Name: マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ高解像度融解曲線分析の感度向上法。非対称PCRとプローブを用い、低濃度変異アレルを検出し、マラリア薬剤耐性モニタリングや病原体サーベイランスに応用する。

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著者は、技術開発や研修への支援のためにビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団に感謝します。

注：このプロトコルは、96ウェルプレート、8チューブストリップ、およびキャピラリーベースのシステム（10μlの反応容量）のためのボリュームと濃度を含み、しかしながら、HRMはまた、それに応じてすべてのボリュームをスケーリングすることにより5μlの反応体積で384ウェルプレートベースのシステムで実行することができます。ほとんどのシステムの検出範囲は、10 ngの鋳型DNAには10pgです。 1.テンプレートを準備します<ol><li>現場調査に参加した患者から得られた全血として格納され、赤血球をペレット化し、またはろ紙上の血液から直接、熱帯熱マラリア原虫のサンプルを得ます。 注：サンプルはまた 、インビトロで成長する培養に適合させることができます。分析のためのいくつかの標準的な実験室株は、マラリア研究およびリファレンス試薬リソースセンター（MR4から注文することができ、サンプルをペレット化し、赤血球または培養物から直接使用するか、または全血、赤血球、またはろ紙から抽出することができます。 </li><li>から抽出したDNAろ紙または培養適合株 注意：HRMは、塩濃度に敏感です。可変抽出方法による濃度差が大きく溶融温度に影響を与えることができます。特定の最終バッファは成功のための重要な要因ではありませんが、標準的な一般的な溶出または再懸濁バッファー（ すなわち 、水、1×TE [&#39;低テ」または「DNA懸濁液バッファー」：10mMのトリス-Cl、0.10 mMのEDTA]を使用しますか、 1×TE [10mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA]）全てのサンプルが異常なまたは矛盾融解曲線を回避するため。 <ol><li>各10μlの反応のための標準的なテ、TE、または水に10 pgの-10 NGあたりμLのテンプレート希釈液を調製します。 </li></ol></li><li>ペレット化した赤血球からの直接増幅<ol><li>薄塗抹顕微鏡を用いて赤血球の寄生虫血症を決定 注：感染した赤血球の寄生虫を決定するための方法は、疾病管理予防センター（CDC）から入手可能であります。http：<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> PCRグレードの水、TEで400、またはTE：0.5％1上記の寄生虫血症を希釈します。それぞれ5〜10μlの反応のために3μLを使用してください。 </li></ol></li><li>コントロール 注：HRM配列が集団12に変異体を検出するための遺伝子走査のために使用することができます。しかし、正確なジェノタイピングは標準シーケンス検証済みSNPを含むことが尋問されている必要があります。既知の遺伝子型を使用することができるとともに、プラスミド構築物またはマラリアは隔離します。ほとんどのアプリケーションでは、3D7（MR4 MRA-151）は、野生型対照として使用します。原因間のランの変動に、常に正と負のコントロールが含まれています。 <ol><li>陽性対照は： - 配列検証済みSNP遺伝子型と1μlのプラスミドの希釈液または標準あたり10 ngの10頁を準備します。 </li><li>増幅反応のための無鋳型対照（NTC）として使用するPCRグレードの水：ネガティブコントロール。 </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2。PCR増幅<ol><li>反応混合物を準備します<ol><li> （オプション）ミネラルオイルオーバーレイ。注：一部のHRMシステムは、スタンドアロンの溶融・プラットフォームであり、増幅の間に結露や製品の蒸発を防ぐために加熱蓋を持っていません。 <ol><li>反応混合物をロードする前に、各ウェルプレートに20μlの軽鉱物油を追加します。 </li></ol></li><li>すべてのアッセイの10倍ワーキングストックを準備します<ol><li>推奨10倍作業ストック濃度と同様にブロックされたプローブベースのHRMジェノタイピングのための最終的な濃度は、表1を参照してください。 </li></ol></li><li>反応混合物を準備します<ol><li>プレートまたはチューブ内の各ウェルに、前方に1μlの10倍の作業ストックを追加して、プライマーおよびプローブ、4.0リバース - 10μlの総反応容量のために5.0μlの2.5倍または2.0倍のHRMマスターミックス、1μlのテンプレート、およびPCRグレードの水を。 </li></ol></li><li>カバープレートまたはチューブ<ol><li>光学板Sを使用しますキャピラリーベースのシステム用のプレートベースの増幅のためのEAL、ストリップチューブ・ベース・システム用の光学キャップ、プラスチックキャップ。カバレッジが完了し、プレートやキャップが完全に密封し、増幅中の蒸発を防ぐために固定されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>スピンサンプル<ol><li>スピンプレート1800×gで3分間、気泡を除去し、鉱油が使用される場合、油相と水相とを分離します。 </li></ol></li></ol></li><li>増幅プロトコール<ol><li>サーマルサイクラーで反応プレートまたはチューブを置きます。ファイル名を指定して実行標準ブロックされたプローブまたはMAAB増幅プロトコール（それぞれ表2、表3）。これらの方法の間のアニール温度の違いに注意してください。 </li></ol></li></ol> 3. HRM解析<ol><li>融液<ol><li> PCR増幅した後、分析を溶融に進みます。内蔵されていません増幅スタンドアロン溶融システム（ 例えば 、BioFire防衛LightScannerシステム）については、再HRM機器におけるサーマルサイクラーと場所から増幅プレートを移動します。プローブとアンプリコンの両方の融解ピークを生成するために80°C - システムソフトウェアインターフェースから、40からプレートを溶かします。 注：溶融および分析時間を節約するために、溶融ウィンドウは単にプローブ又は単位複製配列融解領域のための温度範囲をカバーするように短くすることができます。必要に応じて溶融した後、プレートおよびチューブは再溶融することができ、-20℃または4℃で保存しました。クラッキングからチューブを防ぐ唯一の4℃での保存のガラス管。 </li></ol></li><li>メルト分析<ol><li>陰性サンプルを削除<ol><li>解析ソフトの中では、増幅またはそれはギザギザの融解ピークを持っていなかったさらなる分析試料から取り除きます。注：個々の実行ファイルの解析のモードを選択した後、機器は自動的にグループ正と負のサンプルを。各サブセットの遺伝子型を決定する前に、ユーザーが手動で呼び出しを変更することができます。 <ol><li>融点のいずれかから曲線または融解ピークビュー、曲線を右クリックし、それらを選択するために除去されます。誤分類されたサンプルを選択した後、適切なグループを選択し、クリックして &quot;、新しいコール」に進んで「変更を適用します。」 </li></ol></li></ol></li><li>ノーマライズ<ol><li>温度（-dF​​ / DT）（ &#39;差異曲線&#39;）ビューに関して正規化蛍光の負の微分から、プローブの溶融領域を囲む正規バーを移動します。 注：プローブは、領域が2溶融領域のより低い温度で溶融します。正規のバーは、溶融ピークのベースにする必要があります。 </li></ol></li><li>グループを計算します<ol><li>正規化した後、自動的にグループにサンプルを割り当てるために「計算グループ」を選択します。 特定のグループに必要な場合は、手動で再割り当てサンプル。 注：一部の解析ソフトウェアを変更することはできません高感度のしきい値があります。これらの場合において、複数のoftwareは、視覚的に別のものに属す​​る別のグループにサンプルを割り当てることができます。 </li></ol></li><li>遺伝子型の割り当て<ol><li>標準（陽性対照）に基づいて、グループごとに遺伝子型を割り当てます。 <ol><li> （、正しい変化が誤分類サンプルを選択し、「新しいコール」の横にあるドロップボックスから右のグループを選択してグループ化]タブの下で行われていない場合）、ユーザは計算されたグループが正しいことを確認した後、「編集グループ名を選択グループ &quot;タブ&quot;の下に &quot;。 </li><li>対応する色付きのボックスに標準の遺伝子型を入力します（標準3D7は、既知の遺伝子型を持っており、赤のグループにある場合、例えば、赤のグループは、遺伝子型Aを有し）。 &quot;OK&quot;を押して、結果を保存します。 </li></ol></li></ol></li><li>結果のエクスポート<ol><li>輸出遺伝子型は、さらにサンプル集団の分析のためのスプレッドシートとして呼び出します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization+report+2013%22">World Health Organization report 2013</a>. , 1-286 (2013).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

連続HRMはPCR後の分析ステップです。従って、サンプルおよびアッセイセットアップは、高解像度融解工程中に二本鎖の一本鎖DNAへの移行を追跡するために使用される蛍光インターカレート色素の追加の取り込みと、標準的なPCRプロトコールと同様です。成功したHRM分析のための単一の最も重要な要因は、強固なPCR産物です。アッセイ設計が鍵であり、HRMアッセイ設計に最適化されたいくつかのツールは、市販品として、オンライン13可能です。 〜20塩基対を伴う80-150塩基対のアンプリコンの長さは、プローブ領域内のSNPだけでなく、複数のSNPのハプロタイプを区別するために、SNPまたは関心の仕事最良のSNPの上の中心のプローブをブロックしました。プローブは、増幅の間に伸長を防ぐれ、3 &#39;末端にC3スペーサーまたは2塩基対ミスマッチの3&#39;のいずれかを使用してブロックすることができます。プローブは、ワトソンクリックまたはテンプレート鎖と一致するように設計することができます。選択許容可能な融解ピークを生成するプローブ設計を決定するために実験的なテストに依存します。フォワード過剰又はリバースプライマーは、ブロックされたプローブにアニールする一本鎖増幅産物を生成するために使用されます。プローブはフォワード鎖配列が含まれている場合、次に、プライマーが過剰に使用される逆一般的に1：5の比率、およびリバース鎖に一致するプローブに対するその逆。 同様に、HRMは、十分な堅牢なPCR産物に最適です。 PCR反応の最適化は、最適なアニーリング温度を決定するために、勾配PCR及びアガロースゲルまたはバイオアナライザー分析を必要とします。鋳型濃度は、鋳型濃度13を増加させるために 、低プライマー濃度とサイクル数を使用して、すべてのターゲットの前増幅、バイアスされた多重化された増幅のような方法を用いて増加させることができます。 楽器のほんの一握りは、MAABと互換性があります。私使用されるガラスキャピラリー管の熱特性nは、これらのシステムは、この方法を容易にします。毛細血管の小内径並びにガラスを通して急速な熱伝達は、プラスチックの断熱特性に起因するアニーリングおよび変性サイクル間の遅い遷移速度を持つ標準的なPCRプラスチック製品、より厳しい温度制御を提供します。この方法では、検出感度は、野生型と突然変異対立遺伝子10の混合物中の変異体対立遺伝子の1％未満に2-5％から減少させることができます。 HRMは、癌遺伝子変異体のための感染症サーベイランスからのスキャンに、設定や多数の種々の用途にSNP遺伝子型決定のために、容易な、効率的、かつ経済的なツールです。このようなナノロシュとライトサイクラーシステム（480及び96）と同様に、標準的な増幅、リアルタイム、およびコピー数の機能に加えて、エコリアルタイムPCRシステムオファーHRMなどのいくつかの他の楽器、。高スループット機を使用して、HRMのバーコードは、コストレすべての試薬や消耗品など、私たちの手でのアッセイにつき$ 0.50より秒。 ここで説明する文脈では、フィールドベースのアプリケーションは、減少人口の多様性、インポートされた寄生虫の種類の検出、および減少した薬剤感受性と関連するSNPの出現と普及など、マラリア対策の取り組み、関連付けられた変更のためのリアルタイムの人口の監視を可能にします。この方法に改良がマラリアの除去と根絶に向けた進捗状況を通知するための有用な追加の感度を提供します。

マラリアコントロールと撲滅で新たな関心にもかかわらず、マラリアはサハラ以南のアフリカ1において、特に子供、感染の危険性のある世界の人口の半分近く、年間以上55万死亡で、世界的な負担のまま。 これらの新しいコントロールと撲滅プログラムは、配列決定マラリア原虫の大規模な数字で、ゲノムルネッサンスでサポートされていると減少し、薬剤感受性に関連する変異のために分析されている、人口特性2,3のため、毒性を増加させました。一塩基多型（SNP）は、最も一般的に同定された遺伝的変異体4-7の間です。 ポータブルSNPの遺伝子型決定法は、オンサイトとリアルタイム人口監視および追跡8提供しています。個々の寄生虫をフィンガープリントに加えて、「分子バーコード」はまた、対立遺伝子頻度の劇的な時間的なずれを検出するために使用されますだけでなく、分散などの感染9の人口規模と複雑さに有効。 有益なSNPのこのセットは簡単に多くのジェノタイピング・プラットフォームに適合されているが、高解像度は（HRM）の分析は特に敏感と簡単な操作と低コストで新たな変異の検出は、配列決定及び他のと比べて研究を、ベースのフィールドによく適している溶融しますアプローチは資源の乏しい設定で魅力的です。 HRMは、蛍光色素を組み込んだ標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で始まります。ポストPCR融解分析は、ピークアンプリコンの融解温度を決定します。短いアンプリコン内の単一のSNPの差は、実質的なピーク融解温度（Tm）の違いをもたらすことができます。 この方法のいくつかの改良が（クラスIV（AT）のSNPを含むSNPを区別し、存在する複数の対立遺伝子を有する試料中のマイナーな突然変異対立遺伝子を検出するために、より良い遺伝子型判定の解像度を提供するポリGenomic感染）。まず、アッセイは、異なる濃度で存在するプライマーを順方向および逆方向に加えて、SNP領域の上に中心短いプローブを組み込みます。これらのブロックされたプローブは、プローブによるテンプレート産物の産生を増加させる非対称のプライマー濃度にPCR中に増幅するが、過剰に産生さ鎖に結合しています。過剰鋳型鎖に結合したプローブからなるこれらの独立した二本鎖アンプリコンは〜20〜30塩基対です。彼らは大幅に10のミスマッチ単一または複数の基地プローブ-テンプレートに関連付けられてはるかに大きなTmの差に全体のアンプリコン（80〜150 bp）のリード線に比べて長さを減少させました。 第二に、変異対立遺伝子増幅バイアス（MAAB）はバイアスに反応アニール温度polygenomic感染の低い比率で存在する突然変異対立遺伝子に向かって反応を低下させます。アニール温度は、完全に一致した（野生型）のTMSおよび不一致（変異体）プローブの間に設定されています秒。この温度では、野生型対立遺伝子の結合は、増幅は、このように両方の単一のサンプル10内に存在する変異対立遺伝子の増幅に向けて付勢、そのミスマッチ同等に比べて阻害されるに十分に安定です。 これらのHRMの改良では、この技術が起源と南米11と1未満に存 ​​在する新たな変異、順番にすぐ隣同士に配置された複数のSNPの分化、および変異の検出に流行感染症に関連する寄生虫の身元の追跡を可能にしましたpolygenomicサンプル10における対立遺伝子の％。 感度の増加は、事前に消去状態と新興薬剤耐性のリスクがあるものに接近する地域では特に重要です。迅速かつ簡単にオンサイト感受性低下に関連するインポート寄生虫やSNPを同定する能力は、サーベイランスと制御プログラムについての通知しますその実装と増加したマラリア撲滅と排除の努力のための識別のホットスポットの有効性。このプロトコルは、増加したHRMジェノタイピング感度のためブロックされたプローブベースとMAABのための方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>LightScanner Master Mix</td><td>BioFire Defense</td><td>HRLS-ASY-0003</td><td></td></tr><tr><td>BioFire Defense プレートベースの HRM システム用</td><td>軽鉱物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td></tr><tr><td>TE</td><td>Teknova</td><td>T0226</td><td></td></tr><tr><td>Te</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td>TE バッファー EDTA</td></tr><tr><td>PCR グレードの水</td><td>Teknova</td><td>W3330</td><td></td></tr><tr><td>マラリア原虫熱帯熱マラリア標準液</td><td>MR4</td><td>MRA-151, 156, 205, 330 MR4.org</td><td>無料のゲノムDNA</td></tr><tr><td>ライトスキャナーを提供 プライマーデザインソフトウェア</td><td>HRMアッセイデザインのための</td><td>商用</td><td></td>ソフトウェア</tr><tr><td>LightCycler 480 高解像度 融解マスターミックス</td><td>ロシュ</td><td>4909631001</td><td>LightCycler-480、-96、ナノで使用するため 2倍濃度</td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>アジレント</td><td>G2938A</td><td>Agilent 2100 バイオアナライザー</td></tr><tr><td>LightCycler 2.0</td><td>ロシュ</td><td>3531414001</td><td>MAAB</td></tr><tr><td>LightCycler Nano</td><td>ロシュ</td><td>6407773001</td><td>ストリップチューブベースのHRMおよび増幅</td></tr><tr><td>LightCycler 96</td><td>ロシュ</td><td>5815916001</td><td>ストリップチューブおよびプレートベースのHRMおよび増幅</td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>ロシュ</td><td>5015278001</td><td>プレートベースのHRM(96および384-ウェルプレート)および増幅</td></tr><tr><td>LightScanner-96</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0011</td><td>プレートベースのHRM(96ウェル)&nbsp;</td></tr><tr><td>LightScanner-384 BioFire</td><td>Defense</td><td>LSCN-ASY-0001</td><td>プレートベース HRM (96 ウェル)</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>HRM 用 96 ウェルプレート (LightCycler</td></tr><tr><td>384 ウェルプレート</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td>HRM 用 384 ウェルプレート (LightCycler)</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-9665&nbsp;</td><td>HRM(LightScanner)用96ウェルプレート</td></tr><tr><td>384ウェルプレート</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-3865&nbsp;</td><td>HRM(LightScanner)用384ウェルプレート</td></tr><tr><td>LightCycler 8チューブストリップ(クリア)</td><td>HRM用Roche</td><td>6327672001</td><td>ストリップチューブ(Light Cycler 96およびLight Cycler Nano)</td></tr><tr><td>LightCyclerキャピラリー(20 &mu;l)</td><td>HRM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学プレートシール</td><td>ロシュ</td><td>4729757001</td><td>他のブランドのための</td></tr>ロシュ4929292001キャピラリーも動作します</tbody></table>

マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

撲滅活動の数十年にもかかわらず、マラリアは世界的な負担のまま。地域除去し、グローバル撲滅の最近の新たな関心は、抗マラリア薬に対する感受性の低下に関連する地理的集団の特性だけでなく、変形を含むマラリアの原因とマラリア原虫寄生虫種、約増加ゲノム情報を伴っています。 一つの共通の遺伝的変異、一塩基多型（SNP）は、寄生虫の遺伝子型決定のための魅力的な標的を提供しています。これらのマーカーは、薬剤耐性マーカーを追跡するならず、薬物または他の選択的圧力下でマーカーを用いて寄生虫集団を追跡するだけでなく、有用です。 SNPの遺伝子型決定法は、薬物耐性を追跡するだけでなく、特にeliminatに近づい地域におけるマラリアコントロールの努力に応じて、人口の監視のため、個々の寄生虫を指紋する能力を提供しますイオン状態。 有益なSNPは、特定の遺伝子型決定技術にとらわれないことが確認されているが、高解像度融解（HRM）分析は、フィールドベースの研究に特に適しています。単一標識プローブの個々のSNPを必要とし、複数のゲノム（polygenomic）を含有する試料中のSNPを検出するために、せいぜい10％の感度を提供し、標準的な蛍光プローブベースの方法に比べて、HRMは、2〜5％の感度を提供しています。マイナーアレルの増幅に向けて、このようなブロックされたプローブおよび非対称のプライマー濃度だけでなく、バ​​イアスPCRに増幅アニーリング温度の最適化などのHRMへの変更、さらにHRMの感度を高めます。感度の向上は、特定のアッセイに依存するが、我々は、マイナーな対立遺伝子の1％未満に検出感度が増加しています。 マラリア撲滅に近づい地域では、新興またはインポート薬剤耐性の早期発見は、広報のために不可欠ですOmpT応答。同様に、polygenomic感染を検出し、不可解な地元の貯水池からのインポート寄生虫の種類を区別する能力は、制御プログラムに通知することができます。 この原稿は、患者サンプル中のpolygenomic感染を識別するために、その感度を向上させる高解像度融解技術への変更について説明します。

データは、解析ソフトウェア及び機器に応じて、いくつかの異なる方法で視覚化することができます。一般的に、温度の結果に対する温度（-dF​​ / DT）に対して正規化した蛍光の負の導関数のプロットは、融解ピークを可視化し、遺伝子型を決定するための最も簡単です。 完全溶融ウィンドウ（40℃〜80℃）の両方のアンプリコンおよびプローブ融解領域になります。 図1両方の領域のための正規化された融解ピークの一例を示しています。特定のSNPに対応するピークの明確な差別でちょうどプローブ領域の結果を分析ウィンドウを設定する（ 図2）。 プローブベースの分析は、ホモ接合のSNPのピーク（ 図3）に一致融解温度を有する個々のピークとして両方の対立遺伝子の存在を示しています。 図4はそのprogressiを示していますvely混合対立遺伝子（ 図4B）の集団での変異対立遺伝子のための感受性の増加、その結果、変異対立遺伝子（左側のピーク）（ 図4A）の偏りに増幅（MAAB）の結果の間にアニール温度を低下させます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> 図1.プローブとアンプリコン融解領域。ワイドの両方のプローブ（より低い温度）で溶融ウィンドウ結果と分析することができるアンプリコンの融解ピークを超える温度に対する正規化された蛍光の負の導関数をプロットします。 （ダニエルズらから適応DOI：10.1128 / AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2.プローブ融解ピークのSNPの不一致は（グレー）より低い融解温度を有する。パーフェクトマッチ（通常は野生型対立遺伝子）は、より高い融解ピーク（赤）になる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> 図3. Polygenomic融解ピーク。両方の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、プローブベースのHRM解析は、単一の対立遺伝子サンプル（赤とグレー）と一致したピークを持つ2つのピーク曲線（オレンジ色）のように両方の対立遺伝子を表しています。 （ダニエルズらから適応DOI：10.1128 / AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">より大きいVを表示するには、こちらをクリックしてください</a>この図のERSION。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> 図4.変異対立遺伝子増幅バイアス（MAAB）。A.次第に増幅アニーリング温度を低下させることがpolygenomicまたはpolyallelic試料中の変異体（より低い温度）対立遺伝子に対応するピークに向かって融解ピーク反応を付勢します。 B. MAABはpolygenomicまたはpolyallelicサンプル中の1％未満で存在するマイナー対立遺伝子を検出するために、HRMの感度になります。 （パートBはダニエルズらDOIから適応：10.1128 / AAC.05737-11） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> プローブベースの高解像度融解増幅反応の表1.セットアップ。 <table><tbody><tr><td>成分</td><td>再あたりの体積アクション（96ウェルプレートおよびキャピラリーチューブ） </td><td>反応あたりのボリューム（384ウェルプレート） </td><td>最終濃度</td></tr><tr><td> HRMマスターミックス</td><td> 4-5μL </td><td> 2〜2.5μlの</td><td> 1× </td></tr><tr><td> 10×過剰プライマー</td><td> 1μL </td><td> 0.5μlの</td><td> 0.50μM </td></tr><tr><td> 10×その他のプライマー</td><td> 1μL </td><td> 0.5μL </td><td> 0.1μM </td></tr><tr><td> 10倍のプローブ</td><td> 1μL </td><td> 0.5μlの</td><td> 0.40μM </td></tr><tr><td> PCRグレードの水</td><td> 1-2μL </td><td> 0.5-1μL </td><td></td></tr><tr><td>テンプレートDNA </td><td> 1μL </td><td> 0.5μlの</td><td> 0.01〜10 ngの/μL </td></tr><tr><td></td><td> 10μlの</td><td> 5μL </td><td></td></tr></tbody></table> 表2 StandarD高解像度融解増幅条件。 <table><tbody><tr><td>温度</td><td>時間</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 95°C </td><td> 120秒</td></tr><tr><td rowspan="2"> 45サイクル</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 68°Cの* </td><td> 30秒</td></tr><tr><td rowspan="2"> 1サイクル</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 28°C </td><td> 30秒</td></tr></tbody></table> *この温度は、アンプリコンに依存します 変異対立遺伝子の増幅偏り表3.増幅条件。 <table><tbody><tr><td>温度</td><td>時間</td><td>サイクル</td><td>ランプ速度</td><td>取得モード</td><td>分析モード</td></tr><tr><td>変性</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td><td> 1 </td><td> 20 </td><td>なし</TD&gt; <td>なし</td></tr><tr><td rowspan="2">サイクル</td><td> 95°C </td><td> 2秒</td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td>なし</td><td rowspan="2">定量</td></tr><tr><td> 56°Cの* </td><td> 15秒</td><td> 20 </td><td>シングル</td></tr><tr><td rowspan="3">融液</td><td> 40°C </td><td> 0秒</td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td> 45°Cの* </td><td> 0秒</td><td rowspan="2">連続</td><td rowspan="2">融液</td></tr><tr><td> 90°Cの* </td><td> 0秒</td></tr></tbody></table> *この温度は、アンプリコンに依存し、MAABを行う際に削減されます

高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

以下の高解像度融解（HRM）解析の全体的な目的は、個々のサンプル中に低濃度で存在する変異アレルに対する検出感度を高めることです。これはまず、テンプレートを必要な量および濃度に希釈して抽出DNAを調製することで達成されます。第2のステップでは、テンプレートプローブ産物を増加させるために、フォワードプライマーとリバースプライマーを非対称な比率で配合してアッセイを調製します。反応液を調製した後、アニーリング温度を、プローブが野生型または変異型のいずれかのテンプレートに結合した際の融解温度の中間に設定します。最終ステップとして、増幅産物を適切なHRMプラットフォームで解析します。最終的に、変異アレル増幅バイアスとプローブベースの非対称PCRにより、サンプル中に低濃度で存在する検出困難なSNP変異をより高感度に検出することが可能になります。この感度の向上は、集団における変異監視に有用です。標準的な高解像度融解分析やTaqManジェノタイピングなどの既存手法に対する本手法の主な利点は、低濃度で存在するアレルに対する感度を高められる点、およびゲノム上で互いに近接して位置するSNPのジェノタイピングが可能になる点にあります。また、本手法はマラリア原虫における薬剤耐性の拡大に関する知見を得るためにも活用できます。また、HIVなどの他の感染症の監視や、細胞集団における稀ながん変異の検出など、他のシステムにも適用可能です。本手順の実演は、当研究室の技術者であるCaitlin Durphyが行います。高解像度融解（HRM）分析用のテンプレートは、フィールドサイトでの研究に参加している患者の血液から直接採取したPlasmodium falciparumサンプルから調製します。サンプルはろ紙や迅速診断テストに保存するか、赤血球ペレットとして保存することができ、またin vitroで増殖させるために培養適応させることも可能です。分析用の標準的なラボ株は、マラリア研究・参照試薬リソースセンターから注文できます。サンプルは全血、赤血球、またはろ紙から抽出するか、赤血球ペレットまたは培養物から直接使用して、赤血球ペレットからの直接増幅に利用します。まず、アメリカ疾病予防管理センター（CDC）の手順に従い、薄層塗抹標本顕微鏡法を用いて赤血球の寄生率（para）を決定します。寄生率が0.5%を超える赤血球は、その後1対400に希釈します。TE緩衝液中において、1回の反応（5〜10 µL）につき、希釈した赤血球を3 µL使用します。陽性コントロールと陰性コントロールの間に変動があるため、HRM解析には常に両方のコントロールを含める必要があります。プラスミド、または配列確認済みのsnipジェノタイプを持つ標準物質を、1 µLあたり10 pgから10 ngの濃度で希釈し、陽性コントロールとして調製します。増幅反応のテンプレートなし陰性コントロールには、PCRグレードの水を使用してください。まず、プライマーおよびプローブの10倍濃度のワーキングストックを調製することから本手順を開始します。このプロトコルは、96ウェルプレート、384ウェルプレート、8連チューブストリップ、またはガラスキャピラリーを用いたアッセイにも適用可能です。ただし、本デモンストレーションでは、96ウェルプレートとガラスキャピラリーのみを使用します。この表は、ブロッキングプローブを用いたHRMジェノタイピングにおける、推奨される10倍濃度のワーキングストック濃度および最終濃度を示しています。それぞれのウェルに反応混合液を調製します。10倍濃度のワーキングストックのフォワードおよびリバースプライマーとプローブを各1 µLずつ、HRMマスターミックスを4〜5 µL、テンプレートを1 µL、そしてPCRグレードの水を用いて、合計反応容量を10 µLにします。各ガラスキャピラリーに対しても同様の操作を行います。プレートとガラスキャピラリーに蓋をします。プレートベースの増幅には光学プレートシールを、キャピラリーベースのシステムにはプラスチックキャップを使用してください。カバーが完全に覆われていること、および蒸発を防ぐためにプレートとキャップが完全に密閉・固定されていることを確認してください。増幅の際、サンプルを遠心分離して気泡を除去してください。卓上遠心機を用いて、プレートを1,800 ×gで3分間遠心分離します。ガラスキャピラリーはピコフュージを用いて10〜15秒間遠心分離します。反応プレートとガラスキャピラリーをサーマルサイクラーにセットし、標準的なブロッキングプローブまたはMAAB増幅プロトコルを実行します。PCR増幅後、システムソフトウェアのインターフェースから融解曲線分析に進みます。プレートを40 °Cから80 °Cまで加熱溶解し、プローブとアンプリコンの両方の融解ピークを算出します。LightCycler 480における最初の融解解析ステップは、温度に対する正規化蛍光強度の負の微分値に基づく正規化です。正規化バーを移動させ、プローブの融解領域を囲むように設定してください。プローブ融解領域は、2つの融解領域のうち低温側の領域です。ノーマライゼーションバーは、融解ピークの基底に配置する必要があります。ノーマライゼーション後、「calculate groups」を選択してサンプルをグループに自動的に割り当てるか、必要に応じて特定のグループにサンプルを手動で再割り当てしてください。増幅しなかったサンプルまたは融解ピークが不規則なサンプルを選択します。次に、「new call」に移動し、「negative」を選択します。誤って分類された残りのサンプルを選択した後、「new call」に移動し、適切なグループを選択して「apply change」をクリックします。標準試料に基づいて、各グループのジェノタイプを割り当てます。計算されたグループが正しいことを確認した後、「grouping」タブにある「edit group names」を選択します。対応する色のボックスに、標準試料の遺伝子型を入力してください。例えば、標準試料 3D seven の遺伝子型が C であることが分かっており、それがグループ 1 に属している場合は、グループ 1 のすべてのサンプルの遺伝子型を C とします。「results」を押すと、サンプルの横に遺伝子型が表示されます。最後に、さらなるサンプル集団分析のために、結果をTXTファイルとしてエクスポートします。light cycler 2.0でのランが終了後、「sample data」の欄にサンプル名と位置を記録します。分析を開始する前に、ネガティブコントロールおよび融解標準品のジェノタイプにラベルを付けます。「analysis」を選択し、「melting curve analysis」の下にある「genotyping」を選んで「Okay」を押し、融解分析を開始します。自動グループ化の感度を高めるには、すべてのサンプルを選択して融解曲線プロットに表示させます。標準化バーをプローブ融解ピークの上限までスライドさせます。グループ名の下にある各グループを個別に選択し、サンプルが正しくグループ化されていることを確認してください。すべてのサンプルを選択し、データをコピーしてワークシートに貼り付けることで、各サンプルのジェノタイプをエクスポートします。正規化された蛍光の温度に対する負の微分プロットは、通常、融解ピークを可視化してジェノタイプを判定するための最も簡単な方法です。解析ウィンドウをプローブ領域のみに設定すると、特定のSNPに対応するピークを明確に区別できます。完全一致の場合は、赤色で示されるより高い融解ピークになります。一方、サンプル中に両方の対立遺伝子が存在する場合、SNPのミスマッチは灰色で示されるより低い融解温度となります。確率ベースのHRM解析では、両方の対立遺伝子がオレンジ色の2つのピーク曲線として表され、単一対立遺伝子サンプルのピークは赤色と灰色で示されます。増幅中に融解温度が漸次低下すると、ポリゲノミックまたはポリアレルサンプルにおいて、左側のピークで表される変異対立遺伝子へのバイアスが生じます。この変異アレル増幅バイアスにより、ポリゲノミックまたはポリアレリックサンプル中に1%未満で存在するマイナーアレルの検出に対するHRMの感度が向上します。この手順を行う際は、サンプルの品質が極めて重要であることを忘れないでください。バッファー濃度のわずかな違いがHRM曲線を変動させる可能性があります。コントロールの使用は、結果を標準化するための有用な方法です。このビデオを視聴することで、プローブベースの非対称PCRと変異アレル増幅バイアスを利用して、さまざまなサンプルタイプからマラリアのSNPを正確かつ高感度にジェノタイピングする方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

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