光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

本実験の全体的な目的は、カルシウム・トランスデューサーへのリガンド結合に伴う構造変化をサブミリ秒の時間スケールで特性解析することです。APOタンパク質からカルシウム結合タンパク質への構造転移は、ケージドカルシウム化合物であるcalcium DM nitroの光分解によって誘発され、これにより遊離カルシウムが光放出されます。それに伴う屈折率の変化を、4分画位置検出器を用いたプローブ光の変位として測定します。

次に、試料と参照体の両方について、温度の関数として光熱ビーム偏向トレースを測定します。光ビーム偏向トレースの複合解析により、反応体積およびエンタルピー変化の観点から、カルシウム誘導による構造変化のメカニズムに関する知見が得られます。既存の手法（トップフローなど）に対する光熱ビーム偏向法の主な利点は、この手法により、サブミリ秒の時間スケールで体積変化とエントロピー変化を同時に検出できることです。

機器の正確なアライメントが熱力学パラメータの回収に極めて重要であるため、本手法の視覚的な実演が必要となります。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるWalter Gonzalezが行います。不要なアンケイジングを防ぐため、試料調製およびすべての試料操作は暗室で実施してください。なお、本ビデオでは撮影上の都合により、各ステップを明所で実演しています。

まず、DM Nitroを50 millimolar HEPESバッファー、100 millimolar 塩化カリウム（pH 7.0）に溶解し、最終濃度を400 micromolarにします。次に、0.1 molarのストック溶液から塩化カルシウムを加え、目的のカルシウム対DN nitro濃度比にします。続いて、参照化合物であるシアン化カリウムまたはクロム酸ナトリウムを同じバッファーに溶解させます。

試料については、光熱ビーム偏向法の基本的な実験構成の概略図として、テキストプロトコルを参照してください。実験をセットアップする際は、温度制御機能付きセルホルダーに設置したセルの中心にプローブビームを通過させます。次に、ピンホールを用いてプローブビームの直径を1 mmに調整し、試料の後方に配置した2枚目のミラーを使用して、プローブビームを位置感応検出器の中心に合わせます。

プローブビームを検出器の中心に合わせ、上部2つのダイオードと下部2つのダイオードの間の電圧差、および検出器の左右にある2つのダイオード間の電圧差がゼロになるようにします。続いて、ND YAGレーザーの355 nm出力であるポンプビームの直径を調整します。2枚の355 nmレーザーミラーの間に配置した3 mmのピンホールを用いて、ポンプビームをveteの中心に共伝搬させます。

2本のレーザービームが、光学セルの中心をほぼ同心円状に伝播させることが重要です。測定可能な偏向角を得て、光熱ビーム偏向（PBD）信号の高振幅を実現するために、参照化合物を基にプローブビームとポンプビームを調整し、良好な信号対雑音比（S/N比）と、長時間の時間スケールで安定したPBD振幅を持つ十分なPBD信号を得られるようにします。その後、355 nmレーザーミラーを段階的に調整し、プローブビームに対するポンプビームの位置を決定します。

ポジションセンシティブ検出器の上下2つのフォトダイオードの差分として、PBD参照信号の振幅を測定します。PBD信号は、短時間で振幅が急激に増加し、100ミリ秒のタイムスケールで安定して推移する必要があります。励起レーザー出力および吸収されたアインシュタイン数に対するPBD信号の線形依存性を測定することで、放出熱エネルギーに対するPBD信号振幅の線形性を確認してください。

多光子吸収を防ぐため、レーザーパワーを約1000 µJ以下に維持してください。また、ポンプ光のパワー低下を防ぐため、励起波長におけるサンプルまたは参照化合物の吸光度を0.5未満に抑えてください。これらの手順により、PBD信号の線形性が確保されます。

まず、PBDトレースの測定を開始します。参照用として、参照化合物の溶液を石英セルに入れ、そのセルを温度制御ホルダーに設置します。16から35 °Cの温度範囲において、3 °C刻みの温度増分で、温度の関数として参照PBD信号を検出します。

温度を変化させるたびに、位置感応検出器上のプローブビームの位置を確認し、検出器の中心に再調整してください。必要に応じて、テキストプロトコルに記載されている手順に従い、PBD信号の線形性を確認してください。

次に、リファレンス化合物の測定で使用したものと同じ光学セルに試料溶液を入れ、リファレンス測定時と同じ方向でセルを配置します。リファレンスと同様の温度範囲で試料のPBDトレースを検出させ、試料のPBD振幅の直線性を確認します。プリトリガーとポストトリガーのPBD信号の差を、リファレンスPBD信号の振幅として算出します。

同様の方法で、サンプルのPBD信号の速い相と遅い相の振幅を決定します。装置の応答パラメータを排除するため、サンプルのPBD信号の振幅をPBD信号の振幅でスケールします。リファレンスについて、サンプル信号とリファレンス信号の比から得られる式を用い、振幅比にエネルギーを乗じた値と温度依存項のプロットの傾きおよび切片から、光開始反応に伴う溶液への熱放出および非熱的体積変化を決定できます。速いプロセスと遅いプロセスの反応体積およびエンタルピー変化を決定するため、観測された体積変化およびエンタルピー変化を適切な量子収率でスケールします。

テキストプロトコルにある数式に基づき、個々のステップの振幅と寿命は、体積およびエンタルピー変化を記述する時間依存関数にデータをフィッティングさせることで解析されます。高速ステップの振幅はサンプルPBD信号のプロンプト相の振幅に対応し、その後のステップの振幅はサンプルPBD信号のスロー相の振幅に対応します。個々のプロセスの速度定数の温度依存性から、IRプロットを用いてそれぞれの活性化エンタルピーおよびエントロピーパラメータを容易に決定することができます。

calcium DM nitroからのカルシウム光放出におけるPBDトレースの代表例をここに示します。速い相はcalcium DM nitroの光分解とカルシウムの遊離に対応し、遅い相は光分解されていないケージへのカルシウム結合を反映しています。カルシウムの光解離に伴う、神経系カルシウムセンサーであるdownstream regulatory element antagonist, regulator, or dreamのC末端ドメインへのカルシウム結合のPBDトレースをここに示します。

観察された速度定数の温度依存性から、光放出リガンドは20 °Cにおいて1.3 ± 0.3 msの時定数でdreamのC末端ドメインに結合することが分かりました。dreamのC末端ドメインへのカルシウム結合の活性化障壁は9.2 ± 0.4 kcal/molと決定されました。この手順を行う際は、リファレンス（参照試料）と同一の条件下で試料のPBDトレースを測定することが重要です。

このビデオを視聴することで、再現性のある熱力学的パラメータを得るためのサンプル調製、装置の調整、およびデータ解析の方法について十分に理解することができます。