マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法
November 10th, 2015
高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。
以下の高分解能融解実験の全体的な目標は、個々のサンプルで低濃度で存在する変異対立遺伝子の検出感度を向上させることです。これは、最初にテンプレートを必要な量と濃度に希釈して抽出したDNAを調製することによって達成されます。第2のステップは、フォワードプライマーとリバースプライマーの非対称比率でアッセイを調製し、テンプレートプローブ製品を増やすことです。
反応を調製した後、アニーリング温度は、野生型または変異型テンプレートのいずれかに結合したときのプローブの融解温度の間に設定されます。最後のステップは、適切なHRMプラットフォームで増幅された製品を分析することです。最終的には、変異対立遺伝子増幅バイアスとプローブベースの非対称PCRにより、サンプル中に存在する低濃度で困難なSNP変異をより高感度に検出することができます。
この感度の向上は、集団における突然変異のサーベイランスに有用です。この手法の主な利点は、標準的な高分解能融解法やタックマンジェノタイピングなどの既存の方法と比較して、低濃度で存在する対立遺伝子の感度を高めることができ、また、ゲノム内で互いに近位に位置するSNPのジェノタイピングも可能になることです。しかし、この方法は、マラリア原虫における薬剤耐性の広がりについての洞察を提供することができます。
また、HIVなどの他の感染症タイプの監視や、細胞集団内のまれながん変異体の検出など、他のシステムにも適用できます。手順を実演するのはケイトリン・ダーフィーです。当研究室の技術者です。
高分解能融解またはHRM用のテンプレートは、フィールドサイト研究に参加している患者の血液から直接得られた熱帯熱マラリア原虫サンプルから調製されます。サンプルは、濾紙、迅速検出試験、またはペレット状赤血球サンプルとして保存することもでき、in vitroでの成長に適応した培養も可能です。分析用のいくつかの標準的な実験室株は、マラリア研究および参照試薬リソースセンターから注文できますサンプルは、全血、赤血球、または濾紙から抽出するか、ペレット化された赤血球から直接使用するか、ペレット化された赤血球から直接増幅するために培養することができます。
まず、疾病管理予防センターの手順に従って、薄い塗抹顕微鏡を使用して赤血球のパラを決定します。次に、パラが0.5%を超える赤血球を1〜400に希釈します。TEでは、3マイクロリットルの希釈赤血球が5〜10マイクロリットルの反応ごとに使用されます 1つの変動性により、陽性および陰性のコントロールは常にHRM分析に含める必要があります。
プラスミドまたは配列検証済みのスニップ遺伝子型を陽性トロールとして使用した標準液の希釈液1マイクロリットルあたり10ピコグラムから10ナノグラムを調製します。PCRグレードの水を、増幅反応のテンプレートなしネガティブコントロールとして使用します。この手順は、プライマーとプローブの10 xワーキングストックを準備することから始めます。
同じプロトコルは、96ウェルプレート、384ウェルプレート、8つのチューブストリップ、またはガラスキャピラリーを使用したアッセイにも適用できます。しかし、このデモンストレーションの目的では、96枚のウェルプレートとガラスキャピラリーのみを使用します。この表は、ブロッキングプローブベースのHRMジェノタイピングに推奨される10 x ワーキングストック濃度と最終濃度を示しています。
それぞれに反応混合物を調製します。10 x ワーキングストックのフォワードおよびリバースプライマーとプローブのそれぞれを1マイクロリットル追加します。HRMマスターの4〜5マイクロリットルは、1マイクロリットルのテンプレートとPCRグレードの水を混合し、総反応量は10マイクロリットルです。
各ガラスキャピラリーについても同じことを行います。プレートとガラスキャピラリーを覆います。プレートベースの増幅には光学プレートシールを、キャピラリーベースのシステムにはプラスチックキャップを使用します。
カバー範囲が完全で、プレートとキャップが完全に密閉され、蒸発を防ぐために固定されていることを確認してください。増幅中。サンプルを回転させて気泡を取り除きます。
1、800回G.Spinガラス毛細管で10〜15秒間のピコフージで3分間卓上遠心分離機でプレートをスピンします。反応プレートとガラスキャピラリーをサーマルサイクラーランの標準ブロックプローブまたはMAAB増幅プロトコルにセットします。PCR増幅後、システムソフトウェアインターフェースから融解解析に進みます。
プレートを摂氏40度から80度まで溶かして、プローブとアンプリコンの両方の融解ピークを生成します。ライトサイクラー480上での融解解析の第一歩は、温度観に対する正規化蛍光の負導関数からの正規化である。正規化バーを移動して、プローブの溶融領域を囲みます。
プローブの融解領域は、2つの融解領域のうち低い方の温度です。正規化バーは、メルトピークの基部にある必要があります。正規化後、[calculate groups] を選択して、必要に応じてサンプルをグループに自動的に割り当て、サンプルを特定のグループに手動で再割り当てします。
増幅しなかったサンプル、または融解ピークがギザギザのサンプルを選択します。次に、新しい通話に移動し、否定を選択します。誤分類されたサンプルを選択した残りの場合は、新しいコールに進み、適切なグループを選択して、標準に基づいて各グループに遺伝子型を割り当てる変更の適用をクリックします。
計算されたグループが正しいことを確認したら、グループ化タブでグループ名の編集を選択し、対応する色のボックスに標準の遺伝子型を入力します。たとえば、標準 3D セブンが既知の C 遺伝子型を持ち、グループ 1 にある場合、グループ 1 のすべてのサンプルは遺伝子型 C プレス結果を持ち、遺伝子型はサンプルの横に表示されます。
最後に、結果をTXTファイルとしてエクスポートし、さらにサンプル母集団分析を行います。ライトサイクラー2.0での実行が終了したら、分析を開始する前に、サンプルデータの下にサンプル名と位置を記録し、ネガティブコントロールと融解標準の遺伝子型をラベル付けします。溶融分析を開始するには、分析を選択し、融解曲線分析でジェノタイピングを選択し、プレスします。大丈夫です。
自動グルーピングの感度を上げるには、すべてのサンプルを選択して、融解曲線の表示がプロットされるようにします。ノーマライゼーションバーをプローブの融解ピークの上側境界までスライドさせます。サンプルが正しくグループ化されていることを確認するには、グループ名の下にある各グループを個別に選択します。
すべてのサンプルを選択し、データをコピーしてワークシートに貼り付けることにより、各サンプルの遺伝子型をエクスポートします。温度に対する正規化蛍光の負導関数のプロットは、通常、融解ピークを視覚化し、遺伝子型を決定する最も簡単な方法です。解析ウィンドウをプローブ領域のみに設定すると、特定のSNPに対応するピークが明確に区別されます。
完全一致により、融解ピークが赤で示されます。一方、SNPのミスマッチは、両方の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、灰色で示される融解温度が低くなります。ProbベースのHRM解析では、両方の対立遺伝子をオレンジ色で示された2つのピーク曲線と、赤と灰色で示される単一の対立遺伝子サンプルと一致するピークとして表し、増幅中のイーリング温度を徐々に下げると、ポリゲノムまたはポリ対立遺伝子サンプルの左側のピークで表される変異対立遺伝子にバイアスがかかります。
この変異対立遺伝子増幅バイアスにより、HRM感度は、ポリゲノムまたはポリ対立遺伝子サンプルの1%未満に存在するマイナーな対立遺伝子を検出することができます。この手順を試行する際には、サンプルの品質が重要であることを覚えておくことが重要です。バッファー濃度のわずかな違いにより、HRM曲線がシフトする可能性があります。
コントロールを使用すると、結果を標準化するのに便利です。このビデオを見れば、probベースの非対称PCRと変異対立遺伝子増幅バイアスを使用して、さまざまなサンプルタイプからマラリアSNPを正確かつ高感度に遺伝子型決定する方法を十分に理解できるはずです。
概要
このプロトコルは、低濃度の変異アレル検出における高解像度溶解（HRM）分析の感度を向上させます。DNA準備とアッセイ条件を最適化することで、難しいSNP変異の検出が向上します。
主要な研究要素
科学の分野
- 遺伝学
- 分子生物学
- 病原体監視
背景
- 高解像度溶解分析は、一塩基多型（SNP）を区別します。
- 変異アレル増幅バイアスは検出感度を向上させることができます。
- 薬剤耐性を含む集団の変異のモニタリングに有用です。
- 様々な感染症やがん変異に適用可能です。
研究の目的
- 低濃度の変異アレルの検出感度を向上させる。
- 密接に配置されたSNPのジェノタイピングを改善する。
- 変異監視のための信頼できる方法を提供する。
使用された方法
- 患者サンプルからのDNA抽出の準備。
- 増幅を強化するための非対称プライマーの割合。
- HRMプラットフォームを使用した熱サイクリングと溶解分析。
- 分析における正性および陰性のコントロールの包含。
主な結果
- 低濃度でのSNP変異の検出向上。
- マラリアにおける薬剤耐性のモニタリングへの成功な適用。
- 様々なサンプルタイプでの有効性の実証。
- 結果はさらなる分析のためにエクスポートできます。
結論
- この方法は標準的なHRMよりも感度が大幅に向上します。
- 病気監視の異なる用途に適用可能です。
- 将来の遺伝学研究のための堅固な枠組みを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Enhanced sensitivity in SNP genotyping supports early detection of low-frequency drug-resistant malaria strains, a critical need for surveillance in elimination settings. The method enables reliable genotyping of polygenomic infections, improving the accuracy of resistance marker tracking and parasite population fingerprinting. This capability strengthens predictive confidence in resistance emergence and informs timely public health interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting minor allele variants associated with drug resistance.
- Operational Value: Supports functional target validation through sensitive SNP discrimination in complex genomic backgrounds.
- Predictive Value: Increases confidence in lead identification by reducing false negatives in low-abundance mutation detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring accurate SNP genotyping.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through asymmetric primer optimization and melting curve normalization.
- Scalability: Compatible with 96-well plates, 384-well plates, and capillary systems for high-throughput surveillance workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent SNP monitoring across sample types.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in resistance mechanism attribution by improving detection of minor allele variants.
- Disease-Relevant System: Applicable to Plasmodium falciparum field samples, supporting real-world surveillance relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early SNP detection to lead optimization and preclinical validation, particularly for resistance mechanism studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive detection of resistance-associated SNPs.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through normalized melting peak analysis and group calling.
- Analytics: Provides statistical confidence via group reassignment and genotype calling based on melting curve clustering.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling longitudinal tracking of allele frequency shifts in parasite populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping platform adaptable to other infectious diseases and cancer variant surveillance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in resistance detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across sample types and platforms.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in resistance monitoring, capital efficiency in surveillance programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of interventions based on early detection of emerging resistance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR optimization, melting curve analysis, and genotype calling.
- Dependent on HRM-capable thermal cyclers and normalized fluorescence analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of primer ratios, annealing temperatures, and normalization protocols.
- Adaptation across model systems requires validation of asymmetric PCR conditions for each target SNP.
- Practical limitations include sensitivity to buffer quality and the need for proper negative controls to prevent false positives.
