逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

次の実験の全体的な目標は、解重合微小管の末端を持つタンパク質分子とタンパク質被覆ビーズの動きを研究することです。これは、再利用可能なフローチャンバーをクリーンなサイズのカバースリップで組み立てることによって達成されます。次に、微小管の種子を調製し、カバースリップに付着させて微小管を核形成し、光破壊キャップで一時的に安定化します。

次に、GFP標識タンパク質またはタンパク質被覆ビーズをフローチャンバーに導入し、セグメント化された微小管に結合します。マイクロタブの解重合は、フォトアブレーションによってキャップを取り外すことによってトリガーされます。画像をCHで解析し、標識されたタンパク質がチップトラッキング挙動(解重合微小管の末端に沿った動き)を示すかどうかを判断します。

この技術の主な利点は、高い時間分解能と特別な分解能で微小管化をトリガーできることです。この手法の視覚的なデモンストレーションは重要です。プロトコールは、超音波ミリングを使用したフローチャンバーの準備と組み立てから始まります。

通常の顕微鏡スライドを2つの溝を持つように変更します。溝を14mm離します。1ミリメートルの差出量があり、これは正方形の22ミリメートルのカバースリップを使用して組み立てられたチャンバーに最適です。

次に、スライドの各溝に長さ100mmのポリエチレンチューブを配置し、溝の内側の端に約5mmのオーバーハングを残します。シアノアクリレート接着剤で溝の内側にチューブを固定し、チューブを溝の内側に完全に埋め込みます。こぼさないようにエポキシ接着剤で溝を慎重に埋めます。

一日乾かします。翌日。鋭利なカミソリの刃を使用して、固化した接着剤を各取り付け部位の遠位端から3〜4ミリメートルのところで切断します。

スライドの中央に近位にあるパーツを取り外します。チューブは溝に留まり、カットはチューブ開口部のある平らな面を作る必要があります。次に、シリンジに水を入れ、チューブが正常に機能しているかどうかをテストします。

液体が自由に流れる場合は、溝の外側の端に直径約5ミリメートルのエポキシ接着剤を一滴垂らし、約1日間乾燥させます。したがって、完成したフローチャンバーは耐久性があり、何ヶ月も繰り返し使用することができます。この3時間のプロトコルでは、12枚のカバースリップを準備します。

ヒュームフード、セラミックカバースリップホルダー1個、15ミリリットルの染色瓶3個、蓋付きの250ミリリットルのガラス瓶1個が必要です。染色ジャーは、4つの通常の番号1 22ミリメートルカバースリップを積み重ねて収める必要があります。まず、事前に洗浄および乾燥させたカバースリップを12枚、セラミックホルダーに積み重ねます。

ジャーにプラス1の反発シレン溶液を入れ、スライドをゆっくりと下げます。瓶を閉じ、室温で5分間インキュベートします。均一なカバースリップ文明を確保するための最も重要なステップは、セレーネ溶液でのカバースリップのインキュベーション中に水の痕跡を避けることです。

このステップは、マイクロチューブ種子をしっかりと取り付けるために不可欠です。プロトコルの後半では、カバースリップの準備ができたら、セラミックホルダーを瓶から取り外します。次に、テフロンコーティングされたピンセットを使用して、カバースリップをセラミックホルダーからメタノール充填された染色ジャーに個別に移します。

次に、3つの瓶を、金属製またはガラス製の台座が入ったソニックバスの貯水池に入れます。水位は瓶の高さの3分の2にすべきで、瓶を70ワットで20分間超音波処理します。超音波処理中は、5分ごとにメタノール溶液を交換してください。

超音波処理が完了したら、すすぎ、カバーを脱イオン水で10回きれいに滑ります。サイロ化が適切に機能した場合、カバースリップは乾燥しているように見えます水から取り外すと、見た目に関係なく、残留水を完全に取り除きます。窒素ガスの移動を使用して、乾燥したカバーは窒素乾燥の密封可能な容器に滑ります。

カバースリップの間にインターレイキムが拭きます。この方法で、室温で数週間保存できます。このプロトコルには、1〜2時間、1つのフローチャンバーと準備されたG-M-P-C-P-P安定化マイクロチューブシードが必要です。

まず、フローチャンバーを組み立てます。用意したスライドの中央5mm幅に両面テープを2枚貼り、カバースリップをテープにしっかりと押し付けます。1ミリリットルのシリンジを使用して、チューブを介してチャンバーに100マイクロリットルのB rrb 80溶液を充填します。

次に、小さなプラスチック製のペトリ皿の上に2色のクイックキャストシーラントの小さな滴を絞ります。つまようじですばやくしっかりと混ぜます。緑色に変わります。

カバースリップのすべての端に沿ってシーラントをすぐに塗布します。シーラントがカバースリップの下に深く浸透しすぎていないか確認してください。チューブが詰まっている場合は、シリンジを抜き、チューブを持ち上げてシーラントの漏れを防ぐために穏やかな圧力をかけます 10分後、溶液の流れが制限されていないことを確認してください。

次に、チャンバーを摂氏32度の温めた顕微鏡ステージに移します。溶液を除去するために、チューブの1つをポンプに取り付けます。インレットチューブの自由端を、温かいBRB 80バッファーを入れた0.5mmバイアルに浸します。

ポンプを毎分100マイクロリットルに設定し、必要に応じて、ポンプを使用して気泡をやさしく押し出します。これは手動で行うこともできます。次に、ポンプを使用して30マイクロリットルの温かい抗原抗体をロードします。

ポンプをオフにして、5分間待ちます。すべてのインキュベーション中にポンプをオフにしてください。次に、約100マイクロリットルの温かいb rrb 80でチャンバーを洗浄します。

次に、BRB 80で50マイクロリットルの1%onic F1 27を灌流します。サイロ化されたカバースリップの疎水性表面をブロックするまで10分待ちます。次に、100マイクロリットルの運動性緩衝液でチャンバーを洗浄します。

次に、ポンプ速度を毎分15マイクロリットルに下げ、運動性緩衝液で1〜200〜1〜600に希釈された30〜40マイクロリットルの微小管種子をチャンバーに灌流します。種子を15分間インキュベートし、次いでチャンバーを400マイクロリットルの運動性緩衝液で毎分100マイクロリットルで洗浄し、未結合の物質を除去する。次に、ポンプ速度を毎分30マイクロリットルに下げ、予温した標識なしチューブリン溶液をチャンバーに灌流します。

このプロトコルの最も重要な側面は、気泡を避けることです。調製したばかりのチューブリン溶液を使用し、特にマイクロチューブラーキャッピング中に、プロトコルの正確なタイミングに従うこと。5〜7分間のインキュベーション中に、DIC光学系を使用してマイクロチューブの成長をモニターします。

微小管は通常約10ミクロン成長し、戦前のRumine Tubulin Mixと溶液を迅速に交換し、さらに8〜10分のインキュベーション時間を確保します。チャンバーを100マイクロリットルの運動性緩衝液で毎分20マイクロリットルでよく洗浄し、乱流とヌクレオチド、および可溶性微小管の断片を除去します。次に、GFP標識タンパク質またはタンパク質被覆ビーズの温めた溶液でチャンバーを灌流し、GFPで標識された酵母キネティコ成分DAMのイメージングを進めます。これは、細菌細胞から精製され、チップトラッキングアッセイのポジティブコントロールとして使用されました。

このようなタンパク質は、微小管の解重合末端に沿って、カバースリップに付着したシードに向かって着実に移動します。これらのタンパク質は、対応するグラフ上に斜めの線として表示され、これを分析して先端追跡複合体内のタンパク質分子の数を決定できます。この分析は、テキストプロトコルで詳しく説明されています。

対照的に、チップトラックに失敗したタンパク質は、分解するマイクロ末端で蛍光シグナルの濃縮を示さない。これは、ヒトNDC 80 GFPタンパク質で見られます。タンパク質被覆ビーズと微小管との間の結合は通常非常に強いため、ビーズを顕微鏡チャンバーに添加すると、セグメント化されたカバースリップに付着した微小管に容易に結合します。

ビーズの追跡が処理的である場合、多くの観察を行うことができます。1つの微小管に付着したビーズは、微小管が成長部位の周りをわずかに回転するため、弧のような動きを示しました。安定化キャップが点灯しているときに、種子とビーズから遠位に赤いセグメントが1つだけ見える場合、ビーズは1つの微小管に取り付けられています。

キャップは、キャップが漂白されるまでビーズのような動きに続いてよく見られます 漂白直後のビーズの動きは、微小管の配向と一致して見えます。マイクロチューブが短くなり、ビーズがシードに向かって移動すると、振動のような円弧の振幅が減少します。ビーズが安定した微小管への永続的な付着を形成できない場合。

レーザートラッピングは、TPの存在下でセグメント化されたマイクロチューブ壁上にビーズを発射するためにこの技術を必要としたプラス末端指向キネシンSE Eの異なるタンパク質コンストラクトを持つビーズを使用することができます。これらのビーズは、グラフ上のキャップされたマイクロチューブプラスエンドに向かって急速に移動しました。この動きにより、キャップが破壊された後、キャップに向けられた斜めの線が生じました。緑色の矢印で示されているように、微小管から分離された切り捨てられたスパイタンパク質でコーティングされたビーズ。

対照的に、全長Bタンパク質を持つビーズは、逆方向の動きを維持することができました。これは、微小管のプラスおよびマイナスの端に反対方向の動きによるchmグラフ上のジグザグパターンとして見られます。このビデオを見れば、フローチャンバーを準備し、微小管の分解によって駆動される動きを研究するために、セグメント化された微小管を成長させる方法について十分に理解できるはずです。