赤血球上の抗体誘導性補体活性化の定量的検出のための方法

次の実験の全体的な目標は、患者の血清中の赤血球または赤血球に対する抗体による補体の活性化を評価することです。これは、ブロッキング抗C 5抗体の存在下で赤血球を患者血清とインキュベートし、RBC表面にC 4およびC3の沈着を誘導することによって達成されます。次に、赤血球を蛍光標識された抗C four抗体および抗C3抗体で染色し、赤血球上の補体沈着量を別の方法でフローサイトメトリーで分析できます。

RBCは、抗C 5の非存在下で患者血清とインキュベートされ、補体媒介溶解を誘導します。溶解された赤血球の割合は、細胞から放出されるヘモグロビンの量を分光法で測定することで決定できます。溶血や日常的な診断で使用される抗グロブリン検査などの既存の方法に対するこの新しい手法の主な利点は、本質的に定量的であり、補体活性化の最適でない違いを検出できることです。

私たちの研究室のエリザベスブルックポスドクは、手順を実演します まず、ゼロ型赤血球をPBSで3回洗浄し、次にペレットを0.5%Romaレーン溶液で1対2の比率で摂氏37度で10分間インキュベートします細胞をさらに3回洗浄した後、摂氏4度の新鮮なPBSに3%溶液として保存して、フローサイトメトリーによるRBC上の補体沈着を分析します。まず、血清が熱処理されている間、56°Cで30分間、必要な量の患者血清を不活化します。ブロラ処理した赤血球を最終洗浄後、ロアルバッファーで3回洗浄します。

Resusは、ペレットをvbg plus plusに0.5%希釈で懸濁します。次に、ガラスパールで0.5%RBCの25マイクロリットル、新鮮なAB血清37.5マイクロリットル、およびミリリットルあたり200マイクログラムの37.5マイクロリットル、96ウェル丸底板の各ウェルに抗C5。次に、熱不活化患者血清を適切な濃度で各ウェルに加え、必要に応じて熱不活化AB血清を補充し、ネガティブコントロールも含めます。

VBG plus plusを使用して、各ウェルを最終容量150マイクロリットルにし、E IAホイルで覆われたプレートをインキュベーション後に振とうしながら、摂氏37度で1時間半から2時間インキュベートします。0.5%BSAを添加したPBSで細胞を3回洗浄し、1ミリリットルあたり1マイクログラムで細胞にタグを付けます。蛍光標識された抗C3および抗C 4モノクローナル抗体は、室温で30〜45分間、穏やかに振とうしながら細胞をインキュベートし、次いでプレートを3回洗浄した後、RBCを150マイクロリットルのPBSおよび0.5%BSAあたりに再懸濁する。

細胞懸濁液を新しい96ウェル丸底プレートによく移し、次にプレートをフローサイトメーターにロードし、前方散布図を使用して単一細胞をダブレットから分離します。ゲートを単一のRBCにセットし、蛍光シグナルに適した検出チャンネルを選択します。定量的溶血性分析のために蛍光強度の中央値を使用して結果を定量化し、患者の血清を加熱して活性化し、ロメインレインで処理した赤血球を洗浄します。

次に、先ほど示したように、補体および患者血清を用いてRBCをインキュベートした後、抗C 5を使用せずに、664GSで細胞を5分間スピンダウンし、減速を抑えます。次に、無傷の細胞を移さないように注意し、気泡を作らないように注意しながら、90マイクロリットルの上清を新しいマイクロタイタープレートに慎重に移し、次に分光光度計エクスプレスで4 14〜6 90で吸収を測定します。純水中でインキュベートしたRBCのサンプルの溶解に対する割合としての溶血。

この最初の図では、ブロラ処理された赤血球の代表的な散布図が、単一の赤血球に適したゲーティングを示しています。通常、赤血球の約95%がこのシングルセルゲート内に収まります。これらのヒストグラムでは、自己免疫性溶血性貧血またはahaの影響の代表的な結果です。

C 4 の患者血清と C3 沈着は予想どおりに示され、患者血清が多いほど補体沈着が多くなります。興味深いことに、補体沈着は2つの異なる正のピークで発生します。これは、RBCが単一のドナーから採取されるため、RBC集団の不均一性によって引き起こされるものではないと考えられますが、この現象の原因はまだ調査中ですが、サンプルの蛍光強度の中央値がこれらの折れ線グラフにプロットされ、C 4およびC3沈着アッセイの再現性が示されています。

さまざまなAH H患者サンプルの沈着には大きなばらつきがあることに注意してください。最後に、RBCに対する自己抗体を含むahha患者血清サンプルの溶血アッセイからのデータをこれらのグラフで観察できます。血清サンプルで滴定すると、抗C fiveなどの適切な補体阻害剤を用いて明確な再現性曲線が得られます。

このグラフに示すように、溶血シグナルは滴定できます。このビデオを見れば、C3またはC 4沈着のフローサイトメトリー分析または定量的溶血アッセイにより、赤血球特異的抗体による補体活性化の測定方法について十分に理解できるはずです。