高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュのさまざまな遺伝子型、変異、または導入遺伝子を迅速にスクリーニングすることです。これは、最初に細いクリップからDNAを抽出し、次にPCRによってDNAを増幅することによって達成されます。次のステップは、ソフトウェアで分析される融解曲線を記録しながらPCRアンプリコンを変性させることです。

最終的に、結果は異なる遺伝子型の区別可能な融解曲線を示しています。ゲル電気泳動ボリュームPCRのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、一塩基の変化、小さな挿入、すべての欠失に敏感であり、この技術は高速で信頼性が高いことです。この技術は、ゼブラフィッシュの遺伝子型を迅速かつ効果的に決定するために使用できますが、細胞株、マウス、その他の動物など、他のシステムやモデル生物にも適用できます。

DNA調製の日に、新鮮なプロテイナーゼKを1ミリグラム/ミリリットルの濃度で溶解バッファーに加えます。組織は、細いクリップを使用して成魚から、または胚の魚から採取できます。まず、トリカ溶液で魚を麻酔します。

鰓の動きが遅くなるまで待ちます。次に、魚をティッシュの山に置き、滅菌のかみそりの刃で、長さ約2〜3ミリメートルの尾びれの小片を切り取ります。魚を真水を入れたラベル付きのタンクにすばやく入れて回復します。

滅菌ピペットチップ付きのフィンクリップを手に取り、100マイクロリットルのDNA溶解バッファーを充填したチューブに移します。動物のタンクとチューブの両方にラベルを貼り、採取したすべての組織をインキュベーション後、少なくとも4時間、最大で摂氏55度まで一晩インキュベートしてください。チューブを摂氏95度で15分間加熱することにより、タンパク質ACE Kを不活性化します。

これらのサンプルは、すぐにPCRに使用する必要がありますが、マイナス20°Cで最大3ヶ月間保存することもできます。各反応について、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートでPCRを実行します。成人のDNAを1マイクロリットル以下と4マイクロリットルのライトスキャナーを組み合わせます。

蛍光プローブとプライマーをそれぞれ5ピコモルの最終濃度で含むマスターミックス。DNAが胚からのものである場合は、最大3マイクロリットルを使用してください。反応液を30マイクロリットルの鉱油で覆い、蓋をして閉じます。

次に、装填したPCRプレートを光学的に透明な接着シールで覆います。次に、PCRサイクリング条件を最適化します。一般的な条件セットは、5 分間の溶融時間から始まります。

これに続いて、10 秒の融解、25 秒のニーリング時間、30 秒の伸長を含む 30 回の PCR サイクルが行われます。反応は、32回目の溶融物を追加して終了し、摂氏15度に冷却する必要があります。PCRプレートをソフトウェアのメルト分析システムに入れて分析します。

温度を設定し、新しいデータストレージファイルを作成します。サブセットを設定します。画面の左下にあるサンプルのあるウェルを選択します。

正規化されたタブを選択して、蛍光バリアントを排除します。プレム、メルト、ポストメルト領域に平行な二重線を手動で配置し、すべてのサンプルのプレメルとポストメルトの蛍光シグナルをそれぞれ1とゼロに正規化します。次に、最初にグループ化を選択することにより、融解温度に基づいて遺伝子型を区別します。

次に、標準選択リストから自動グループ化を選択します。グループ化セクションで、単一トランジションまたは複数トランジションの融解プロファイルに対して、normalまたはhighを選択します。グループ化セクションの感度選択リストにあります。

次に、グループ化セクションでコンピューティンググループを選択し、ファイルメニューに移動して[保存]をクリックし、結果を保存します。このプロトコールは、1日で実施することも、数日間でステップ分けて実施することもできます。PCRを行う場合、アンプリコンの溶融温度はサイズやGC含量によって異なりますが、一般的には、溶融を行った後の開始温度と終了温度は摂氏60度と摂氏95度が適切です。

蛍光融解曲線の分析では、通常、融解前領域と融解後領域を標準として、さまざまなサンプル曲線の変動を正規化する必要があります。これにより、蛍光の変動が小さな実験変動に関連している異なるサンプルからの結果の比較が改善されます。正規化のための温度線の各ペアは、摂氏約1度離して配置する必要があります。

データは、融解曲線プロファイルファイルを示すグラフと、HRMA分析後の突然変異または導入遺伝子を検出した後の参照サンプルと比較した減算差分プロットを示すグラフの2つの方法で表すことができます。EIF two B five遺伝子の2つの異なる突然変異は、赤と青の曲線で示されています。これらの変異体サンプルは、標準的な野生型曲線と比較した場合の融解曲線、形状、または蛍光の変化に大きな違いがあることで識別されます。

この例は、1つの胚コレクションに含まれる4つの異なる遺伝子型を示していますが、この方法の威力と感度を示しています。一度マスターすれば、このテクニックは8時間以内に行うことができます。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの遺伝子型の効率的な大規模スクリーニングのためのHRMAの実施方法について十分に理解できるはずです。