Name: 高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学ぶ高解像度メルト解析を用いたPCRによるゼブラフィッシュの迅速な遺伝子型決定法。Danio rerioを用いて、単一塩基変異や小規模な挿入・欠失を検出し、従来法より高速かつ信頼性の高い遺伝学的スクリーニングを実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、助言や技術支援のためのBlaschke、メイ、そしてウィトワーラボのメンバーに感謝。この作品は、JLBに、PCMC財団、NIH R01 MH092256とDP2 MH100008、そしてダイム財団研究助成金＃1-FY13-425の3月までサポートされています。

1。 DNAの準備<ol><li> 50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.3％のTween20、0.3％NP40：DNA溶解緩衝液を調製する。使用12日の1ミリグラム/ mlの最終濃度になるように、新鮮なプロテイナーゼKを追加します。 </li><li>組織収集： <ol><li>成魚フィンクリップの場合： <ol><li>魚を麻酔：0.004％、MS-222（トリカイン）溶液中に魚を置きます。鰓の動きが遅くなるまで待ってください。 </li><li> 5月10日キムワイプのスタック上に魚を入れて滅菌したカミソリの刃で、テールフィン、2〜3mm程度の小片をカット。 </li><li>すぐに回復のための新鮮な水とラベルされたタンクに魚を置き、慎重にフィンクリップが含まれていますタンクとそれに対応するチューブの両方にラベルを付ける。水を変更し、一日おきに魚を食べます。 </li><li>無菌ピペットチップでフィンのクリップをピックアップし、100μlのDNA溶解緩衝液で満たされたチューブに転送します。 </li><li>ピペットチップを廃棄して、鋭利物容器にカミソリの刃を捨てる。 </li></ol></li><li>胚テールクリップの場合： <ol><li> 0.004％のMS-222（トリカイン）溶液中に胚を置きます。 2分待ちます。 </li><li>解剖顕微鏡下でピンセットで尾の部分をカット。 </li><li> 30μlのDNA溶解緩衝液で満たされたラベルチューブに尾を置く。 </li><li>すぐに100μlの4％パラホルムアルデヒドを含むチューブに胚を置く。 </li><li>胚およびそれに対応する尾管をラベルチューブ。 </li><li>固定用の4℃で一晩胚を試験管に保管してください。 </li><li>汚染を最小限に抑えるために各胚の間でミリQ水とキムワイプを使用して鉗子を清掃してください。 </li></ol></li><li>全体の胚の場合： <ol><li> 0.004％のMS-222（トリカイン）溶液中に胚を置きます。 2分待ちます。 </li><li> 100μlのDNA溶解緩衝液で満たされたチューブ内で1-5胚を置く。 Dechorionationは必要ありません。 </li></ol></li></ol></li><li> DNA消化 55℃で組織（FINあるいはテールクリップや胚）でチューブをインキュベートします一晩12に4時間のアップのため。 </li><li>プロテイナーゼKを不活性化 15分12 95℃まで熱管。 DNAは直ちにPCRに使用するか、最大3ヶ月間-20℃で保存する必要があります。 </li></ol> 2。 PCR法<ol><li>設計プライマー手動またはプライマー設計ソフトウェア（ 例えば Lightscannerプライマー設計ソフトウェアBiofire）による。 HRMAのためのPCR産物は、通常、50〜200塩基対であり、SNP検出のためのPCR産物は、典型的には50〜80塩基対、小さくなければならない。 </li><li> PCR法<ol><li> 96ウェルまたは384ウェルプレート中でPCR反応を行う。 </li><li>各プライマー5pmolの、4μlのLightScannerマスターミックス（0.1 UホットスタートTaqポリメラーゼ-ABポリメラーゼ、緩衝液、0.2mMのdNTPを、2mMの塩化マグネシウム、および1×蛍光二本鎖DNA結合色素）：10μlの全容積を使用大人のテールフィンまたは胚の尾13から3μLゲノムDNAから抽出され、1μlのゲノムDNAテンプレート。 </li><li> 30μlのミネラルオイルをカバーサンプル。 </lI&gt; <li>光学的に透明な接着シールでプレートをカバーしています。 </li><li> PCRサイクリング条件は、典型的な最適条件は、95℃で5分および10秒の30サイクル、95℃であり、60°C、72°Cで30秒、25秒、30秒、95℃で終わるに冷却15℃ </li><li>店舗PCRプレート4℃またはHRMAに直接進んでください。 </li><li> PCRの最初の最適化中にアガロースゲル電気泳動を用いてそのサイズを分析することによって我々のPCR産物を確認すると、PCR産物の配列決定により、示されている場合。 </li></ol></li></ol> 3。 HRMA <ol><li>熱板<ol><li>溶融分析システムにプレートを置きます。 </li><li> （LightScannerソフトウェアがコールイット2.0）ソフトウェアを起動します。 </li><li> 60〜95℃から熱板</li><li>新しいデータ·ストレージ·ファイルを作成します。 </li></ol></li><li> HRMAのデータを分析します（ 図2）。 分析の複数のステップが可能です。我々は、データmの最も一般的に使用されるセットを示すanipulations。 <ol><li>サブセットの設定 サブセット]タブをクリックします。サンプルでウェルを選択します。 </li><li>正規化<ol><li>左側のパネルでノーマライズ ] タブを選択します。蛍光分散を解消するために、手動で前（初期）平行二重線を配置し、ポスト（最終）溶融領域（ 図2C、矢頭）示されているように、1から0への全てのサンプルのプリメルトとポスト溶融蛍光シグナルを標準化それぞれ14。 </li><li>溶融領域は前後のメルトライン間の領域になるように線の位置を調整するが、選択されていない。一般的に、低最小と下マックス（アッパー最小アッパー最大）温度ラインは約1℃離して配置する必要があります。 </li><li>すべてのサンプルは、POSに最もよくとして最大値またはプリメルト領域および最小または後の溶融領域に対するいいえ（0％）蛍光（のための完全な（100％）の蛍光を有するように正規化するための温度位置を選択してくださいてアクセスします）。正規化は、融点と0の最小蛍光での溶融点からしてほぼ水平線まで伸びる1の最大蛍光でほぼ水平線になるはずです。1上または0以下の蛍光レベルがあってはならない。たとえば、 図2（c）に、79〜80℃の温度範囲を使用前溶融曲線を正規化</li></ol></li><li>グループ化/クラスタリング それらの融解温度（ 図2C、緑のボックス）に基づいて遺伝子型を区別します。 グループ化を選択します。 <ol><li> グループ化]セクションの下の標準選択リストからAUTOGROUPを選択します。 </li><li>グループセクションの下に感度選択リストから、それぞれの単一の遷移や、複数の遷移にプロファイルを溶融させるための標準または高 ]を選択します。 </li><li> 計算を選択します。グループ化]セクションの下にグループ化します。 </li><li> [ファイル ] メニューに移動し、その結果を保存するために[保存]をクリックします。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

HRMAと組み合わせたPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型解析のための強力な技術です。このアプローチの利点は、その速度、ロバスト性、さらには点突然変異を検出するための感度である。全体のプロトコルは、フィンクリップする溶融曲線解析から、単一の個人によって8時間未満で行うことができる。また、この技術は、ハイスループットスクリーニングのために適している、臭化エチジウムの使用を必要としないと、汚染の問題を最小限に抑えることができ、すべてのPCRおよび分析工程のために封止されている。 このテクニックのための重要なステップは、PCRアンプリコンとプライマーデザインです。 HRMAでのPCR産物の典型的な長さは50〜200 bpである。短いアンプリコンは、感度を高め、単一ヌクレオチド変化を検出するために理想的である。プローブは、密接に関連したPCR産物種の溶融曲線は容易に区別できない場合には、SNPに相補的な3 &#39;末端でブロックされた小さいオリゴヌクレオチドは、PCR反応（Lunaprobesに含めることができるS）。プローブは、その後のHRMA PCRにおけるプローブの拡張を防ぐため...

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広く開発および疾患モデルの研究のために使用脊椎動物モデル系である。最近では、数々のトランスジェニック、突然変異の技術は、ゼブラフィッシュのために開発されている。通常、トランスポゾンシステム1に基づいた迅速な遺伝子導入技術は、複数のDNA断片の集合体2のための改良されたクローン作成オプションと組み合わされている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）は、ゼブラフィッシュの3,4の両方の体細胞および生殖細胞系列の細胞に遺伝子座を標的とするために使用されてきた。これらの技術は、効率的に高周波突然変異の作成 ​​および生殖系列伝達3,4と、遺伝子改変動物を生成することができる。 これらの進歩にもかかわらず、ゼブラフィッシュの伝統的なジェノタイピング技術は、変異誘発および遺伝子導入ツールのフルパワーを制限している。 PCRは、時にはrestrictioと組み合わせ、ゲル電気泳動、続いてnは消化酵素、広くゲノム改変を検出するために使用されるが、小さな挿入または欠失を同定するための時間がかかり、あまり敏感である。 TaqManプローブアッセイは、高い初期コストが、慎重な最適化を必要とする。 PCR産物の配列決定は数日かかると大規模なスクリーニングには実用的ではないができる。制限断片長多型（RFLP）分析は、唯一の制限酵素認識部位の限られた範囲に影響を与えるSNPを識別することができる。 高解像度融解分析（HRMA）、閉じたチューブのポスト-PCR分析法は、迅速、高感度、安価で、かつ多数のサンプルをスクリーニングに適している最近開発された方法である。 HRMAのSNPは、突然変異、および5-7導入遺伝子を検出するために使用することができる。 HRMAは、二本鎖DNAの熱変性に基づくものであり、各PCRアンプリコンは、特徴的な固有の解離（溶湯）5を有している。サンプルは、tと判別することができるそれらの異なるヌクレオチド組成、GC含量、または長さが、O、通常、二本鎖DNA に結合する8蛍光色素と組み合わせて含む。従って、HRMAは、異なる溶融曲線の特性に基づいて、異なる遺伝子型を区別することができる。 HRMAは、低コストの試薬を使用し、シングルステップのポストPCR処理であるため、ハイスループット戦略のために使用することができる。 HRMAので分析後のPCRアンプリコンが他の用途に使用することができ、非破壊である。 HRMA、細胞株、マウス、およびヒト9-11を含む、多くの生物およびシステムに適用されている。その使用は、最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALENS 6,12,13によって誘発される突然変異を検出するために、ゼブラフィッシュに記載されている。 本論文では、胚および成体ゼブラフィッシュ（ 図1）でPCRベースHRMAの実行方法について説明します。このプロトコルは、Siを含む、SNPは、導入遺伝子、および突然変異を検出するのに適しているngle塩基対の変化、挿入、または欠失。

<table><tbody><tr><td>100 リアクション LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>ハードシェル PCR 96 ウェル BLK/WHT プレート</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>マイクロシール 「B」 接着シール</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリ</td>ーズ <td>MSB1001</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>96 ウェル LightScanner 装置</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>高解像度融解分析 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner プライマー デザインソフトウェア</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI ソフトウェア</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>www.invitrogen.com Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高解像度メルト解析を用いたpcrを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

ゼブラフィッシュは、発達を研究する疾患をモデル化し、薬物スクリーニングを行うための強力な脊椎動物モデル系である。最近、遺伝のさまざまなツールが突然変異を誘発し、トランスジェニック系統を生成するための複数の戦略を含め、導入されている。しかしながら、大規模スクリーニングは、時間がかかり、労働集約的であり、伝統的な遺伝子型決定法によって制限される。ここでは、高分解能融解分析（HRMA）と組み合わせたPCRによるゼブラフィッシュの遺伝子型を分析するための技術が記載されている。このアプローチは、汚染の成果物のリスクが低いと、迅速、高感度、かつ安価である。 HRMAとPCRによる遺伝子型決定は、ハイスループットスクリーニングプロトコルを含めて、胚または成体の魚のために使用することができる。

プロトコルは、1日の間に行うか（作業のフロー図を図1に示されている）、数日間にわたって段階で分離することができる。 DNA抽出は、PCRアンプリコンの溶融および分析が続く。アンプリコンの溶融のための温度は、大きさおよびGC含量に依存するが、一般的に開始し、50˚C 95˚Cの終了温度が（ 図2Aおよび2B）が適切である。溶融が実行されると、蛍光溶融曲線の分析は、典型的には、標準（ 図2C）のように前後の溶融領域を用いて、異なるサンプル曲線の変動の正常化を必要とする。これは、蛍光の変化は軽微な実験的変動に関連した異なるサンプルからの結果の比較を改善する。正規化のための温度線の各ペアは、離れて約1˚C（ 図2C、矢頭）に配置する必要があります。融解曲線プロファイルを示す上面図であり、参照試料（ 図2D）と比較して、サブトラクティブ差プロットを示す下側のグラフ：;データ結果のグループ化は、2つの異なる方法で表されている。 <p cla...

高解像度融解分析（HRMA）と合わせPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型を決定するための迅速かつ効率的な方法として示されている。

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

本手順の全般的な目的は、ゼブラフィッシュにおける異なる遺伝子型、変異、または導入遺伝子を迅速にスクリーニングすることです。これは、まず薄いクリップ組織からDNAを抽出し、次にPCRによってDNAを増幅させることで達成されます。次のステップでは、融解曲線を記録しながらPCR増幅産物を変性させ、その結果をソフトウェアで解析します。最終的に、結果から異なる遺伝子型に対して判別可能な融解曲線が得られます。ゲル電気泳動を用いたボリュームPCRなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一塩基の変化や小さな挿入、欠失に対しても感度が高く、迅速かつ信頼性が高いことです。本手法はゼブラフィッシュの迅速かつ効果的なジェノタイピングに使用できますが、細胞株、マウス、その他の動物を含む他の系やモデル生物にも適用可能です。DNA調製当日、溶解バッファーに新鮮なproteinase Kを1 mg/mLの濃度で添加します。組織は、薄いクリップを用いて成魚から採取するか、または胚から採取します。まず、Trica溶液で魚を麻酔させます。鰓の動きが緩くなるまで待ちます。その後、魚をティッシュペーパーの上に置き、滅菌済みのカミソリ刃を用いて、尾鰭から2〜3 mm程度の小さな断片を切除します。速やかに、ラベルを貼った新しい水が入ったタンクに魚を戻し、回復させます。滅菌済みのピペットチップでフィンクリップを採取し、100 µLのDNA溶解バッファーが入ったチューブに移します。個体の飼育槽とチューブの両方に必ずラベルを貼り、採取したすべての組織を55 °Cで最低4時間から一晩までインキュベートします。インキュベーション後、チューブを95 °Cで15分間加熱し、タンパク質ACE Kを不活化させます。これらのサンプルは直ちにPCRに使用してください。ただし、−20 °Cで最大3か月間保存することも可能です。各反応について、96ウェルまたは384ウェルプレートを用いてPCRを行います。1 µL以下の成体DNAを4 µLのライトスキャナーと混合してください。蛍光プローブおよびプライマーをそれぞれ最終濃度5 pMで含むマスターミックスを調製します。DNAが胚由来である場合は、最大3 µLまで使用します。反応液に30 µLのミネラルオイルを加え、キャップを締めて密封します。次に、試料を分注したPCRプレートを光学的に透明な粘着シールで密封します。続いて、PCRサイクル条件を最適化します。一般的な条件設定では、まず5分間の熱変性（メルト）時間から開始します。続いて、10秒の熱変性、25秒のアニーリング、30秒の伸長からなるPCRサイクルを30回繰り返します。反応は、さらに32回目の熱変性を加えた後、15 °Cまで冷却して終了させます。PCRプレートを融解曲線分析システムにセットし、ソフトウェアを用いて解析してください。温度を設定し、新しいデータ保存ファイルを作成します。サブセットを設定します。画面左下にあるサンプルが入ったウェルを選択します。「Normalized」タブを選択し、蛍光バリアントを除去します。Prem、melt、およびpost melt領域に平行二重線を手動で配置し、すべてのサンプルのpremeltおよびpost melt蛍光信号を、それぞれ1と0に正規化します。次に、「grouping」を選択して、融解温度に基づいてジェノタイプを識別します。次に、標準選択リストからauto groupを選択します。グルーピングセクションで、単一転移の融解プロファイルの場合はnormalを、多重転移の場合はhighを選択してください。これらはグルーピングセクションの感度選択リストにあります。次に、グルーピングセクションで計算グループを選択し、ファイルメニューから「保存」をクリックして結果を保存します。このプロトコルは1日で完了させることも、数日に分けて段階的に実施することも可能です。PCRを行う際、アンプリコンの融解温度はサイズとGC含量に依存しますが、一般的に融解解析を行う際は、開始温度を60 °C、終了温度を95 °Cに設定することが適切です。蛍光融解曲線の解析では、通常、融解前後の領域を標準として用いて、異なるサンプル曲線間の変動を正規化する必要があります。これにより、わずかな実験的変動に起因する蛍光強度のばらつきを補正し、異なるサンプル間の結果の比較精度を高めることができます。正規化に使用する各温度ラインのペアは、約 1 °C 間隔で配置してください。データは、融解曲線プロファイルのファイルを示すグラフ、またはHRMA解析後の参照サンプルと比較した減算差分プロットを示すグラフの2通りの方法で表現でき、これにより変異または外来遺伝子を検出することが可能です。EIF2B5遺伝子における2つの異なる変異が、赤色と青色の曲線で示されています。これらの変異サンプルは、標準的な野生型曲線と比較して、融解曲線の形状に有意な差があること、または蛍光値の変化があることによって識別されます。単一の胚コレクションにおいて4つの異なる遺伝子型が確認されたこの例は、本手法の有用性と感度を物語っています。習得すれば、この手法は8時間以内に完了させることが可能です。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュの遺伝子型を効率的に大規模スクリーニングするためのHRMAの実施方法について、十分に理解できるはずです。

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、ゼブラフィッシュのテールクリップからのDNA抽出について説明します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの遺伝子型を迅速かつ効率的に解析する方法を実証しています。...

テールクリップからのDNA抽出:ゼブラフィッシュのジェノタイピングに用いる手法

このビデオでは、融解温度分析に基づいて、さまざまな配列長のDNA断片の長さ多型を決定するための高分解能融解PCR技術について説明します。...

変異型DNA配列の配列変動を決定するための高分解能メルティングPCR

高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。...

マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

ゼブラフィッシュは、開発中に DNA 複製タイミングを勉強する体内モデル システムとして最近使用されました。ここでは、プロファイル レプリケーション タイミングにゼブラフィッシュ胚を使用してのためのプロトコルの詳細。このプロトコルは、変異体、個々 の細胞の種類、病モデル、および他の種にレプリケーション...

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

ゼブラフィッシュは、遺伝子編集技術の登場により、特に、生物医学研究における信頼性の高い遺伝モデル有機体として使用されています。幼虫の表現型の場合は、DNA 抽出と遺伝子型同定は挑戦できます。ここでは、尾クリッピング、早ければ 72 時間後受精によるゼブラフィッシュの幼虫、効率的なジェノタイピング手順について述べる.

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

遺伝子編集技術により、研究者はゼブラフィッシュ変異体を生成して遺伝子機能を比較的容易に調べることができます。ここでは、ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーションシグナルの並列的な胚ジェノタイピングおよび定量化を行うガイドを提供する。この公平なアプローチは、in...

ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーション染色のジェノタイピングと定量化

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。...

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

ここでは、ゼブラフィッシュの低存在量タンパク質の可視化に特に有用な、新たに開発および改変された in vivo...

ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

学ぶ高解像度メルト解析を用いたPCRによるゼブラフィッシュの迅速な遺伝子型決定法。Danio rerioを用いて、単一塩基変異や小規模な挿入・欠失を検出し、従来法より高速かつ信頼性の高い遺伝学的スクリーニングを実現します。

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

さらに動画を探す