蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴
January 25th, 2020
マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。
せん断流下の単一生体分子の立体構造変化を定量化することは、タンパク質やDNAのような高分子の機能や生物物理学を理解するのに役立ちます。蛍光顕微鏡は、高い時間的および空間分解能を有する生理的な流れ環境における単一分子のリアルタイムのイン・ザ・ビジュアライゼーションを可能にする。これは、AFM のような他の手法とは比類のないものです。
タンパク質のDNAが世界的な立体構造変化を有するせん断力を特徴付けることによって、これらの生物物理学的特性を模倣する薬物をより良く設計することができます。このプロトコルは、様々な流れの条件での挙動または他のポリマー、特にバイオポリマーを研究し、複雑な流体のレロロジーを調査するために広く適用することができます。ステップのタイミングは成功に不可欠です。
マイクロ流体デバイス表面処理や蛍光顕微鏡のステップを何度も実践して、効率的に実行することを提案します。生体分子の立体構造変化を捉えるのが、フィルムで最もよく見られる視覚的で動的な現象です。科学者は、このビデオで紹介されたリアルタイムタンパク質とDNA顕微鏡を見た後、この方法をよりよく理解するでしょう。
マイクロ流体装置を準備するには、シリコーンエラストマーベースの5つの部分を計量ボートの1部硬化剤に加えます。そして、十分に硬化PDMS溶液を作成するために1分間完全に攪拌します。マスターシリコンウエハーをプラスチックペトリ皿に入れ、PDMS溶液をウエハーに注ぎ、5ミリメートルの層を作ります。
皿を覆い、空気泡を取り除くために1時間真空下のデシケーターに残します。その後、一晩摂氏60度で覆われたペトリ皿をインキュベートしてPDMSを柔軟な固体に治し、PDMSウエハーインターフェースでマイクロ流体チャネルをPDMSに成形します。翌日、カミソリを使用してPDMSの各マイクロ流体チャネルの周りに20を10ミリメートルの長方形でカットし、ピンセット付きの長方形ブロックを取り除きます。
25ゲージの鈍い端針を使用して、鋭利なエッジを使用して、チャネルの一端に直径0.5ミリメートルの穴を開け、穴がPDMSブロックを完全に通過することを確認します。穴からPDMSをパンチアウトし、チャネルの反対側でプロセスを繰り返すために細い針を使用してください。PDMSブロックをチャネル側を上にしてカバースリップをプラズマボンディングマシンのチャンバーに入れ、処理を開始します。
治療が完了したら、すぐにカバースリップにPDMSブロックを置き、チャネルがスリップに接触するようにします。ブロックの端に圧力をかけ、その後、115°CのホットプレートにカバースリップPDMSアセンブリを15分間置き、永久結合を補強します。最後に、長さ10センチメートルを挿入します。
PDMSブロックの上部にある出口穴に0.25ミリメートルの内径チューブは、流体が容易に流路から流れ出るようにします。フォン・ウィレブラント因子またはVWF実験では、無菌1X PBSに溶解した1ミリリットル当たり10マイクログラムの最大10マイクロリットルをマイクロ流体デバイスの入口に注入する。注射後に数マイクロリットルのBSA-ビオチンをピペットチップに差し込み、チップを入口に埋め込んだままにします。
BSA-ビオチンがデバイス内で2時間インキュベートすることを許可し、その結果、BSAはカバースリップ表面に非特異的に結合します。その後、ピペットチップを取り出し、最大10マイクロリットルのカゼインブロッキング溶液をチャネルに注入します。カゼイン溶液を30分間インキュベートして、自由な部位をブロックし、生体分子の表面への非特異的結合を低減できるようにします。
先端を取り除き、無菌PBS中のストレプトアビジンを最大10マイクロリットルのストレプトアビジンをチャネルに注入し、BSA-ビオチンのビオチン群に結合する。次に、最大10マイクロリットルの洗剤溶液を注入して、過剰なストレプトアビジンを洗い流します。先端を取り外し、ケースイン溶液またはラムダDNAにVWFのいずれかを注入する。
VWFを3分間、またはラムダDNAを45分間インキュベートする。その後、5ミリモルフリービオチンを注入して、過剰なストレプトアビジン結合部位をブロックする。1ミリリットルのカゼインブロッキング溶液を注射器にロードし、シリンジポンプで固定します。
次に、チューブの一端をシリンジ針に取り付け、溶液中を流れ、気泡を取り除きます。遊離ビオチン注入後約3分は、マイクロ流体装置の入口にチューブの他端を取り付ける。TIRFまたは共焦点蛍光顕微鏡の最高倍率目標を選択します。
必要に応じて、目的に浸漬油の滴を追加します。マイクロ流体装置を顕微鏡ステージに置き、カバースリップが目的に合ってフラッシュされるようにします。明視野顕微鏡を開始し、破片や気泡などの特徴が見えるように焦点を調整します。
次に、マイクロ流体チャネルのエッジが可視になるまで X 方向と Y 方向のステージを調整し、フレームを二分します。FITCチャネルに切り替え、個々の緑色球状分子が区別されるまで、必要に応じてZレベルとTIRF角度を調整します。レーザー強度と露出時間を調整して、蛍光分子をあまりにも速く光漂白することなく視覚化します。
その後、分子をよりよく視覚化するためにコントラストを調整します。注射器ポンプからの遊離ビオチン注入開始と停止流のちょうど5分後に、1時間当たり5000〜30,000マイクロリットルの流量を用いて分子立体構造の変化を観察する。VWFでは、10,000マイクロリットル/時間の流れの30秒のような少量の流量を、無料のビオチン注入のちょうど5分後に適用することが重要である。
マイクロ流体デバイスの様々な領域にわたってこれを繰り返し、開始および停止流の複数のサイクルで拡張し、リラックスできる分子を見つけます。分子が最大の伸長に達し、剪断流下の分子の連続的な行動の完全なリラクゼーションと記録ビデオにかかる時間に注意してください。変化の確認に対する分子の柔軟性は、流れの増加に伴って高い剪断速度が適用されるにつれて、その長さを長くする能力によってしばしば実証される。
フォン・ヴィルブランド因子分子の伸長対せん断速度曲線は、タンパク質の生体力学的特性を特徴付ける上で有用である。ラムダDNAの蛍光顕微鏡画像は、同様に、30秒でより高い剪断速度での増加延長および流れが停止した2分間にわたって緩やかな緩和を示す。VWFで作業する場合は、3分間だけインキュベートし、5分間無料のビオチンを流れ始める前に必ずインキュベートしてください。
これは、可逆的な解明に必要な最適な数またはビオチンストレプトアビジン結合を形成するために重要です。この方法は、複数の生体分子間のリアルタイム相互作用を可視化し、その機能を特徴付けるために適応することができる。例えば、高剪断下でのVWFの解明と、この方法での血小板接着分子GPIb-αとの結合を視覚化することで、血小板プラグ形成をよりよく理解することができた。
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概要
このプロトコルは、シアーフロー下でのコンホメーション変化を定量化するために、マイクロ流体デバイス内で単一の巨大分子を固定することの詳細を示しています。これは特にタンパク質とDNAの生物力学的特性を研究するのに有用です。
主要な研究要素
科学の分野
- 生物物理学
- 生化学
- マイクロ流体工学
背景
- 生体分子のコンホメーション変化を理解することは、薬物設計にとって重要です。
- 蛍光顕微鏡は単一分子の高解像度な可視化を提供します。
- シアーフロー条件は生体分子の挙動に大きな影響を与える可能性があります。
- このプロトコルは、異なるフロー環境での様々なポリマーに適用できます。
研究の目的
- タンパク質とDNAの生物力学的特性を特性化すること。
- シアー力が生体分子のコンホメーションに与える影響を調査すること。
- 生体分子の物理化学的特性を模倣する薬物の設計を強化すること。
使用した方法
- マイクロ流体デバイス内での単一巨大分子の固定。
- 可視化のためのリアルタイム蛍光顕微鏡。
- 制御されたシアーフロー下でのコンホメーション変化の定量化。
- 複雑な流体のレオロジー特性の分析。
主な結果
- 単一生体分子の成功した固定と可視化。
- シアーフロー下でのコンホメーション変化に関する定量データ。
- タンパク質とDNAの生物物理学的挙動への洞察。
- 薬物設計とポリマー研究における潜在的な応用。
結論
- このプロトコルは、生体分子のダイナミクスを研究するための信頼できる方法を提供します。
- 薬物開発と材料科学の研究への道を開きます。
- 将来の研究では、この技術の他の生体分子への応用を拡大できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables real-time visualization of single-molecule conformational dynamics under controlled shear flow, providing direct insight into biomechanical properties of proteins and DNA. Such data supports target validation by linking molecular behavior to physiological function, particularly in hemostasis and thrombosis. The approach enhances predictive confidence in early discovery by de-risking mechanistic hypotheses through quantitative, reproducible readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating shear-induced conformational changes with functional states of von Willebrand factor.
- Operational Value: Provides a standardized platform for assessing target engagement under physiologically relevant mechanical forces.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate biomechanical properties of disease-relevant targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time readouts of molecular extension and relaxation kinetics under defined shear rates.
- Operational Value: Enables assay standardization through immobilized single-molecule arrays in microfluidic channels with controlled flow profiles.
- Scalability: Supports parallelization across multiple channel regions for increased throughput in lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by modeling hemodynamic conditions relevant to vascular pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships of biomolecules under force, reducing ambiguity in target validation.
- Disease-Relevant System: Uses von Willebrand factor as a model to study shear-dependent activation in thrombosis and platelet plug formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where biomechanical profiling informs compound selection and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing how shear flow alters conformational ensembles of single biomolecules.
- Screening: Delivers assay-ready systems with reproducible immobilization and real-time fluorescence readouts under variable flow.
- Analytics: Outputs extension versus shear rate curves and relaxation kinetics that enable quantitative comparison across molecular variants or conditions.
- Translational Research: Connects single-molecule behavior to pathophysiological processes like platelet adhesion under high shear.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular microfluidic-florescence platform applicable to diverse biopolymers and complex fluid systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly observing conformational changes rather than inferring them from indirect measurements.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized surface passivation, biotin-streptavidin immobilization, and flow control protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing biophysical efficacy markers orthogonal to binding affinity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying molecules that preserve or modulate native biomechanical function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, surface chemistry, and fluorescence microscopy alignment.
- Depends on access to TIRF or confocal microscopes with stable laser excitation and environmental control.
- Necessitates standardization of shear flow rates via syringe pump calibration and channel geometry verification.
- Involves optimization of incubation times and blocking steps to minimize nonspecific binding while preserving specific biotin-streptavidin linkages.
- Limited by photobleaching at high laser intensities, requiring careful adjustment of exposure and contrast settings for longitudinal imaging.
