Name: 蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶせん断流下でタンパク質やDNAなどの単分子の立体構造変化を蛍光顕微鏡で可視化・定量化する手法。創薬や複雑流体のレオロジー研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立科学財団助成金DMS-1463234、国立衛生研究所助成金HL082808とAI133634、リーハイ大学の内部資金によって部分的にサポートされました。

1. VWF の準備
<ol><li>ヒトプラズマVWFを再構成し、標識反応のためにそれを調製する。100 μLの脱イオン(DI)水を100μgの凍結乾燥VWFに加え、1mg/mL VWFストック溶液を作成します。</li>
	<li>ダイアレーズVWFストック溶液は、過剰グリシンを除去するために、ビオチンおよびフルオロフォア標識効率を高める。<ol>
<li>VWFストック液50μLを0.1mL透析ユニットに移し、10,000個の分子量カットオフを行い、キャップで密閉します。残りのストック液を-20 °Cに保存します。VWFの在庫は-20 °Cで最大1年間安定します。</li>
		<li>1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の500mLで透析を実行し(0.01Mリン酸二ナトリウム、リン酸一酸化カリウム、0.0027M塩化カリウム、0.137M塩化ナトリウム、25°CでpH 7.4 at 25°C)を1時間遅く攪拌します。500 mLの新鮮なPBSを使用して、さらに1時間透析を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ビオチン標識反応を開始します。反応の直前にDI水に固体を溶解することにより、NHS-PEG4-ビオチンの2mM溶液を調製する。NHS-PEG4-ビオチンが長期間水中にとどまることを可能にすると、NHSエステル群は加水分解し、それによって標識効率が低下する。<ol>
<li>VWFストック溶液を含む透析ユニットに2mM NHS-PEG4-ビオチンの2.5 μLを加えます。これにより、VWFモノマーと比較して20倍のモル超過のビオチンが得られます。VWFの一次アミンはNHSエステル基と反応し、それによってアミド結合を介してPEG4-ビオチン基に共有結合する。</li>
		<li>透析ユニットを1.5mLマイクロ遠心チューブの内側に入れてください。透析ユニットを対応するキャップで密封します。パラフィルムでチューブ透析アセンブリを固定します。直立して、室温で40分間放置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光素標識反応を開始します。アレクサ488テトラフルオロフェニルエステル(TFPエステル)蛍光色素(励起最高度=498nm、発光最大=519nm)の2.8mM溶液をDI水中にフルオロフォア固体を溶解して調製する。反応の直前にこれを行い、TFP-エステル基が加水分解するのを防ぎます。<ol>
<li>透析装置に2.8 mM 488フルオロフォアの2.9μLを加えます。これにより、VWFモノマーと比較して34倍のモル超過の蛍光色素が得られます。VWFの残りの一次アミンはTFPエステル基と反応し、それによってアミド結合を介して蛍光体に共有結合する。</li>
		<li>透析ユニットに1M重炭酸ナトリウム(DI水に溶解)の2.0μLを加えます。これは、8.0に近い反応のpHを調整します, これは、TFPエステルと一次アミン反応の効率を増加させます.</li>
		<li>透析ユニットは、ステップ 1.3.2 と同様にマイクロ遠心チューブに固定します。暗い所に保管して、光の漂白を防ぎ、室温で1時間30分放置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>透析ユニットを1x滅菌PBSの900mLに入れ、4°Cで一晩透析します。これは、0.71 mg/mLまたは2.84 μM(モノマー濃度)の濃度で標識されたVWFの約70 μLを生成します。</li>
	<li>標識されたVWFをマイクロ遠心管に移す。チューブをアルミ箔で覆い、光から保護します。4°Cで保管してください。長期保存の場合、0.02%(w/v)の最終濃度に抗菌剤アジドナトリウムを加えます。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。</li>
</ol>2. ラムダDNAの準備
<ol><li>ビオチエン酸リニアラムダDNAは、その凝集末端部位(cos部位)を標準プロトコルに従ってビオチン-14-dCTPヌクレオチドで充填することにより、ここでステップ2.118で繰り返される。残りのcos部位にdATP、dTTPおよびdGTPヌクレオチドを記入する。<ol>
<li>dATP、dTTP、dGTPおよびビオチン-14-dCTPの1mM溶液を10x反応バッファー(500mM塩化ナトリウム、100mMトリス塩酸塩、100mM塩化マグネシウム、10mMジチオトレイトール、25°CでpH 7.9)で調製する。</li>
		<li>48 μL の 500 ng/μL ラムダ DNA を PCR チューブに入れ、65 °C で 5 分間加熱します。円形ラムダDNAのcos部位は熱の下で分離し、分子を直線化し、ビオチン化の準備ができている一本鎖の突出を作る。直後に氷の上に置き、コスサイトが再アニールするのを防ぎます。</li>
		<li>ラムダDNAに1mM dATP、dTTPおよびdGTPの5μLおよび1mMビオチン-14-dCTPの4 μLを加える。また、DNA合成を触媒するために、5 U/μLクレノウフラグメント(3'à5'exo-)の2.5μLを加えます。</li>
		<li>37°Cで1時間反応混合物をインキュベートする。</li>
		<li>0.5 M EDTA の 1.2 μL を追加します。次いで、70°Cで5分間反応混合物を加熱する。これはクレノウフラグメントとビオチン化反応を非アクティブ化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラムダDNAから過剰なヌクレオチドを除去するには、10~70μLを保持でき、分子量6,000個のカットオフを有するスピンカラムを使用します。<ol>
<li>柱を2mLマイクロ遠心チューブの内側に置きます。柱とチューブを1000 x gで2分間遠心分離します。</li>
		<li>ステップ 2.1.1 から同じ反応バッファーの 1x 溶液でカラムバッファーを交換します。これを行うには、500 μL の 1x バッファーをカラムに追加します。1000 x gで1分間の遠心分離機。フロースルーを破棄します。合計 1500 μL がカラムに追加されるように、さらに 2 回繰り返します。</li>
		<li>柱を1.5mLマイクロ遠心チューブに入れる。ステップ 2.1.5 のソリューションを列の最上層に慎重に追加します。1000 x gで4分間の遠心分離機。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブからフロースルー(40~70 μL)を集め、PCRチューブに入れます。これには、精製されたビオチン化ラムダDNAが含まれています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標識ラムダDNAを蛍光YOYO-1色素(励起最大=490nm、発光最大=509nm)を標準プロトコルに従って、ここで繰り返すステップ2.3.120。<ol>
<li>YOYO-1色素とラムダDNAの溶液を、塩基対モル比1:10の色素と共に調製する。ラムダDNAの塩基対濃度を計算する精製工程でDNAが失われなかったと仮定します。完全長ラムダDNAは48,502塩基対を有する。 注:例えば、ステップ2.2.4から50μLの溶液を回収した場合、500μM YOYO-1色素の7.4μLを加えます。</li>
		<li>溶液を暗闇の中で50°Cで2時間加熱して反応を完了させる。</li>
		<li>チューブをアルミ箔で覆い、光から保護します。4°Cで保管してください。このソリューションは、マイクロ流体デバイスに注入する準備が整いました。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. シリコンウェーハでのマイクロ流体チャネル金型の作成
<ol><li>フォトリソグラフィを使用して、標準プロトコル19に従ってマスター シリコン ウェーハ上に適切な寸法 (図 2)を持つマイクロ流体チャネルを作成します。</li>
</ol>4. ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体装置の製造
<ol><li>5部シリコーンエラストマーベースを1部硬化剤(質量)に加えます。内容物を1分間十分かき混ぜ、硬化PDMS溶液を作成します。</li>
	<li>プラスチック製のペトリ皿にマスターシリコンウエハを入れます。5 mmの層を作成するために、ウェーハの上にPDMS溶液を注ぎます。皿を覆い、空気泡を取り除くために1時間真空の下でデシケーターに残します。</li>
	<li>インキュベートは、PDMSを柔軟な固体に治すために一晩60°Cでペトリ皿を覆った。硬化は、PDMS-ウェハー界面で PDMS に成形されたマイクロ流体チャネルになります。</li>
	<li>カミソリを使用して、各マイクロ流体チャネルの周りにPDMSに20 x 10 mmの長方形をカットします。ピンセットを使用して、長方形の PDMS ブロックを取り外します。</li>
	<li>エッジを鋭くした25Gの鈍い端針を使用して、チャネルの一端に直径0.5mmの穴を開け、穴がPDMSブロックを完全に通過することを確認します(図2)。薄い針を使ってPDMSを穴から抜き出します。チャネルの反対側でこれを繰り返します。これにより、チャネルを流れる流入口と出口が作成されます。</li>
	<li>PDMSブロックの表面をビニールクリーンルームテープでクリーニングします。圧縮窒素ガスを1号機1/2号、22 x 50mmカバースリップで吹き飛ばして、デブリを除去します。</li>
	<li>PDMS ブロックをチャネル側を上に、カバースリップをプラズマボンディングマシンのチャンバーに入れます。治療を開始します。</li>
	<li>治療が完了したら、チャネルがスリップに接触するように、PDMSブロックをカバースリップに素早く置きます。ブロックのエッジに沿って圧力を適用します。カバースリップPDMSアセンブリを115°Cのホットプレートに15分間置き、永久結合を補強します。</li>
	<li>PDMSブロック上部の出口穴に、長さ10cm、内径0.25mmのチューブを挿入します。これにより、流体がチャネルから簡単に流出できます。これでデバイスが完成しました。</li>
</ol>5. マイクロ流体デバイスの表面の処理
<ol><li>VWF実験用マイクロ流体装置の入口に、10 μg/mL ビオチン化ウシ血清アルブミン(BSA-ビオチン)を無菌1x PBSに溶解した10μg/mLの&lt;10 μLを注入する。ラムダDNA実験のために1mg/mL BSA-ビオチンの&lt;10 μLを注入する。注射後のピペットチップにBSA-ビオチンの数マイクロリットルを差し控え、チップが入り口に埋め込まれたままにします。<ol>
<li>常に先端の周りにDI水の液滴を保ちます。これにより、気泡がチャネルに入るのを防ぎます。新しいソリューションがチャネルに注入されるたびにこの手法を適用します。</li>
		<li>BSA-ビオチンが2時間デバイス内でインキュベートできるようにします。BSAはカバースリップ面に特異的に結合しない(図3A)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットの先端を取り外します。チャネルに&lt;10 μLのカゼイン遮断溶液を注入し、30分間インキュベートします。カゼインは自由な部位を遮断し、生体分子の表面への非特異的結合を減少させる(図3B)。</li>
	<li>先端を取り外し、滅菌1x PBSに溶解した10μg/mLストレプトアビジンの&lt;10 μLをVWF実験用のチャネルに注入します。ラムダDNA実験には100 μg/mLストレプトアビジンを使用します。10分間インキュベートします。ストレプトアビジンはBSA-ビオチンのビオチン基に結合します(図3C)。</li>
	<li>先端を取り出し、1x洗剤溶液の&lt;10 μL(PBSで0.05%Tween 20)をチャネルに注入して、余分なストレプトアビジンを洗い流します。</li>
	<li>チップを取り出し、ステップ2.3.3から、カゼイン溶液またはラムダDNAで希釈した28.4 nM VWFの&lt;10 μLを注入します。VWFを3分間インキュベートします。</li>
	<li>先端を取り出し、カゼイン溶液で希釈した5mMフリービオチンの&lt;10 μLを注入します。遊離ビオチンはチャネル表面上の過剰なストレプトアビジン結合部位を遮断します(図3E)。</li>
</ol>6. 蛍光顕微鏡によるVWFとラムダDNAの可視化
<ol><li>2.2 mMプロトカテクチン酸と37 nMプロトカテキエート-3,4-ジオキシゲナーゼ(光滅を最小限に抑えるため)を用いてカゼインブロッキング溶液の1 mLを調製する。シリンジに積み込み、シリンジポンプで固定します。長さ30cm、内径0.25mmのチューブを取り、シリンジ針に一端を取り付けます。気泡を除去する溶液中の流れ。マイクロ流体デバイスの入口にチューブのもう一方の端を取り付けます。ステップ 5.6 の 3 分後に行うことをお勧めします。</li>
	<li>全内部反射(TIRF)または共焦点蛍光顕微鏡の最も高い倍率目標(すなわち、60-100X)を選択してください。必要に応じて、その目的に浸漬油のドロップを追加します。マイクロ流体デバイスを顕微鏡のステージに置き、カバースリップが目的と一緒に洗い流されるようにします。</li>
	<li>明視野顕微鏡を開始します。デブリや気泡などのフィーチャが表示されるように、フォーカスを調整します。次に、マイクロ流体チャネルのエッジが可視になり、フレームを二分化するまで、ステージを X 方向と Y 方向に調整します。</li>
	<li>488 チャンネル(FITC)に切り替えます。個々の緑、球状分子が区別できるまで、必要に応じてZレベルおよびTIRF角度を調整します。これらは、VWFまたはラムダDNA分子のいずれかである。</li>
	<li>露光時間とレーザー強度を調整して、蛍光分子をあまりにも早く光色化することなく可視化します。また、より明確に分子を視覚化するためにコントラストを調整します。</li>
	<li>シリンジポンプから流れを開始し、カゼインブロッキング溶液がチャネルに流れ込み、出口から出るようにします。ステップ 5.6 のちょうど 5 分後にこの操作を行います。分子の立体構造の変化を観察するために流れを停止し開始する。流れを適用する場合、5,000~30,000 μL/hの間の速度を使用します。このプロセスを続行して、流れを停止および開始する複数のサイクルで伸び、リラックスできる分子を見つけます。</li>
	<li>分子が最大伸長に達し、完全に球状にリラックスするのにかかる時間に注意してください。せん断流下の分子の連続挙動のビデオを録画し、最高の露出時間、露出頻度、ビデオの持続時間を選択し、拡張行動の全範囲をキャプチャし、フォトブリーチを最小限に抑えます。</li>
	<li>ビデオを として保存します。スケールバーを持つAVIファイル。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。</li>
</ol>7. 立体構造変化の画像解析
<ol><li>長方形のマイクロ流体流路の<img alt="Symbol 1" src="/files/ftp_upload/60784/60784sy1.jpg">流量 ( Q ) と高さ (h) と幅 (w) を使用して、高さ(Q)に適用される壁せん断速度 ( ) を計算します。次の式を使用してこれを行います。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60784/60784eq1.jpg">
</li>
	<li>カスタマイズされた MATLAB コードを使用して、さまざまなせん断速度での生体分子の長さを決定します (補足ファイルを参照)。次の MATLAB コードを含むビデオ分析というタイトルのフォルダーを作成します: main.m, save_each_frame.m, get_length.mとget_length.fig.ビデオ分析のタイトル付きビデオ内にサブフォルダを作成し、追加します。それに解析されるAVIファイル。</li>
	<li>MATLAB 2019a を使用してmain.mを開き、コードを実行します。コマンド ウィンドウの [分析するデータ ファイルを入力してください] の下に、分析するビデオ ファイルの名前を入力します。</li>
	<li>開いているグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)で、しきい値(ウィンドウ右上のボックス内のテキスト)を20に設定し、[しきい値の設定]ボタンをクリックして確認します。</li>
	<li>ウィンドウの上部のツールバーにあるデータカーソルを使用して、スケールバー上の任意の場所で 1 ピクセルを選択します。ウィンドウの右側にある[縮尺] セクションで [開始点] をクリックします。選択したピクセルの(x,y)位置がボタンの右側に表示されます。ピクセルサイズ(μm)ボタンをクリックします。ピクセル サイズは、各ビデオで 1 回だけ測定する必要があります。</li>
	<li>目的の分子上の任意のピクセルを選択します。VWFセクションの開始ポイントをクリックします。選択したピクセルの位置が右側のテキストボックスに表示されたら、画像の分子長さを取得するために、左端、右端、文字列の長さをクリックします。 注: このステップは、コードがVWFという特定のセクションを持っているにもかかわらず、生体分子の立体構造の変化を分析するために使用できます。</li>
	<li>分子の左端と右端を再確認します。データ カーソルを拡大して使用して、目的のピクセル位置を確認します。手動でピクセルを終わりとして選択し、必要に応じて長さ (ピクセル単位) を再計算します。</li>
	<li>ピクセルサイズをμm単位、文字列長をピクセル数でExcelシートに記録し、文字列の長さをμmで計算します。</li>
	<li>すべての画像について上記の手順を繰り返します。GUI の右下隅にあるLastボタン、次へボタンを使用して、同じビデオ ファイル内の画像を切り替えます。[閉じる]をクリックして GUI ウィンドウを閉じます。</li>
</ol>

<ol><li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Non-Newtonian+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li>
<li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li>
<li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li>
<li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li>
<li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface%3A+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li>
<li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET%2C+NMR%2C+and+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li>
<li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li>
<li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+analytics%3A+sensing+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li>
<li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li>
<li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li>
<li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overstretching+B-DNA%3A+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).</li>
<li>Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+Novel+tools+for+imaging+protein%E2%80%93nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言していない。

この方法で説明したように蛍光顕微鏡を用いて単分子の立体構造変化の高品質なデータを得るためには、適切な時間のために分子をインキュベートし、表面との非特異的相互作用を最小限に抑えることが重要であるそして、フォトブリーチを減らす顕微鏡の設定を確立します。この分子が自由に立体構造を変化させる能力は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジン相互作用の数に関連している。前述のように、これは適切な時間の流れなしに分子をインキュベートすることによって制御されなければならない。さらに、タンパク質またはDNAは、カバースリップが効果的に遮断されない場合、カバースリップに非特異的に結合する可能性がある。推奨ブロッキング溶液がなければ、分子はガラスに非特異的に付着し、適用される流量に反応しない可能性があります。早期表面処理時にカゼインブロックを適用し、流れの間にその存在を維持することは、これらの非特異的相互作用を低減するために不可欠である。最後に、単一分子の連続的で動的な挙動を捕捉するには、画像キャプチャ中に頻繁に蛍光素素興奮が必要です。レーザー強度、露光時間、露光周波数が高すぎると、急速な光の色素化が発生する可能性があります。したがって、これら...

生体分子が環境刺激にどう反応するかのメカニズムが広く研究されている。特に流れ環境では、せん断と伸びの力が、立体構造の変化を調節し、生体分子の機能を制御する可能性があります。代表的な例としては、ラムダDNAおよびフォン・ヴィルブランド因子(VWF)の剪断誘発解明が挙げられる。ラムダDNAは、個々の、柔軟なポリマー鎖の構造ダイナミクスとポリマー溶液1、2、3、4の流動を理解するためのツールとして使用されている。VWFは異常な剪断速度および流れのパターンの血管の傷ついた場所で血小板を凝集する自然な流れセンサーである。VWFの解明は、A1ドメインへの血小板の結合とA3ドメインへのコラーゲン結合を活性化するために不可欠である。さらに、高剪断誘導A2ドメイン展開は、循環中の分子量分布を調節するVWFの切断を可能にする5、6。したがって、これらの分子が流動下でどのように振る舞うかを直接視覚化することで、バイオメカニクスと機能に関する基本的な理解が大幅に高まり、新しい診断および治療用途が可能になります。
単一分子の立体構造を特徴付ける一般的な方法論には、光/磁気ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)および単分子フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)7が含まれる。単一分子力分光法は生体分子の立体構造変化に伴う力と運動を調べる強力なツールです。しかし、それは全体的な分子構造8をマッピングする能力を欠いている。AFMは、高い空間分解能でイメージングが可能であるが、時間分解能9、10に制限されている。また、先端と試料との接触は、流れによって誘導される応答を混乱させる可能性がある。FRETやナノポア分析のような他の方法は、分子内距離と除外された体積の検出に基づいて、単一分子タンパク質の折りたたみおよび展開状態を決定します。しかし、これらの方法は、まだ初期段階にあり、単一分子立体構造11、12、13、14の直接観察において制限されている。
一方、蛍光顕微鏡下で高い時間的および空間的分解能を有する高い時間的および空間的な高分子を直接観察することは、多くの生物学的プロセスにおける単一分子ダイナミクスの理解を改善した15,16。例えば、Fuら最近、初めてVWF伸長と血小板受容体結合の同時可視化を達成した。その研究では、VWF分子をビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して微小流体チャネルの表面に固定化し、様々な剪断流環境で全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡下で画像化した17。Fuと同様の方法を用いて、ここでは、VWFとラムダDNAの立体構造をTIRFと共焦点蛍光顕微鏡の両方で直接観察できることを実証します。図1に示すように、マイクロ流体デバイスを使用してせん断流を作成および制御し、生体分子をチャネル表面に固定化します。せん断速度の変化を適用すると、同じ分子の立体構造が記録され、伸長長を測定し、図1にも示される。この方法は、レオロジー研究と生物学的研究の両方のために複雑な流れの環境下で他のポリマー挙動を探求するために広く適用することができる。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 ラベリングキット</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Spin P-6 ゲルカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>7326221</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>ステップ5.6で遊離ビオチンとして使用</td></tr><tr><td>Biotin-14-dCTP</td><td>AAT Bioquest</td><td>17019</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-195</td><td>No. 1 &frac12;, 22 x 50 mm</td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td><td>Thermo Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr;5' exo-)</td> <td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>ステップ 2.1.1 の 10X 反応バッファーとステップ 2.2.2</td></tr><tr><td>ラムダ DNA</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>ミニ透析装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570</td><td>10K MWCO、0.1 mL</td></tr><tr><td>容量 NEBuffer 4</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>NHS-PEG4-ビオチン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>21330</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテキエート 3,4-ジオキシゲナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテク酸</td><td>サンタクルス バイオテクノロジー</td><td>sc-205818</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 製造用シリコーン エラストマー キット</td><td>ダウ ケミカル カンパニー</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85878</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング ソリューション</td><td>CANDOR バイオサイエンス</td><td>110 050</td><td>カゼインブロッキングソリューションとして使用</td></tr><tr><td>プロトコル ビニール クリーンルームテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-120-3217</td><td></td></tr><tr><td>フォン Willebrand 因子、ヒトプラズマ</td><td>ミリポア シグマ</td><td>681300</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 染料</td><td>AAT Bioquest</td><td>17580</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm 内径チューブ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-06419-00</td><td></td></tr><tr><td>25 ゲージ針</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>・JG2505X</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

機械的摂動下における単一分子挙動は、多くの生物学的プロセスを理解することが広く特徴付けられている。しかし、原子間力顕微鏡法は時間分解能が限られているのに対し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は立体構造の推測しか認めることができない。一方、蛍光顕微鏡法は、様々な流れ条件下での単一分子のリアルタイム可視化を可能にする。我々のプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて異なる剪断流環境下で単一の生体分子の立体構造変化を捉えるステップを記述する。剪断流はマイクロ流体チャネルの内部に作成され、シリンジポンプによって制御される。この方法のデモンストレーションとして、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)とラムダDNAをビオチンとフルオロフォアで標識し、チャネル表面に固定化する。それらの立体構造は、全内部反射(TIRF)および共焦点蛍光顕微鏡を用いて可変剪断流下で連続的にモニタリングされる。VWFの可逆的な解明ダイナミクスは、その機能がヒト血液中でどのように調節されているかを理解するのに役立ちますが、ラムダDNAの立体構造は高分子の生物物理学に関する洞察を提供します。プロトコルはまた、様々な流れの条件でポリマー、特に生体高分子の挙動を研究し、複雑な流体の流動を調査するために広く適用することができる。

VWFやラムダDNAなどの生体分子の動的挙動を観察することは、デバイス表面への結合を最適化することに大きく依存しています。マイクロ流体デバイスの推奨時間に対する表面処理のインキュベートは、いくつかのアンカレッジポイントとの結合を得るために重要であり、分子が流れの変化に伴って自由に伸びてリラックスできるようにします。タンパク質またはDNAが複数のリンケージと強く結合しすぎると、限られた長さにまで伸びるか、まったく伸びないかのどちらかになります。これは、特にVWFがフリービオチンブロッキングの前に3分以上デバイス表面に流れずに残っている場合に発生します。VWFが表面に停滞している時間が長ければ長いほど、VWFビオチン群が表面ストレプトアビジン群に結合し、分子が解明する柔軟性が低くなります。分子が弱く結合しすぎると、流れに際して切り離され、視界から消えます。これは、VWFまたはラムダDNAがあまりにも短い期間インキュベートされ、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用が形成されない場合に発生する可能性があります。分子は、非常に高いせん断速度(&gt;200,000 s-1)が適用されると、ビオチンとストレプトアビジンの相互作...

マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

せん断流下の単一生体分子の立体構造変化を定量化することは、タンパク質やDNAのような高分子の機能や生物物理学を理解するのに役立ちます。蛍光顕微鏡は、高い時間的および空間分解能を有する生理的な流れ環境における単一分子のリアルタイムのイン・ザ・ビジュアライゼーションを可能にする。これは、AFM のような他の手法とは比類のないものです。タンパク質のDNAが世界的な立体構造変化を有するせん断力を特徴付けることによって、これらの生物物理学的特性を模倣する薬物をより良く設計することができます。このプロトコルは、様々な流れの条件での挙動または他のポリマー、特にバイオポリマーを研究し、複雑な流体のレロロジーを調査するために広く適用することができます。ステップのタイミングは成功に不可欠です。マイクロ流体デバイス表面処理や蛍光顕微鏡のステップを何度も実践して、効率的に実行することを提案します。生体分子の立体構造変化を捉えるのが、フィルムで最もよく見られる視覚的で動的な現象です。科学者は、このビデオで紹介されたリアルタイムタンパク質とDNA顕微鏡を見た後、この方法をよりよく理解するでしょう。マイクロ流体装置を準備するには、シリコーンエラストマーベースの5つの部分を計量ボートの1部硬化剤に加えます。そして、十分に硬化PDMS溶液を作成するために1分間完全に攪拌します。マスターシリコンウエハーをプラスチックペトリ皿に入れ、PDMS溶液をウエハーに注ぎ、5ミリメートルの層を作ります。皿を覆い、空気泡を取り除くために1時間真空下のデシケーターに残します。その後、一晩摂氏60度で覆われたペトリ皿をインキュベートしてPDMSを柔軟な固体に治し、PDMSウエハーインターフェースでマイクロ流体チャネルをPDMSに成形します。翌日、カミソリを使用してPDMSの各マイクロ流体チャネルの周りに20を10ミリメートルの長方形でカットし、ピンセット付きの長方形ブロックを取り除きます。25ゲージの鈍い端針を使用して、鋭利なエッジを使用して、チャネルの一端に直径0.5ミリメートルの穴を開け、穴がPDMSブロックを完全に通過することを確認します。穴からPDMSをパンチアウトし、チャネルの反対側でプロセスを繰り返すために細い針を使用してください。PDMSブロックをチャネル側を上にしてカバースリップをプラズマボンディングマシンのチャンバーに入れ、処理を開始します。治療が完了したら、すぐにカバースリップにPDMSブロックを置き、チャネルがスリップに接触するようにします。ブロックの端に圧力をかけ、その後、115°CのホットプレートにカバースリップPDMSアセンブリを15分間置き、永久結合を補強します。最後に、長さ10センチメートルを挿入します。PDMSブロックの上部にある出口穴に0.25ミリメートルの内径チューブは、流体が容易に流路から流れ出るようにします。フォン・ウィレブラント因子またはVWF実験では、無菌1X PBSに溶解した1ミリリットル当たり10マイクログラムの最大10マイクロリットルをマイクロ流体デバイスの入口に注入する。注射後に数マイクロリットルのBSA-ビオチンをピペットチップに差し込み、チップを入口に埋め込んだままにします。BSA-ビオチンがデバイス内で2時間インキュベートすることを許可し、その結果、BSAはカバースリップ表面に非特異的に結合します。その後、ピペットチップを取り出し、最大10マイクロリットルのカゼインブロッキング溶液をチャネルに注入します。カゼイン溶液を30分間インキュベートして、自由な部位をブロックし、生体分子の表面への非特異的結合を低減できるようにします。先端を取り除き、無菌PBS中のストレプトアビジンを最大10マイクロリットルのストレプトアビジンをチャネルに注入し、BSA-ビオチンのビオチン群に結合する。次に、最大10マイクロリットルの洗剤溶液を注入して、過剰なストレプトアビジンを洗い流します。先端を取り外し、ケースイン溶液またはラムダDNAにVWFのいずれかを注入する。VWFを3分間、またはラムダDNAを45分間インキュベートする。その後、5ミリモルフリービオチンを注入して、過剰なストレプトアビジン結合部位をブロックする。1ミリリットルのカゼインブロッキング溶液を注射器にロードし、シリンジポンプで固定します。次に、チューブの一端をシリンジ針に取り付け、溶液中を流れ、気泡を取り除きます。遊離ビオチン注入後約3分は、マイクロ流体装置の入口にチューブの他端を取り付ける。TIRFまたは共焦点蛍光顕微鏡の最高倍率目標を選択します。必要に応じて、目的に浸漬油の滴を追加します。マイクロ流体装置を顕微鏡ステージに置き、カバースリップが目的に合ってフラッシュされるようにします。明視野顕微鏡を開始し、破片や気泡などの特徴が見えるように焦点を調整します。次に、マイクロ流体チャネルのエッジが可視になるまで X 方向と Y 方向のステージを調整し、フレームを二分します。FITCチャネルに切り替え、個々の緑色球状分子が区別されるまで、必要に応じてZレベルとTIRF角度を調整します。レーザー強度と露出時間を調整して、蛍光分子をあまりにも速く光漂白することなく視覚化します。その後、分子をよりよく視覚化するためにコントラストを調整します。注射器ポンプからの遊離ビオチン注入開始と停止流のちょうど5分後に、1時間当たり5000〜30,000マイクロリットルの流量を用いて分子立体構造の変化を観察する。VWFでは、10,000マイクロリットル/時間の流れの30秒のような少量の流量を、無料のビオチン注入のちょうど5分後に適用することが重要である。マイクロ流体デバイスの様々な領域にわたってこれを繰り返し、開始および停止流の複数のサイクルで拡張し、リラックスできる分子を見つけます。分子が最大の伸長に達し、剪断流下の分子の連続的な行動の完全なリラクゼーションと記録ビデオにかかる時間に注意してください。変化の確認に対する分子の柔軟性は、流れの増加に伴って高い剪断速度が適用されるにつれて、その長さを長くする能力によってしばしば実証される。フォン・ヴィルブランド因子分子の伸長対せん断速度曲線は、タンパク質の生体力学的特性を特徴付ける上で有用である。ラムダDNAの蛍光顕微鏡画像は、同様に、30秒でより高い剪断速度での増加延長および流れが停止した2分間にわたって緩やかな緩和を示す。VWFで作業する場合は、3分間だけインキュベートし、5分間無料のビオチンを流れ始める前に必ずインキュベートしてください。これは、可逆的な解明に必要な最適な数またはビオチンストレプトアビジン結合を形成するために重要です。この方法は、複数の生体分子間のリアルタイム相互作用を可視化し、その機能を特徴付けるために適応することができる。例えば、高剪断下でのVWFの解明と、この方法での血小板接着分子GPIb-αとの結合を視覚化することで、血小板プラグ形成をよりよく理解することができた。

characterizing-single-molecule-conformational-changes-under-shear

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。...

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

このビデオでは、タンパク質のホモオリゴマー化を研究するための蛍光揺らぎ分光法(FFS)の手法を実演しています。サンプル中の蛍光標識タンパク質は、FFSを用いたタンパク質オリゴマー化を研究する際に、薬剤を用いて二量体化されます。共焦点顕微鏡を用いて、タンパク質が小さな観察領域に出入りする際に、蛍光分子の明るさの変動を解析し、タンパク質のオリゴマー状態を決定します。...

タンパク質ホモオリゴマー化を研究するための蛍光変動分光法

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。...

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

時間分解された単一分子タンパク質誘導蛍光増強は、タンパク質の局所的な構造変化に敏感な蛍光分光性近接センサとして有用である。ここでは、より長い範囲のFRET定規を使用して測定した場合、球状に非構造化および不安定として知られているα-Synucleinの安定した局所的な立体構造を発見するために使用できることを示す。...

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

アンサンブル力分光法(EFS)は、生物物理学およびバイオセンシング分野における生体分子構造のアンサンブルセットの機械的アンフォールディングおよびリアルタイムセンシングのための堅牢な技術です。...

せん断力によるアンサンブル力分光法

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による...

1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。...

Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング

ここでは、共焦点顕微鏡モードで単一分子レベルでの時間分解蛍光異方性を使用して、生体分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを研究するためのプロトコルを紹介します。...

生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

学ぶせん断流下でタンパク質やDNAなどの単分子の立体構造変化を蛍光顕微鏡で可視化・定量化する手法。創薬や複雑流体のレオロジー研究に応用可能です。

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

さらに動画を探す