赤血球上の抗体誘導性補体活性化の定量的検出のための方法

本実験の全体的な目的は、患者血清中の赤血球（RBC）に対する抗体による補体活性化を評価することである。これは、赤血球を患者血清とともに、ブロッキング用抗C5抗体存在下でインキュベートし、RBC表面にC4およびC3の沈着を誘導することによって達成される。次に、RBCを蛍光標識した抗C4抗体および抗C3抗体で染色し、別の方法としてフローサイトメトリーを用いてRBC上の補体沈着量を分析することができる。

抗C5不在下で、赤血球を患者血清とともにインキュベートし、補体媒介性の溶血を誘導します。その後、分光光度法を用いて細胞から放出されたヘモグロビンの量を測定することで、溶血した赤血球の割合を決定できます。日常的な診断に用いられる溶血試験や抗グロブリン試験などの既存の方法に対するこの新手法の主な利点は、定量的な性質を持ち、補体活性化におけるわずかな差異を検出できることです。

当研究室のポストドクターであるElizabeth Brookが手順を実演します。まず、O型赤血球をPBSで3回洗浄し、その後、ペレットを0.5% Roma lane溶液で1:2の比率で37 °Cにて10分間インキュベートします。さらに細胞を3回洗浄した後、フローサイトメトリーにより赤血球上の補体沈着を分析するため、新鮮なPBSを用いて3%溶液として4 °Cで保存します。まず、必要量の患者血清を56 °Cで30分間加熱不活性化します。血清の加熱処理を行っている間に、Roma lane処理済みの赤血球をRoalバッファーで3回洗浄します。最後の洗浄が終わった後、

ペレットをvbg plus plusで0.5%に希釈して再懸濁します。次に、ガラスパールを用いて、0.5% RBCs 25 µL、新鮮なAB血清 37.5 µL、および 200 µg/mL anti C5 37.5 µLを、96ウェル丸底プレートの各ウェルに加えます。その後、必要に応じて不活化AB血清で調整し、適切な濃度の不活化患者血清を各ウェルに加えます。また、陰性コントロールも含めてください。

VBG++を用いて各ウェルの最終容量を150 µLにし、その後、プレートをEIAホイルで密閉し、37 °Cで1.5〜2時間振盪しながらインキュベートします。インキュベーション後、0.5% BSA添加PBSで細胞を3回洗浄し、次に1 µg/mLの蛍光標識抗C3および抗C4モノクローナル抗体で細胞をタグ付けします。室温で緩やかに振盪しながら30〜45分間インキュベートし、プレートを3回洗浄した後、赤血球（RBC）を1ウェルあたり150 µLの0.5% BSA添加PBSに再懸濁します。

細胞懸濁液を新しい96ウェル丸底プレートに移し、プレートをフローサイトメーターにセットして、前方散乱光（FSC）プロットを用いてシングルセルをダブレットから分離します。単一の赤血球（RBC）にゲートを設定し、蛍光信号に適した検出チャンネルを選択します。定量的な溶血分析には、中央値蛍光強度（MFI）を用いて結果を定量化します。患者血清を加熱して活性化させ、先ほど示した通りにロメイン処理した赤血球を洗浄します。

次に、前述のように補体および患者血清とともにRBCをインキュベートしますが、anti C fiveは加えず、減速設定を低くして664 GSで5分間遠心分離します。続いて、細胞が混入しないように注意し、気泡が発生しないようにしながら、上清90 µLを新しいマイクロタイタープレートに慎重に分注し、分光光度計を用いて414 nmから690 nmの吸光度を測定します。溶血率を、純水中でインキュベートしたRBCサンプルの溶血に対するパーセンテージとして算出します。

この最初の図では、brola処理したRBCの代表的な散布図が示されており、単一RBCに適したゲーティングをここで確認できます。通常、RBCの約95%がこの単一細胞ゲート内に収まります。これらのヒストグラムは、自己免疫性溶血性貧血（aha）の影響に関する代表的な結果です。

C4およびC3の沈着に対する患者血清の影響が予想通りに示されており、患者血清の量が増えるほど補体の沈着量も増加しています。興味深いことに、補体の沈着は2つの明確な陽性ピークとして現れています。赤血球は単一のドナーから採取されているため、これは赤血球集団の不均一性によるものではないと考えられますが、この現象の原因については現在も調査中です。C4およびC3沈着アッセイの再現性を示すために、サンプルの中央値蛍光強度がこれらの折れ線グラフにプロットされています。

さまざまなAH H患者サンプルの沈着には大きなばらつきがあることに注意してください。最後に、RBCに対する自己抗体を含むahha患者血清サンプルの溶血アッセイによるデータがこれらのグラフで確認できます。抗C5などの適切な補体阻害剤を用いて血清サンプルでタイトレーションを行うと、明確で再現性のある曲線が得られます。

このグラフに示されているように、溶血シグナルは滴定によって消失させることができます。このビデオを視聴することで、C3またはC4の沈着に関するフローサイトメトリー解析、あるいは定量的な溶血アッセイを用いて、赤血球特異的抗体による補体活性化を測定する方法について十分に理解できるはずです。