Name: 逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学ぶ、微小管の逆アセンブル端部でタンパク質分子やビーズの運動を研究する方法。光分解性キャップを用いて微小管動態を精密に制御し、GFP標識タンパク質のチップトラッキング挙動を解析します。

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著者らは、プロトコルを開発し、するための試薬を提供するための再利用可能なフローチャンバーを設計·製造​​を支援するため、FI Ataullakhanov、N. Dashkevich、N.​​ GudimchukとA. Korbalev数字のために画像を提供するため、N. GudimchukとP.ザハロフに感謝したいと思いますテキスト編集やヒントや議論のためのGrishchukラボの他のメンバーと助けをジゴキシゲニン標識微小管の種、A.ポタペンコを準備します。この作品は、によって部分的にサポートされていましたNIH付与GM R01-098389とキンメル学者でELGにペンシルベニア州マッスル研究所からのパイロット助成金、RFBRは、12 04から00111 - 、13 - 04から40190-Hを付与し、13で-04-40188-H、FI Ataullakhanovに科学幹部会補助金（分子システムインテグレーションおよび分子機序および分子細胞生物学プログラム）のロシア科学アカデミー、NIHは、JRマッキントッシュにGM R01 GM033787を付与し、ドミトリーZimin王朝財団ポスドクフェローシップへVAV

著者らは、開示することは何もありません。

多くの単一分子アッセイは、最近日常大幅に非特異的なタンパク質の付着を低減するために、特別に処理カバーグラスを使用しています。我々はここで説明する手順では、ハワード·ラボ32で開発されたオリジナルのプロトコルの変形例であり、我々はカバースリップをシラン化することであっても蛍光を使用していないDICベースのビーズアッセイ、と努力の価値であることがわかります。このようなカバーガラスに組み付けチャンバは非常にクリーンな表面を示し、可溶性微小管結合タンパク質の存在下で得られた結果は、非常に低いタンパク質濃度が使用される場合は特に、より再現性である。 セグメント化されたMTの成功を調製するための最も重要なステップは次のとおりです。 <ol><li>チューブリン濃度およびインキュベーション時間の最適化（5.1-5.2ステップ）。プロトコルで指定された時間および濃度は、おおよそのものであり、原因チューブリン製剤、チャンバの容積などの違いにより異なる場合があります。 </li><li>特定のタイト核剤カバーガラスへの微小管の取り付け、および</li><...

微小管は高度に細胞構造、細胞運動性、細胞分裂、細胞内輸送および1のために重要である細胞骨格構造が保存されている。これらの動的なポリマーは、GTPの存在下でチューブから組み立て、そして、彼らは自然に成長と2の短縮を切り替える。微小管は、従って、コントラストを高めるために特殊な光学技術は、光学顕微鏡で微小管を観察するために使用されるべきである（直径がわずか25 nm）の非常に薄い。これらのポリマーを用いた以前の研究は、微分干渉コントラスト（DIC）3を使用して動的挙動を調べた。 試験管内でこれと同様の研究は、一般的な実験条件の下で、微小管は、まれにしか解重合に破局し、スイッチを受けていないことを明らかにした一回5〜15分間（この周波数は、28〜32℃で調べた7月15日ミリモル、可溶性チューブリン濃度である）4。異なる技術は、このようにインダクタに提案されている制御された方法でのE微小管脱重合。微小管の短縮は、ここで説明するように、離れて可溶性チューブ5,6を洗浄するレーザ光​​7と微小管を切断するか、またはセグメント化された微小管8を用いてトリガすることができる。セグメント化された微小管だけでなく、確率的に切り替えるポリマーを使用してこれまでの研究は、このような染色体、小胞、およびタンパク質をコーティングしたビーズのような小さな細胞内貨物は、短縮微小管9月13日の端に移動させることを見出した。この現象は、有糸分裂細胞における染色体の動きのための直接含意を持っていると考えられており、基本的なメカニズムは、アクティブな調査14〜16の下に現在されている。 最近では、全反射蛍光（TIRF）顕微鏡などの蛍光ベースの技術は、動的微小管と運動性を研究するために使用されてきたが17-24を終了します。このアプローチの利点は、相互作用の試験を可能にすることである異なる蛍光で標識したタンパク質を用いて、リアルタイムで微小管と微小管結合タンパク質間のS。いくつかのタンパク質複合体は、微小管末端を伸長及び/又は短縮してprocessively移動することが見出された。彼らは、微小管結合タンパク質DAM1 10,12,18、Ska1 19、およびXMAP215 20だけでなく、キネシンモーターKif18A 21,22、MCAK 23およびCENP-Eの24が含まれています。これらのタンパク質は、EB1 25のような古典的な先端追跡タンパク質のそれとは根本的に異なるセッ先端追跡を呈する。 EB1分子および関連パートナーは、安定的に、動的微小管に結合したままでいるように見えるものの、終了、個々の分子は急速に可溶性のプール26を交換するだけ〜0.8秒間、微小管の先端に結合したまま。これとは対照的に、進行的先端トラッカーは、DAM1のように、微小管との旅行が多くミクロンのために終了し、微小管の先端との関連は、男のために最後にすることができます任意の秒数。先端会合時間だけでなく、追跡の結果率は、先端追跡複雑な27を形成する分子の数に強く依存する。より大きなタンパク質のアンサンブルは、通常、はるかに優れた先端トラッカーです。例えば、単離された酵母動原体のような複雑なアセンブリは、微小管に結合されたままでは時間28で終了。いくつかの微小管結合タンパク質、 例えば Ndc80の動原体タンパク質複合体、微小管は、単一分子レベルで終了し、まだNdc80ビード貨物19,29-31の動きを結合する非常に効率的であるとともに追跡することができないことが見出されている。したがって、異なるタンパク質複合体、ならびにそれらの生物学的役割によって先端追尾のメカニズムを理解するためには、先端追跡複合体中の分子の数の関数としての先端トラッキングを調べるために、ならびに決定することが重要であるビーズ貨物の表面に集合的な運動性を発揮するこれらの複合体の能力。 図1A）を用いた実験を準備し、実施するための詳細なプロトコルを提供下。まず、市販のガラススライドは、短いポリエチレンチューブ（プロトコル1）を取り付けるために修飾される。再使用可能な顕微鏡流チャンバは、その後、スライドおよび化学的またはプラズマ洗浄、シラン化カバースリップ（プロトコル2）32-34から組み立てられる。結果として生じるチャンバ容積は、入口管の体積を含むのみ20-25液（又は15μlのできるだけ小さい、プロトコル1の注3を参照）である。市販のフローチャンバーを使用することもできるが、その体積は、タンパク質の不必要な浪費をもたらす、通常は大きくなる。大きなチャンバーを採用した場合は、以下のプロトコルのすべてのソリューションの量が比例して拡大縮小する必要があります。微小管の種子は、その後徐々に加水分解性GTP類似体、GMPCPP（グアノシン-5&#39;-[（α、β）-methyleno]三リン酸）（プロトコル3を使用して調製される、ハイマン&lt;も参照してください。EM&gt;ら35）。種子を洗浄し、カバースリップ上に固定され、表面は、その後、他のタンパク質の非特異的吸収を防ぐためにブロックされている32（プロトコル4を用いてジゴキシゲニン種子の固定化を記載）。セグメント化された微小管は、次いで、プロトコル5を用いて調製することができる。このアプローチの主な根拠は、GTPの存在下で形成動的微小管ポリマーは、GMPCPPを含有する安定なチューブセグメントの短い「キャップ」を付加することによって、一時的に安定させることができることである。これらのキャップはまた、ローダミン標識したチューブリンを含有するので、530〜550 nmのレーザーまたは水銀アークランプ（プロトコル6）36で視野を照明することによって簡単に除去することができる。先端トラッキング信号の蛍光強度は、次いで考慮顕微鏡視野照明（プロトコル7）のばらつきを考慮して、分解、微小管の端部に移動する分子の数を推定するために使用することができる。同様のアプローチを使用することができる微小管脱重合および27に記載したように調製したタンパク質被覆ビーズ（プロトコール8）との間の相互作用を研究する。いくつかのタンパク質は容易にセグメント化された微小管の壁に結合するが、レーザーピンセットはまた、それによって、その結合を促進し、微小管の壁の近くにビードを保持するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">表 1.顕微鏡およびその他の機器.</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>DICおよび落射蛍光イメージングが可能な他の顕微鏡モデルを使用できます</td></tr><tr><td>客観的</td><td>な Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Objective heater</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルターキューブ</td><td>Chroma</td><td>49004 or 49008 41017 or 49020</td><td>optimized for Rhodamine fluorescence&nbsp; GFP蛍光</td></tr><tr><td>取得ソフトウェア</td>に最適化 <td>フリーウェア MicroManager 分子デバイス</td><td>該当なし MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 他のソフトウェアを使用して画像を取得し、粒子追跡に</td></tr>使用することができます <tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>高感度EMCCDカメラ</td></tr><tr><td>トラッピング</td><td>レーザーIPGPhotonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>1,064 nm laser, 10 W</td></tr><tr><td>蛍光励起レーザ</td><td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>サファイア 488 LP サファイア 552 LP</td><td>緑色蛍光色素の励起 赤色蛍光色素の励起</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリック プラズマ</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>商業用フローチャンバー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>RC-20またはRC-30</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>コール・パーマー ハーバード・デバイス</td><td>マスターフレックス 77120-52 ピコプラス</td><td>どちらのポンプも必要な液体流量を提供しますが、蠕動ポンプは非常に遅い速度で脈動する可能性があります。シリンジポンプによる流れは、幅広い速度でより一貫していますが、このポンプには慣性があります。</td></tr><tr><td colspan="4">表 2.顕微鏡チャンバーの準備.</td></tr><tr><td>再利用可能なチャンバー用の修正顕微鏡スライド</td><td>コロラド州の精密ガラス吹き</td><td>カスタムオーダー</td><td>><www.precisionglassblowing.com Figure 1ポリエチレンチューブの回路図を使用してスライドにソニックスロット</td></tr> <tr><td></td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; これらのチューブを使用して、組み立てられたチャンバーをポンプと廃棄物容器に接続します</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; これらのチューブを使用して再利用可能なチャンバーを作る</td></tr><tr><td>通常の顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>他の同様のスライドを使用することができます</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>他の同様のカバースリップを使用することができます</td></tr><tr><td>シリコンシーラント</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ接着剤ロック</td><td>タイト</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>スコッチ3M</td><td>AD114</td><td>または他のメーカーからのシアノアクリレート接着剤</td></tr><tr><td colspan="4">Table 3.カバースリップのクリーニングとコーティング.</td></tr><tr><td>モレキュラーシーブ、グレード564</td>マクロ<td>ン</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス染色ジャー</td>テッド<td>ペラ株式会社</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ セラミック ホルダー</td><td>トーマス サイエンティフィック</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne はじけ シラン</td><td>GE ヘルスケア バイオサイエンス</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>アンチ ジゴキシゲニン AB</td><td>ロシュ アプライド サイエンス</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 表 4.牛の脳から精製された種子およびセグメント化された微小管.</td></tr><tr><td>Tubulin</td>の準備<td> Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>精製プロトコルについては、49&ndashを参照してください。51 非標識ブタチューブリン</td></tr><tr><td>標識チューブリン</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)</td><td>Rhodamine標識ブタtubulin チューブリンは、参照52のように、任意のアミン反応性色素で標識できます。</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>アリコートと-70°Cで保管。C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>ワセリン、ラノリン、パラフィン(質量</td><td></td>1:1:2)<td>参照9</supを参照></td></tr></tbody></table>

逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

微小管の解重合は、 インビトロで異なるタンパク質複合体およびタンパク質被覆ビーズを輸送する力を提供することができる。基本的なメカニズムは、細胞分裂時の微小管依存染色体の運動に重要な役割を果たしていると考えられているが、関連するタンパク質およびそれらの正確な役割は明確に定義されています。したがって、精製された成分と定義され、生化学的環境を用いて、インビトロでそのような運動性を研究するためのものでアッセイを開発する必要性が高まっている。微小管は、しかしながら、本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮それらの切り替えは、確率的と制御が困難である。我々はここで説明するプロトコルはphotoablatableがキャップを安定化して作られてセグメント化された微小管を利用しています。そのようなセグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管の端部に運動性の研究を補助する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。この技術は、約するために使用することができる動的な微小管が終了するとprocessively移動する蛍光標識されたタンパク質複合体中の分子数の定量分析を行っRRY。このにおける信号対雑音比、および他の定量的蛍光アッセイを最適化するために、カバーガラスを可溶性蛍光標識されたタンパク質の非特異的吸収を減少させるために処理されるべきである。詳細なプロトコルを考慮に蛍光照明ムラを取ると等距離ガウスフィットを使用して、単一のフルオロフォアの強度を決定するために提供される。最後に、進行的貨物の動きに結合する微小管脱重合に異なるモーターと非運動タンパク質の能力への洞察を提供し、タンパク質でコーティングされたマイクロビーズの微小管依存の動きを研究するセグメント化された微小管の使用を記載している。

微小管脱重合を追跡するタンパク質が終了する。酵母動原コンポーネントDAM1が圧倒的に脱重合微小管のベストのヒント-トラッカーである14を終了します。 GFPで標識されたこの10サブユニット複合体は、容易に発現し、細菌細胞18,38から精製し、私たちは、先端追跡アッセイのポジティブコントロールとして、それを使用することをお勧めすることができます。微小管脱重合の終わりで追跡し、蛍光タンパク質は、着実にカバーガラス付のシード（ ビデオ3）に向かって移動明るい蛍光スポットとして見られている。また、対応するカイモグラフ（ 図2E）上の斜め線として表示されます。タンパク質はトラックを傾けるに失敗した場合とは対照的に、微小管は、人間Ndc80-GFP錯体19（ 図2F）に見られるような、微小管端に蛍光シグナルの濃縮を表示せずに短縮されます。プロセッシブトラッキングが観察される場合には、微小短絡の速度ening移動点を追跡することによって、対応するカイ...

微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

次の実験の全体的な目標は、解重合微小管の末端を持つタンパク質分子とタンパク質被覆ビーズの動きを研究することです。これは、再利用可能なフローチャンバーをクリーンなサイズのカバースリップで組み立てることによって達成されます。次に、微小管の種子を調製し、カバースリップに付着させて微小管を核形成し、光破壊キャップで一時的に安定化します。次に、GFP標識タンパク質またはタンパク質被覆ビーズをフローチャンバーに導入し、セグメント化された微小管に結合します。マイクロタブの解重合は、フォトアブレーションによってキャップを取り外すことによってトリガーされます。画像をCHで解析し、標識されたタンパク質がチップトラッキング挙動(解重合微小管の末端に沿った動き)を示すかどうかを判断します。この技術の主な利点は、高い時間分解能と特別な分解能で微小管化をトリガーできることです。この手法の視覚的なデモンストレーションは重要です。プロトコールは、超音波ミリングを使用したフローチャンバーの準備と組み立てから始まります。通常の顕微鏡スライドを2つの溝を持つように変更します。溝を14mm離します。1ミリメートルの差出量があり、これは正方形の22ミリメートルのカバースリップを使用して組み立てられたチャンバーに最適です。次に、スライドの各溝に長さ100mmのポリエチレンチューブを配置し、溝の内側の端に約5mmのオーバーハングを残します。シアノアクリレート接着剤で溝の内側にチューブを固定し、チューブを溝の内側に完全に埋め込みます。こぼさないようにエポキシ接着剤で溝を慎重に埋めます。一日乾かします。翌日。鋭利なカミソリの刃を使用して、固化した接着剤を各取り付け部位の遠位端から3〜4ミリメートルのところで切断します。スライドの中央に近位にあるパーツを取り外します。チューブは溝に留まり、カットはチューブ開口部のある平らな面を作る必要があります。次に、シリンジに水を入れ、チューブが正常に機能しているかどうかをテストします。液体が自由に流れる場合は、溝の外側の端に直径約5ミリメートルのエポキシ接着剤を一滴垂らし、約1日間乾燥させます。したがって、完成したフローチャンバーは耐久性があり、何ヶ月も繰り返し使用することができます。この3時間のプロトコルでは、12枚のカバースリップを準備します。ヒュームフード、セラミックカバースリップホルダー1個、15ミリリットルの染色瓶3個、蓋付きの250ミリリットルのガラス瓶1個が必要です。染色ジャーは、4つの通常の番号1 22ミリメートルカバースリップを積み重ねて収める必要があります。まず、事前に洗浄および乾燥させたカバースリップを12枚、セラミックホルダーに積み重ねます。ジャーにプラス1の反発シレン溶液を入れ、スライドをゆっくりと下げます。瓶を閉じ、室温で5分間インキュベートします。均一なカバースリップ文明を確保するための最も重要なステップは、セレーネ溶液でのカバースリップのインキュベーション中に水の痕跡を避けることです。このステップは、マイクロチューブ種子をしっかりと取り付けるために不可欠です。プロトコルの後半では、カバースリップの準備ができたら、セラミックホルダーを瓶から取り外します。次に、テフロンコーティングされたピンセットを使用して、カバースリップをセラミックホルダーからメタノール充填された染色ジャーに個別に移します。次に、3つの瓶を、金属製またはガラス製の台座が入ったソニックバスの貯水池に入れます。水位は瓶の高さの3分の2にすべきで、瓶を70ワットで20分間超音波処理します。超音波処理中は、5分ごとにメタノール溶液を交換してください。超音波処理が完了したら、すすぎ、カバーを脱イオン水で10回きれいに滑ります。サイロ化が適切に機能した場合、カバースリップは乾燥しているように見えます水から取り外すと、見た目に関係なく、残留水を完全に取り除きます。窒素ガスの移動を使用して、乾燥したカバーは窒素乾燥の密封可能な容器に滑ります。カバースリップの間にインターレイキムが拭きます。この方法で、室温で数週間保存できます。このプロトコルには、1〜2時間、1つのフローチャンバーと準備されたG-M-P-C-P-P安定化マイクロチューブシードが必要です。まず、フローチャンバーを組み立てます。用意したスライドの中央5mm幅に両面テープを2枚貼り、カバースリップをテープにしっかりと押し付けます。1ミリリットルのシリンジを使用して、チューブを介してチャンバーに100マイクロリットルのB rrb 80溶液を充填します。次に、小さなプラスチック製のペトリ皿の上に2色のクイックキャストシーラントの小さな滴を絞ります。つまようじですばやくしっかりと混ぜます。緑色に変わります。カバースリップのすべての端に沿ってシーラントをすぐに塗布します。シーラントがカバースリップの下に深く浸透しすぎていないか確認してください。チューブが詰まっている場合は、シリンジを抜き、チューブを持ち上げてシーラントの漏れを防ぐために穏やかな圧力をかけます 10分後、溶液の流れが制限されていないことを確認してください。次に、チャンバーを摂氏32度の温めた顕微鏡ステージに移します。溶液を除去するために、チューブの1つをポンプに取り付けます。インレットチューブの自由端を、温かいBRB 80バッファーを入れた0.5mmバイアルに浸します。ポンプを毎分100マイクロリットルに設定し、必要に応じて、ポンプを使用して気泡をやさしく押し出します。これは手動で行うこともできます。次に、ポンプを使用して30マイクロリットルの温かい抗原抗体をロードします。ポンプをオフにして、5分間待ちます。すべてのインキュベーション中にポンプをオフにしてください。次に、約100マイクロリットルの温かいb rrb 80でチャンバーを洗浄します。次に、BRB 80で50マイクロリットルの1%onic F1 27を灌流します。サイロ化されたカバースリップの疎水性表面をブロックするまで10分待ちます。次に、100マイクロリットルの運動性緩衝液でチャンバーを洗浄します。次に、ポンプ速度を毎分15マイクロリットルに下げ、運動性緩衝液で1〜200〜1〜600に希釈された30〜40マイクロリットルの微小管種子をチャンバーに灌流します。種子を15分間インキュベートし、次いでチャンバーを400マイクロリットルの運動性緩衝液で毎分100マイクロリットルで洗浄し、未結合の物質を除去する。次に、ポンプ速度を毎分30マイクロリットルに下げ、予温した標識なしチューブリン溶液をチャンバーに灌流します。このプロトコルの最も重要な側面は、気泡を避けることです。調製したばかりのチューブリン溶液を使用し、特にマイクロチューブラーキャッピング中に、プロトコルの正確なタイミングに従うこと。5〜7分間のインキュベーション中に、DIC光学系を使用してマイクロチューブの成長をモニターします。微小管は通常約10ミクロン成長し、戦前のRumine Tubulin Mixと溶液を迅速に交換し、さらに8〜10分のインキュベーション時間を確保します。チャンバーを100マイクロリットルの運動性緩衝液で毎分20マイクロリットルでよく洗浄し、乱流とヌクレオチド、および可溶性微小管の断片を除去します。次に、GFP標識タンパク質またはタンパク質被覆ビーズの温めた溶液でチャンバーを灌流し、GFPで標識された酵母キネティコ成分DAMのイメージングを進めます。これは、細菌細胞から精製され、チップトラッキングアッセイのポジティブコントロールとして使用されました。このようなタンパク質は、微小管の解重合末端に沿って、カバースリップに付着したシードに向かって着実に移動します。これらのタンパク質は、対応するグラフ上に斜めの線として表示され、これを分析して先端追跡複合体内のタンパク質分子の数を決定できます。この分析は、テキストプロトコルで詳しく説明されています。対照的に、チップトラックに失敗したタンパク質は、分解するマイクロ末端で蛍光シグナルの濃縮を示さない。これは、ヒトNDC 80 GFPタンパク質で見られます。タンパク質被覆ビーズと微小管との間の結合は通常非常に強いため、ビーズを顕微鏡チャンバーに添加すると、セグメント化されたカバースリップに付着した微小管に容易に結合します。ビーズの追跡が処理的である場合、多くの観察を行うことができます。1つの微小管に付着したビーズは、微小管が成長部位の周りをわずかに回転するため、弧のような動きを示しました。安定化キャップが点灯しているときに、種子とビーズから遠位に赤いセグメントが1つだけ見える場合、ビーズは1つの微小管に取り付けられています。キャップは、キャップが漂白されるまでビーズのような動きに続いてよく見られます 漂白直後のビーズの動きは、微小管の配向と一致して見えます。マイクロチューブが短くなり、ビーズがシードに向かって移動すると、振動のような円弧の振幅が減少します。ビーズが安定した微小管への永続的な付着を形成できない場合。レーザートラッピングは、TPの存在下でセグメント化されたマイクロチューブ壁上にビーズを発射するためにこの技術を必要としたプラス末端指向キネシンSE Eの異なるタンパク質コンストラクトを持つビーズを使用することができます。これらのビーズは、グラフ上のキャップされたマイクロチューブプラスエンドに向かって急速に移動しました。この動きにより、キャップが破壊された後、キャップに向けられた斜めの線が生じました。緑色の矢印で示されているように、微小管から分離された切り捨てられたスパイタンパク質でコーティングされたビーズ。対照的に、全長Bタンパク質を持つビーズは、逆方向の動きを維持することができました。これは、微小管のプラスおよびマイナスの端に反対方向の動きによるchmグラフ上のジグザグパターンとして見られます。このビデオを見れば、フローチャンバーを準備し、微小管の分解によって駆動される動きを研究するために、セグメント化された微小管を成長させる方法について十分に理解できるはずです。

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Biology

生物学

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

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出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。...

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ここでは、生細胞紡糸ディスク共焦点顕微鏡法とMATLABベースの画像処理を用いてプロメタフェイズで同期した細胞における微小管ダイナミクス解析の堅牢かつ詳細な方法を提示する。...

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ここでは、特定の微小管修飾酵素を欠くか含む可能性のある哺乳類細胞から内因性チューブリンを抽出し、特定の修飾のために富んだ微小管を得るためのプロトコルについて説明します。次に、抽出した微小管を精製した微小管結合タンパク質で修飾して、クライオ電子顕微鏡用のグリッドを準備する方法について説明します。...

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