フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定
May 19th, 2020
この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。
このプロトコルは、対象となる細胞受容体上の抗原部位の数を測定するために使用することができる。この技術の主な利点は、低密度で発現する受容体に対しても、堅牢な結果を生み出す点である。この方法は、CR1赤血球発現の低下の評価を可能にし、これは、アルツハイマー病、全身性エリテマトーシス、エイズ、マラリアなどのものである。
このプロトコルは、細胞受容体密度の解析に有用であり、また蛍光顕微鏡による細胞受容体発現の研究に適用することができる。細胞および抗体の分布の間に管を間隔を空け、可能であれば最初の分析の間に細胞測定の専門家を伴うことをお勧めします。フローサイトメトリーによる免疫染色と密度定量の視覚的実証は、解析パラメータを適切に設定する方法を理解するために重要です。
分析を開始する前に、血液貯蔵管から250マイクロリットルのEDTA抗凝固全血を摂氏4度の20ミリリットルのPBS-BSAを含む50ミリリットルの円錐管に加える。管の内容物を優しい反転で混ぜ、遠心分離によって細胞を回転させます。上清を捨てるには10ミリリットルのピペットを使用し、溶液の残留容積のペレットを慎重に再懸濁します。
20ミリリットルの冷たいPBS-BSAを加え、再び遠心分離機を加えます。遠心分離の終わりに、チューブをラックに入れ、氷の上に置き、洗浄された赤血球の8マイクロリットルをPBS-BSAの3ミリリットルを含む50ミリリットルのチューブに移します。次いで、赤血球を紡糸して穏やかに混ぜ、均質な細胞懸濁液を得る。
赤血球免疫染色の場合、希釈赤血球の100マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルチューブに慎重に移し、遠心分離によって赤血球を採取する。上清を捨てた後、PBS-BSAのビオチン化抗CR1 J3D3抗体のマイクロリットル濃度あたり0.5マイクログラムの20マイクロリットルを各ペレットに直接加えます。PBS-BSAバッファーの20マイクロリットルを穏やかな混合で陰性対照細胞に加え、摂氏4度で45分間サンプルをインキュベートします。
インキュベーションの終わりに、1回の洗浄ごとに、チューブあたり750マイクロリットルの新鮮なPBS-BSAでサンプルを2回洗浄します。2回目の洗浄後、PBS-BSAのストレプトアビジンフィコエリスリンを1~10マイクロリットル加え、各チューブに穏やかな混合で加え、サンプルを摂氏4度で45分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、実例のようにサンプルを2回洗います。
2回目の洗浄後、各細胞サンプルペレットをボルテックス中に450マイクロリットルの固定バッファーで固定し、各サンプルを個々の5ミリリットルの丸底管に移し、摂氏4度で最大48時間保存します。フローサイトメトリーの免疫染色赤血球を解析するには、フローサイトメーターの新しい実験ボタンをクリックし、新しい実験の名前を変更します。サイトメーター設定ウィンドウで、前方散乱、側面散乱、PEを選択します。
開いた実験で、サイトメーター設定のアプリケーション設定を選択し、最適化を導くためにグレーのボックスと十字線を使用して、グローバルワークシートを作成します。すべてのパラメータが設定されたら、染色されていないコントロールチューブをサイトメーターにロードして取得を実行し、前方および側面の散乱電圧を最適化して、デブリを排除し、関心のある集団がスケールになるようにします。次に、前方対側散乱プロット上の赤血球の周りにゲートを描き、PE蛍光のドットプロットに赤血球集団を表示する。
正の集団がスケール上にある場合は、染色されたコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。サンプルを記録して分析するには、染色したサンプルをアンロードし、新しいグローバルワークシートに前方対側散布図とPE蛍光ヒストグラムを作成します。最初のサンプルを細胞メーターにロードし、取得を実行し、前方対側散乱プロットの赤血球の周りに赤血球ゲートを描画します。
PE蛍光ヒストグラムで赤血球集団を表示し、統計タブの下で、赤血球集団に関するPE蛍光パラメータの平均を選択する。取得ダッシュボードで、停止ゲート内のすべてのイベントと記録する 10,000 イベントを選択し、[レコード データ] をクリックします。イベント記録が完了したら、サイトメーターからチューブを取り外します。
グローバルワークシートのプロットは図のように見えるはずです。既知のCR1濃度の3つの被験者からの免疫染色赤血球のフローサイトメトリック解析は、被検者ごとに標識の平均蛍光強度の測定を可能にする。赤血球CR1の既知の密度を有する対象の値を用いて曲線をプロットすることにより、これらのデータを平均蛍光強度の関数として報告することができる。
この曲線から得られる回帰線を他の被験者の平均蛍光強度の値と比較することで、それらのCR1赤血球密度の判定が可能になる。赤血球と抗体が適切に分布しているので、陰性制御上の実験サンプルの較正曲線はサイトメーターの設定の範囲内にあるように注意してください。この手順を適応させることは、単に一次抗体を変更し、増幅層を適応させることによって、他の密度細胞受容体を測定するために可能である。
血液を取り扱うときはいつでも、病原体汚染のリスクがあります。したがって、適切な実験室の練習を使用し、適切な個人的な保護具を着用してください。
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概要
このプロトコルは、フローサイトメトリーと免疫染色を用いて赤血球のCR1密度を測定する方法を概説しています。これは、アルツハイマー病や全身性エリテマトーデスなどの様々な状態での受容体発現を評価するのに特に有用です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- CR1は免疫応答に関与する受容体です。
- CR1密度の変化は様々な疾患を示す可能性があります。
- フローサイトメトリーにより受容体密度を正確に測定できます。
- 免疫染色により特定の受容体の検出が向上します。
研究の目的
- 被験者の赤血球におけるCR1密度を決定する。
- CR1密度を他の被験者の既知の値と比較する。
- CR1発現に対する疾患の影響を評価する。
使用された方法
- 受容体密度を定量化するためのフローサイトメトリー。
- 抗CR1モノクローナル抗体による免疫染色。
- 検出向上のためのフィコエリスリン（PE）の使用。
- 結果を評価するための対照被験者との比較。
主要な結果
- 低密度受容体に対する堅牢な結果。
- 様々な疾患におけるCR1発現減少の評価。
- 解析パラメータの理解を助ける視覚的実演。
- 蛍光顕微鏡研究に適用可能なプロトコル。
結論
- この方法はCR1密度を測定するのに効果的です。
- 健康と疾患における受容体発現への洞察を提供します。
- 細胞計測専門家との協力が推奨されます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying erythrocyte complement receptor 1 (CR1) density enables mechanistic de-risking in target validation for immune-mediated diseases. This flow cytometry method supports predictive confidence by detecting low-abundance receptor expression changes linked to Alzheimer's, SLE, AIDS, and malaria. It provides a translational biomarker platform for early discovery and portfolio triage in neuroimmunology and infectious disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures CR1 density to interrogate therapeutic hypotheses in complement-mediated pathways.
- Operational Value: Enables detection of low-density receptor expression using amplifying immunostaining for robust quantification.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by correlating CR1 reduction with disease phenotypes in neurodegenerative and autoimmune conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mean fluorescence intensity (MFI) data for receptor density calibration across subjects.
- Operational Value: Standardizes erythrocyte preparation and immunostaining workflow for reproducible flow cytometry analysis.
- Scientific Value: Enables assay adaptation to other cellular receptors by substituting primary antibody and amplification layers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links CR1 density measurements to disease states such as Alzheimer's and SLE for biomarker validation.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cytometric protocols and global worksheet analysis.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying receptor expression changes in preclinical disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing quantitative receptor density data that informs target confidence and assay readiness for downstream screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of complement receptor involvement in immune complex clearance and cellular immune responses.
- Screening: Delivers standardized, quantitative PE fluorescence outputs for reliable compound effect evaluation on receptor expression.
- Analytics: Enables MFI-based calibration curves to determine unknown CR1 densities from fluorescence intensity readings.
- Translational Research: Connects erythrocyte CR1 measurements to disease-associated expression changes for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunostaining and flow cytometry platform for measuring diverse cell surface receptors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through precise, low-density receptor quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized cell washing, antibody titration, and fixation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking receptor density changes to disease mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on measurable biomarker modulation in disease states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for erythrocyte analysis.
- Dependent on access to cytometer capable of PE fluorescence detection and low-temperature sample handling.
- Necessitates standardization across teams for antibody dilution, incubation timing, and wash consistency.
- Involves adaptation considerations when transferring protocol to other receptor systems or cell types.
- Includes practical limitations such as erythrocyte stability, antibody specificity, and background fluorescence from non-specific binding.
