Name: フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーと免疫染色を用いた赤血球補体受容体1（CR1）密度測定法。アルツハイマー病や全身性エリテマトーデスなどの疾患における受容体発現評価に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

URCACyt、フローサイトメトリー技術プラットフォームのメンバー、免疫学科のスタッフ、およびプロトコルの最適化と検証に貢献した内科学・老年医学省のスタッフに感謝します。この研究はランス大学病院(助成金番号AOL11UF9156)によって資金提供されました。

ヒトの採血と取り扱いの議定書は、地域倫理委員会(CPP Est II)によって審査され、承認され、プロトコル番号は2011-A00594-37です。以下のプロトコルは、ヒトの血液の取扱いについて説明しているので、生体有害物質の廃棄に関する制度上のガイドラインに従うべきである。ラボコートや手袋などの実験室の安全装置を着用する必要があります。
1. 赤血球洗浄
注意:取り扱い前日に、ウシ血清アルブミン(BSA)の0.15%を含むリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を用いてPBS-BSAバッファーを調製し、4°Cで冷蔵庫に入れます。このバッファーは、洗浄バッファーとして、希釈バッファーとして使用されます。
<ol><li>ピペット20 mLのPBS-BSAを50 mLチューブにします。</li>
	<li>250μLのナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の吸入体は、血液貯蔵管から全血を抗凝固し、20mLのPBS-BSAを含むチューブに添加した。キャップをねじ込んでチューブを閉じます。管2倍を反転してやさしく混ぜます。</li>
	<li>430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。優しく慎重なピペット処理により、上清の残留体積中のペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA(4°C)を加えます。430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。</li>
	<li>ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA(4°C)を加えます。430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。チューブを遠心分離機の4°Cに残し、セクション2に進みます。</li>
</ol>2. 赤血球希釈
<ol><li>50 mLチューブに冷たいPBS-BSAのピペット3 mLを、氷の中のラックに4°Cで保管します。</li>
	<li>赤血球を含む遠心チューブ(ステップ1.4)を氷の中に置かれたラックに置きます。</li>
	<li>ピペットを用いたペレット赤血球のピペット8μLを、PBS-BSAの3mLを含む50mLチューブに加え、赤血球希釈液を得た。チューブを手で軽く混ぜて、赤血球の均質な細胞懸濁液を得る。</li>
</ol>3. 赤血球免疫染色
<ol><li>ピペット100μLの赤血球希釈液(セクション4で得られる)を1.4 mLチューブに加える。</li>
	<li>430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。遠心分離の間、PBS-BSAバッファー内の0.05 μg/μLの濃度でビオチン化抗CR1 J3D3抗体の希釈を調製します。</li>
	<li>遠心が終わったら、上清を取り除いて捨てます。</li>
	<li>20 μLのビオチン化抗CR1 J3D3をペレットに直接加えます。陰性制御を準備するには、代わりに20 μLのPBS-BSAバッファを追加します。チューブを軽く混ぜ、4°Cで45分間インキュベートします。</li>
	<li>45分のインキュベーションの後、750 μLのPBS-BSAをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。</li>
	<li>その間、PBS-BSAバッファーで希釈したストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈を調製する。ストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈のピペット20 μLをチューブに加える。チューブを軽く混ぜ、4°Cで45分間インキュベートします。</li>
	<li>750 μL の PBS-BSA バッファーをチューブに追加します。430 x g で 4 °C で 5 分間、よく遠心分離機を混ぜます。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。</li>
	<li>遠心分離の間、PBS-BSAバッファーで希釈したビオチン化抗ストレプトアビジン抗体の1:100希釈を調製する。</li>
	<li>遠心が終わったら、上清を取り除いて捨てます。</li>
	<li>ピペット20 μLのビオチン化抗ストレプトアビジンをチューブに1:100希釈した。チューブを軽く混ぜます。4°Cで45分間チューブをインキュベートします。</li>
	<li>45分のインキュベーションの後、ピペット750 μLのPBS-BSAバッファーをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。</li>
	<li>ストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈のピペット20 μLをチューブに加えます。チューブを軽く混ぜます。4°Cで45分間チューブをインキュベートします。</li>
	<li>ピペット750 μLのPBS-BSAバッファーをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間よく混合し、遠心分離チューブ.上清を取り除き、捨てます。この手順を 2x 繰り返します。</li>
</ol>4. 免疫染色赤血球固定
<ol><li>最後の遠心分離の間、1:100の固定バッファーを調製し、洗浄バッファーPBS-BSAを用いて37%ホルムアルデヒドの希釈液を調製する。</li>
	<li>ピペット450μLの固定バッファーを、5秒のボルテックス中に免疫染色赤血球チューブ(ステップ3.13から)に加えます。</li>
	<li>ピペットは5 mLの丸い底の管に全ての固定された細胞を、冷蔵庫に保管する。 注: プロトコルは、ここで最大 48 時間一時停止できます。</li>
</ol>5. 染色赤血球のフローサイトメトリー解析
注意:サイトメトリックの読み取り値を実行する方法を知ってお勧めします。. Table of Materials以下の推奨パラメータは使用する計測器に適用され、各サイトメーターに最適化する必要があります。
<ol><li>フローサイトメーターの電源を入れ、コンピュータの電源を入れます。光学系の温度を30分間オンにしたままにして安定させます。 Cytometer Connected</li>
	<li>バッファー コンテナーがいっぱいであり、廃棄物コンテナーが空であることを確認します。パージシステムを使用して、バッファフィルタとバッファラインの気泡を取り除きます。サイトメーターのコンソール上のPrimeボタンを押して流体システムをプライムします。インジケータランプが赤から緑に変わるまで待ちます。</li>
	<li>流体を洗浄するには、3 mLの洗浄液を含むチューブをサンプル注入口に取り付け、洗浄液を高いサンプル流量で5分間実行させます。蒸留水でリンス溶液でこれを繰り返します。サンプル注入口に水を含む管を残します。</li>
	<li>キャリブレーションビーズを調製するために、PBSのピペット400 μLを丸底管の底部に入れた。30 sの渦を巻いてビーズストックを強く混ぜます。30sの渦で慎重に混ぜます。</li>
	<li>パフォーマンス チェックを実行します。ソフトウェアのサイトメーターのセットアップとトラッキングモジュールを開きます(図1A)。細胞メーター構成がPE免疫染色を用いた実験に適していることを確認します。構成に合った調整ビード バッチが正しいことを確認します。</li>
	<li>サンプルインジェクションポートにビーズチューブを取り付け、低サンプル流量で動かします。パフォーマンスチェックを実行します(所要時間は約5分)。パフォーマンスチェックが完了したら、サイトメーターのパフォーマンスが満足であることを確認します(図1B)。ソフトウェアのサイトメーターのセットアップとトラッキングモジュールを閉じます。</li>
	<li>実験を設定してアプリケーション設定を作成するには、ブラウザーのツール バーの[新しい実験] ボタンをクリックし、新しいテストを開きます。実験のドロップダウン メニューから適切なサイトメーター設定(フォワード スキャッタ(FSC)、サイド スキャッタ(SSC)、および PEを選択して、パラメータを指定します (図 1C)。SSC および PE パラメータの場合は[FSC パラメータ]に[線形モード]を、パラメータの[対数モード]を選択します。</li>
	<li>開いた実験で、[サイトメーターの設定] ( 図1D) を選択し、[アプリケーション設定]を選択して、グローバル ワークシートを作成します (図 1E)。最適化をガイドするには、グレーのボックスと十字線を使用します。</li>
	<li>染色されていないコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。FSC および SSC 電圧を最適化することにより、関心のある人口(つまり、RMC)が拡大縮小されていることを確認します。FSCしきい値を最適化して、関心のある人口に干渉することなく、デブリを排除します。</li>
	<li>FSC と SSC プロットの RMC の周囲にゲートを描画します。PE蛍光のドットプロットでRBC集団を表示する。必要に応じて、光増倍管(PMT)電圧の蛍光を上げ、グレーのボックス内に負の母集団を配置します。染色されていないコントロールチューブをサイトメーターからアンロードします。</li>
	<li>正の母集団がスケールであることを確認します。染色されたコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。正の母集団が完全にスケールで見られるまで、プラス集団がスケールから外れている場合は、正の母集団のPMT電圧を下げます。その後、染色されたサンプルをアンロードします。</li>
	<li>サンプルを記録して分析するには、新しいグローバルワークシートで、データをプレビューするための次のプロットを作成します: 1) FSC 対 SSC, および 2) PE蛍光ヒストグラム.最初のサンプルをサイトメーターにロードし、取得を実行します。</li>
	<li>FSC対SSCプロットの赤血球の周りにRBCゲートを描きます。PE蛍光ヒストグラムでRBC集団を表示する。統計ビューで、GR 集団の PE 蛍光パラメータの平均を選択します (図 1F)。</li>
	<li>取得ダッシュボードで、停止ゲート内のすべてのイベントと記録する 10,000 イベントを選択します (図 1G)。[レコード データ ]をクリックします。イベント記録が完了したら、サイトメーターから最初のチューブを取り外します。グローバル ワークシートのプロットは、図 2のようになります。</li>
	<li>以下のサンプルをロードして記録します。</li>
</ol>6. 赤血球CR1の密度の決定
<ol><li>「低」被験者(図3、表I、RBCMFI)、中型の被験者(図4、表D、RBCMFI)、高い」被験者(図4、表I、RBCMFI)、およびFigure 4陰性対照サンプル(図3、表I、RBCMFI)に対応するサンプルの平均蛍光強度の値を取る。</li>
	<li>平均蛍光強度をCR1の密度の関数として表すグラフ上に、負の対照に対応する4点を配置し、「低」被験者、「中」の被験者、および「高」対象(青色点、図6)を配置する。</li>
	<li>回帰直線を描画して、キャリブレーションラインとその方程式を取得します。</li>
	<li>密度が決定される被験者に対応するサンプルの平均蛍光強度の値を取る。(図 5、表 D および I、RBC MFI)。</li>
	<li>平均蛍光強度の値を用いて「Y」を置換して式を得て、CR1/Eの密度を算出する(図6)。</li>
	<li>グラフ上で、平均蛍光強度値と決定されたCR1/E密度がキャリブレーションライン上の点に対応していることを確認します(図6)。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

赤血球CR1(CR1/E)の密度を決定するためにいくつかの技術が利用可能です。第1の技術は、抗CR1抗体31による赤血球の凝集と、C3b32でコーティングされた赤血球の存在下でのロゼットの形成であった。32これらの初歩的な技術は、放射性標識抗CR1抗体11、3333を用いた免疫染色法によって迅速に置換された。また、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)34による膜抽出物中のCR1の濃度を測定することもできる。34正確ではあるが、これらの技術はCR1/E密度の平均値のみを提供する。赤血球集団全体にわたるCR1/E密度の分布は、免疫染色後のフローサイトメトリック分析によってのみ利用可能です。この技術はCR1/Eの低密度のため困難である。しかし、増幅法により、CR1/E30の密度を容易に測定することが可能になった。30
<p cla...

CR1(補体受容体型1、CD35)は、赤血球1、Bリンパ球2、単球細胞、一部のT細胞、濾胞樹状細胞3、胎児アストロサイト4、および糸球体ポドサイト5のような多くの細胞型の表面に存在する200kDa膜貫通糖タンパク質である。CR1は、そのリガンドC3b、C4b、C3bi6、7、8、9、第1の補体成分のサブユニット、C1q6,7,8,910およびMBL(マンナン結合レクチン)11は、補体の活性化を阻害し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。
ヒトを含む霊長類において、赤血球CR1は、肝臓および脾臓への免疫複合体の輸送に関与し、血液を浄化し、皮膚または腎臓12、13、14,13,14などの脆弱な組織に蓄積するのを防ぐ。免疫複合体と赤血球との間の免疫接着のこの現象は、CR1分子15の数に依存する。ヒトでは、CR1/Eの平均密度はわずか500(すなわち、赤血球当たりCR1の500分子)である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。"null" 表現型の一部の個体は、20 CR1/E16未満を表現する。
CR1/Eの密度は、CR1*117、18,18に対してコードする遺伝子のイントロン27における点突然変異に結合した2つの共支配性常染色体対立遺伝子によって調節される。この変異は、HindIII酵素に対する追加の制限部位を生成する。この場合のHindIIIでの消化後に得られた制限フラグメントは、CR1(H:高アレル)の強い発現にリンクされたアレルの7.4kb、低CR1発現にリンクされたアレルの6.9kb(L:低アレル)である。このリンクは白人やアジア人に見られますが、アフリカ系の人々には見られません19.
赤血球CR1の発現レベルは、SCR10をコードするエキソン13(I643T)およびExON 19コードSCR16(Q981H)におけるポイントヌクレオチド突然変異の存在とも相関している。ホモ接合643I/981Qでは高く、ホモ接合体643T/981H個体20では低い。したがって、「低い」個体は約150 CR1/Eを表現し、「中程度」の個体は約500のCR1/Eを表現し、「高い」個体は約1,000 CR1/Eを表現する。
この赤血球密度多型に加えて、CR1は、異なるサイズの4つの異なる異形型に対応する長さの多形によって特徴付けられる:CR1*1(190 kDa)、CR1*2(220kDa)、CR1*3(160kDa)、およびCR1*4(250 kDa)21と抗原多型の22に対応する。21
CR1/Eの密度が既知の3つの被験者を用いて、CR1/Eの密度を決定するためのフローサイトメトリーに基づく方法を提示します。 低密度レベル(180 CR1/E)、中密度レベル(646 CR1/E)、高密度レベル(966 CR1/E)を発現し、赤血球または赤血球(RBC)の平均蛍光強度(MFI)、またはRBC MFIを測定することは容易です。その後、MFI を CR1/E 密度の関数として表す標準線をプロットできます。CR1/E密度が知られていない被験者のMFIを測定し、これをこの標準線と比較して、個人のCR1/E密度を決定することができる。この技術は、研究室で長年使用されており、全身性エリテマトース(SLE)23、後天性免疫不全症候群(AIDS)24、マラリア25、および最近アルツハイマー病(AD)26、27など多くの病態において、赤血球CR1の発現の低下を検出することを可能26に27している。23抗血栓薬28の場合のように、赤血球と結合するCR1を標的とする薬物の開発は、CR1/E密度の評価、およびCR1を定量化するための堅牢な技術の入手可能性を必要とする。
提示されたプロトコルは、1回で実行されます。特定の市販の96ウェルプレートを使用して多くの個人のCR1/Eの密度を決定するために適応可能です(材料表を参照)。この上で、それは任意の96ウェルプレートに私たちの方法を適応させることは容易です。各サンプルについて、赤血球の細胞懸濁液(0.5 x 106-1 x 106赤血球)がウェルごとに分布する。各井戸に対して、最初の一次抗CR1抗体を添加し、次にストレプトアビジンPE、二次抗ストレプトアビジン抗体、および再びストレプトアビジンPEを、我々の方法のものと同じ希釈を用いるが、体積を適応させ、比例性を尊重することによって。
CR1の範囲の被験者および被験者から採検される被験者からの血液サンプルは、同時に採取し、4°Cの冷蔵庫に保存し、4°C(氷上および/または冷蔵庫)で取り扱う必要があります。

<table><tbody><tr><td>1000Eバリアチップ</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック、F-67403イルキルヒ、フランス</td><td>2079E</td><td>サンプルピペッティング</td></tr><tr><td>1-100&micro;L 面取り、フィルターチップ</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td><td>S1120-1840</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)</td><td>Home production of noncommercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook</td><td></td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>Blouse</td><td></td><td></td><td>protection</td></tr><tr><td>Bovin serum albumin (7,5%)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td>15260037</td><td>サイトメトリー</td></tr><tr><td>Centrifuge Thermo</td><td>Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td></td><td>11176917 Centrifugation</td></tr><tr><td>Clean Solution</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>340345</td><td>サイトメトリー</td></tr><tr><td>Comorack-96</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>944060P</td><td>rack</td></tr><tr><td>Cytometer Setup &トラッキングビーズキット</td><td>BD、F-38801 Le Pont de Claix、フランス</td><td>655051</td><td>サイトメトリー</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液36.5%</td><td>Sigma Aldrich、F-38070 Saint Quentin Fallavier、フランス</td><td>F8775-25ML</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>10 &micro;L 卒業、フィルターチップ</td><td>Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany</td><td>S1121-3810</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>LSRFORTESSA Flow Cytometer</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>647788</td><td>サイトメトリー</td></tr><tr><td>Microman Capillary Pistons</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>067494</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Micronic 1.40 mL 丸底チューブ</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>MP32051</td><td>mix</td></tr><tr><td>マイクロピペット Microman - type M25 -</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>066379</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Phosphate buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France</td><td>10010031</td><td>cytometry</td></tr><tr><td>Pipette PS 325 mm, 10 mL</td><td>Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath</td><td>391952</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>powder-free Nitrile Exam手袋</td><td>Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA</td><td>486802</td><td>sample protection</td></tr><tr><td>Reference 2 pipette, 0,5-10 &micro;L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>4920000024</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Reference 2 pipette, 20-100 &micro;L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>4920000059</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Reference 2 pipette, 100-1000 &micro;L</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>4920000083</td><td>sample pipetting</td></tr><tr><td>Rinse Solution</td><td>BD, F-38801 Le Pont de Claix, France</td><td>340346</td><td>サイトメトリー</td></tr><tr><td>丸底チューブ</td><td>Sarstedt, F-70150 Marnay, France</td><td>55.1579</td><td>サイトメトリー</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン R-PE</td><td>Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France</td><td>AS-60669</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Tapered Centrifuge Tubes 50 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, France</td><td>10203001</td><td>mix</td></tr><tr><td>Vector anti streptavidin biotin</td><td>Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France</td><td>BA-0500</td><td>immunostaining</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA</td><td>SI-0236</td><td>ミックス</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1(CD35、C3b/C4b用補体受容体1型)は、約200kDaの高分子膜糖タンパク質であり、補体活性化を制御し、免疫複合体を輸送し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。CR1は、赤血球を含む多くの細胞型の表面に存在し、長さ、構造(Knops、またはKN、血液群)、および密度において多型を示す。赤血球当たりのCR1(CR1/E)の平均密度は、赤血球当たり500分子である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。ここでは、増幅免疫染色システムの助けを借りて、低密度を発現する被験者を含むCR1/Eの密度を測定する堅牢なフローサイトメトリー法を提示する。この方法により、アルツハイマー病(AD)、全身性エリテマトーシス(SLE)、エイズ、マラリアなどの疾患におけるCR1赤血球発現の低下を示す。

CR1の密度が知られている3人の被験者の赤血球("低"被験者[180 CR1/E]、中型の被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])、およびCR1密度を決定する必要がある2つの被験者の赤血球は、フィロクロム系を用いて免疫染色された。初めに、低い高い範囲からの被験者のCR1密度は、放射線標識抗体を用いてScatchard法29によって決定された。測定された基準(低、中、高)は、較正曲線に使用され、サイトメトリー30の方法によって新しい基準または副標準を定量化することを可能にした。フローサイトメーターで免疫染色赤血球を通過した後、標識の強度を観察し、各被験者の平均蛍光強度(RBC MFI)として測定した(図3F、I;I図 4B,D,F,I,<strong class...

この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

このプロトコルは、対象となる細胞受容体上の抗原部位の数を測定するために使用することができる。この技術の主な利点は、低密度で発現する受容体に対しても、堅牢な結果を生み出す点である。この方法は、CR1赤血球発現の低下の評価を可能にし、これは、アルツハイマー病、全身性エリテマトーシス、エイズ、マラリアなどのものである。このプロトコルは、細胞受容体密度の解析に有用であり、また蛍光顕微鏡による細胞受容体発現の研究に適用することができる。細胞および抗体の分布の間に管を間隔を空け、可能であれば最初の分析の間に細胞測定の専門家を伴うことをお勧めします。フローサイトメトリーによる免疫染色と密度定量の視覚的実証は、解析パラメータを適切に設定する方法を理解するために重要です。分析を開始する前に、血液貯蔵管から250マイクロリットルのEDTA抗凝固全血を摂氏4度の20ミリリットルのPBS-BSAを含む50ミリリットルの円錐管に加える。管の内容物を優しい反転で混ぜ、遠心分離によって細胞を回転させます。上清を捨てるには10ミリリットルのピペットを使用し、溶液の残留容積のペレットを慎重に再懸濁します。20ミリリットルの冷たいPBS-BSAを加え、再び遠心分離機を加えます。遠心分離の終わりに、チューブをラックに入れ、氷の上に置き、洗浄された赤血球の8マイクロリットルをPBS-BSAの3ミリリットルを含む50ミリリットルのチューブに移します。次いで、赤血球を紡糸して穏やかに混ぜ、均質な細胞懸濁液を得る。赤血球免疫染色の場合、希釈赤血球の100マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルチューブに慎重に移し、遠心分離によって赤血球を採取する。上清を捨てた後、PBS-BSAのビオチン化抗CR1 J3D3抗体のマイクロリットル濃度あたり0.5マイクログラムの20マイクロリットルを各ペレットに直接加えます。PBS-BSAバッファーの20マイクロリットルを穏やかな混合で陰性対照細胞に加え、摂氏4度で45分間サンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄ごとに、チューブあたり750マイクロリットルの新鮮なPBS-BSAでサンプルを2回洗浄します。2回目の洗浄後、PBS-BSAのストレプトアビジンフィコエリスリンを1~10マイクロリットル加え、各チューブに穏やかな混合で加え、サンプルを摂氏4度で45分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、実例のようにサンプルを2回洗います。2回目の洗浄後、各細胞サンプルペレットをボルテックス中に450マイクロリットルの固定バッファーで固定し、各サンプルを個々の5ミリリットルの丸底管に移し、摂氏4度で最大48時間保存します。フローサイトメトリーの免疫染色赤血球を解析するには、フローサイトメーターの新しい実験ボタンをクリックし、新しい実験の名前を変更します。サイトメーター設定ウィンドウで、前方散乱、側面散乱、PEを選択します。開いた実験で、サイトメーター設定のアプリケーション設定を選択し、最適化を導くためにグレーのボックスと十字線を使用して、グローバルワークシートを作成します。すべてのパラメータが設定されたら、染色されていないコントロールチューブをサイトメーターにロードして取得を実行し、前方および側面の散乱電圧を最適化して、デブリを排除し、関心のある集団がスケールになるようにします。次に、前方対側散乱プロット上の赤血球の周りにゲートを描き、PE蛍光のドットプロットに赤血球集団を表示する。正の集団がスケール上にある場合は、染色されたコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。サンプルを記録して分析するには、染色したサンプルをアンロードし、新しいグローバルワークシートに前方対側散布図とPE蛍光ヒストグラムを作成します。最初のサンプルを細胞メーターにロードし、取得を実行し、前方対側散乱プロットの赤血球の周りに赤血球ゲートを描画します。PE蛍光ヒストグラムで赤血球集団を表示し、統計タブの下で、赤血球集団に関するPE蛍光パラメータの平均を選択する。取得ダッシュボードで、停止ゲート内のすべてのイベントと記録する 10,000 イベントを選択し、[レコード データ] をクリックします。イベント記録が完了したら、サイトメーターからチューブを取り外します。グローバルワークシートのプロットは図のように見えるはずです。既知のCR1濃度の3つの被験者からの免疫染色赤血球のフローサイトメトリック解析は、被検者ごとに標識の平均蛍光強度の測定を可能にする。赤血球CR1の既知の密度を有する対象の値を用いて曲線をプロットすることにより、これらのデータを平均蛍光強度の関数として報告することができる。この曲線から得られる回帰線を他の被験者の平均蛍光強度の値と比較することで、それらのCR1赤血球密度の判定が可能になる。赤血球と抗体が適切に分布しているので、陰性制御上の実験サンプルの較正曲線はサイトメーターの設定の範囲内にあるように注意してください。この手順を適応させることは、単に一次抗体を変更し、増幅層を適応させることによって、他の密度細胞受容体を測定するために可能である。血液を取り扱うときはいつでも、病原体汚染のリスクがあります。したがって、適切な実験室の練習を使用し、適切な個人的な保護具を着用してください。

measuring-erythrocyte-complement-receptor-1-using-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

このビデオは、マウスの眼に硝子体内送達後の蛍光バイオ粒子のミクログリア取り込みを測定するためのフローサイトメトリーを示しています。フローサイトメトリーは、CD11bを発現する生細胞を検出し、緑色蛍光を示す食作用性ミクログリア細胞を、Ly6C発現単球やLy6G発現好中球などの他の骨髄系細胞と区別します。...

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

このビデオでは、2つの蛍光色素を使用して、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)のCD4+およびCD8+...

末梢血単核細胞中の免疫細胞サブセットを同定するためのフローサイトメトリーアッセイ

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

ここでは、赤血球に対する抗体により誘導される補体活性化を測定するための2つのアッセイを記載する。現在のアッセイ以上の主要な利点は、それらの定量的かつ簡単に解釈する性質である。...

赤血球上の抗体誘導性補体活性化の定量的検出のための方法

単球は、活性化時に解糖代謝に依存する人間の自然免疫系の不可欠な構成要素です。新鮮な全血中の全単球および単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを測定するためのフローサイトメトリープロトコルについて説明します。...

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。...

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

この論文は、イメージングフローサイトメトリーを使用して、T細胞の混合集団におけるアロ反応性を測定するための方法を記載しています。...

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)...

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

本研究は、フローサイトメトリー、FcγR の活性化から生じる活性酸素種 (ROS) 生産を検出するための使用方法を示します。このメソッドは、抗菌および酸化還元シグナル免疫複合体、微生物のオプソニン、または直接 FcγR...

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

学ぶフローサイトメトリーと免疫染色を用いた赤血球補体受容体1（CR1）密度測定法。アルツハイマー病や全身性エリテマトーデスなどの疾患における受容体発現評価に応用可能です。

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

さらに動画を探す