを添加して、望ましいカルシウムとDNのニトロ濃度比を達成します。次に、参照化合物のシアン化カリウムまたはクロム酸ナトリウムを同じバッファーに可溶化します。
サンプルについては、光熱ビーム偏向の基本的な実験構成の概略図については、テキストプロトコルを参照してください。実験を設定するときは、温度制御されたセルホルダーに配置した細胞の中心にprobビームを伝播します。次に、ピンホールを使用してプローブビームの直径を1ミリメートルに調整し、サンプルの後ろにある2番目のミラーを使用して、位置感知検出器の中心にプロブビームを配置します。
プロビームを検出器の中心に集束させて、上部の2つのダイオードと下部の2つのダイオード間の電圧の差、および検出器の左側と右側の2つのダイオード間の電圧の差がゼロになるようにします。続いて、ND YAGレーザーの355ナノメートル出力であるポンプビームの直径を成形します。2 355ナノメートルのレーザーミラーの間に配置された3ミリメートルのピンホールを使用して、ポンプビームを獣医の中心に共伝播します。
両方のレーザービームが、ほぼ共線状に光学セルの中心を伝搬することが重要です。測定可能な偏向角、つまり光熱ビームの偏向またはPBD信号の高振幅を得るには、リファレンスコンパウンドを使用してプローブとポンプビームを位置合わせし、良好な信号対雑音比とより長い時間スケールでの安定したPBD振幅を特徴とする満足のいくPBD信号を実現します。次に、355ナノメートルのレーザーミラーを段階的に調整することにより、プローブビームに対してポンプビームを配置します。
PBDリファレンス信号の振幅を、位置感度検出器上の2つの上部と下部のフォトダイオード間の差として測定します。PBD信号は、高速の時間スケールで振幅の急速な増加を示し、100ミリ秒の時間スケールで安定した状態を維持する必要があります。PBD信号の励起レーザー出力とアインシュタインの吸収数に対する線形依存性を測定することにより、放出された熱エネルギーに対するPBD信号振幅の線形性を確認します。
レーザー出力を約1000マイクロジュール未満に保ち、多光子の吸収を防ぎます。また、サンプルや参照化合物の吸光度を励起波長0.5未満に保つことで、励起ビーム出力の低下を防ぎます。これらの手順により、PBD信号の直線性が確保されます。
PBDトレースの測定から始めます。参照のために、参照化合物の溶液を石英セルに入れ、セルを温度制御されたホルダーに配置します。リファレンスPBD信号を、摂氏16度から35度の温度範囲の温度の関数として検出し、温度は摂氏3度刻みで検出します。
温度が変化するたびに。位置感知検出器のプロブビームの位置を確認し、検出器の中心に位置を再調整します。必要に応じて、テキスト プロトコルで説明されているように、PBD 信号の直線性を確認します。
次に、リファレンス測定用の光学セルと同じ向きを維持しながら、リファレンス化合物に使用したのと同じ光学セルにサンプル溶液を置きます。リファレンスと同じ温度範囲でサンプルPBDトレースを検出し、サンプルPBD振幅の直線性を確認します。基準 PBD 信号の振幅を、プリ トリガーとポスト トリガー PBD 信号の差とします。
同様に、サンプル PBD 信号の高速位相と低速位相の振幅を決定します。測定器の応答パラメータをなくすには、サンプルPBD信号の振幅をPBD信号の振幅でスケーリングします。参考までに、サンプル信号と基準信号の比は、溶液への熱放出と光開始反応に関連する非熱体積変化を、振幅比にエネルギーを掛けた温度依存項のプロットの傾きと切片から決定できる方程式を与え、高速および低速プロセススケールの反応体積とエンタルピー変化を決定します。 観測された体積とエンタルピーは、適切な量子収率に変化します。
テキストプロトコルに見られる方程式に従って、個々のステップの振幅と寿命は、体積とエンタルピーの変化を記述する時間依存関数にデータを適合させることによって分析されます。高速ステップの振幅は、サンプル PBD 信号のプロンプト位相の振幅に対応し、後続のステップの振幅は、サンプル PBD 信号の低速位相の振幅に対応します。個々のプロセスごとに、個々のプロセスの速度定数の温度依存性から、IRプロットを使用して活性化エンタルピーおよびエントロピーパラメータを容易に決定できます。
カルシウムDMニトロからのカルシウム光放出のPBDトレースの代表例を以下に示します。速い段階はカルシウムDMニトロの光の切断とカルシウムの解放に対応し、遅い段階は非光化ケージへのカルシウム結合を反映しています。カルシウム光解離時のニューロンカルシウムセンサー下流の調節要素アンタゴニスト、レギュレーター、または夢のC末端ドメインへのカルシウム結合のPBDトレースをここに示します。
写真放出された配位子は、観測された速度定数の温度依存性から、摂氏20度で時定数が1.3プラスマイナス0.3ミリ秒の夢のC末端ドメインに会合します。夢のC末端ドメインへのカルシウム結合の活性化障壁は、1モルあたり9.2±0.4キロカロリーであると決定されました。この手順を試行する際には、リファレンスと同じ条件下でサンプルPBDトレースを測定することを忘れないでください。
このビデオを見れば、サンプルの調製方法、装置の整列方法、データの分析方法など、再現性のある熱力学パラメータを得る方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究では、光熱ビーム偏向技術とケージ付きカルシウム化合物DM-ニトロフェンを使用して、神経細胞カルシウムセンサーの構造変化のダイナミクスを調査します。焦点は、カルシウム結合イベントのマイクロ秒からミリ秒の時間スケールにあります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 構造生物学
背景
- カルシウム伝達物質は神経シグナリングにおいて重要な役割を果たします。
- 構造変化を理解することは、カルシウムシグナリングメカニズムを解明する上で不可欠です。
- 光熱ビーム偏向は、これらの急速なダイナミクスを研究するための新しいアプローチを提供します。
- DM-ニトロフェンは、制御されたカルシウム放出を可能にするケージ付きカルシウム化合物です。
研究目的
- リガンド結合に伴うカルシウム伝達物質の構造変化を特徴付けること。
- これらの変化のダイナミクスをサブミリ秒の時間スケールで測定すること。
- カルシウム結合中の反応体積とエンタルピー変化を分析すること。
使用した方法
- 光熱ビーム偏向技術の適用。
- 遊離カルシウムの光放出のためのDM-ニトロフェンの使用。
- プローブビームの変位として反射率の変化を測定すること。
- 温度に応じた光熱ビーム偏向トレースを分析すること。
主要な結果
- APOとカルシウム結合タンパク質間の構造転移の成功的な測定。
- カルシウム誘導構造転換のメカニズムへの洞察。
- 体積とエントロピー変化の同時検出の実証。
- 従来の方法に対する光熱ビーム偏向の利点が強調されています。
結論
- この研究は、カルシウムシグナリングのダイナミクスをより深く理解する機会を提供します。
- 光熱ビーム偏向は、急速な分子変化を研究するための貴重なツールです。
- 今後の研究は、これらの知見を基に他のカルシウム関連プロセスを探索することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Photothermal beam deflection enables direct, label-free quantification of submillisecond conformational changes in proteins, providing unique insight into rapid ligand-induced structural transitions. This capability addresses a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking, especially for targets lacking intrinsic chromophores or fluorophores. The method enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions by delivering quantitative thermodynamic parameters inaccessible to traditional techniques.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of ligand-induced conformational changes on microsecond to millisecond timescales.
- Quantifies reaction volume and enthalpy changes, supporting mechanistic de-risking of target engagement.
- Facilitates functional validation of protein targets without the need for extrinsic labels.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of protein conformational dynamics for assay development.
- Supports reproducibility and standardization by enabling simultaneous detection of volume and enthalpy changes.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows, even for non-fluorescent targets.
- Enables reliable evaluation of compound-induced structural effects in early screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein function for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying activation barriers and kinetic parameters relevant to preclinical models.
- Provides mechanistic data to inform biomarker strategies when supported by target biology.
Pipeline & Workflow Integration
Photothermal beam deflection integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies, particularly where rapid conformational dynamics are critical decision points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying fast structural transitions and thermodynamic parameters.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of reaction kinetics, volume, and enthalpy changes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by aligning kinetic and thermodynamic data with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform for diverse protein targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability across protein systems.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing early, quantitative biophysical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with robust mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photothermal instrumentation alignment and data analysis.
- Demands precise temperature control and optical setup for reproducible measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and reference calibration.
- Adaptable to proteins lacking chromophores or fluorophores, broadening applicability.
- Instrument sensitivity and alignment are critical for accurate thermodynamic parameter recovery.
