定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

この手順の全体的な目標は、定量的PCRによって脳脊髄液中のマイクロRNAをプロファイリングし、Gen Xプロフェッショナルソフトウェアを使用してデータを分析することです。これは、最初に脳脊髄液サンプルから全RNAを単離することによって達成されます。2番目のステップは、RNAをCDNAに転写するために逆転写を行うことです。

次に、CDNAをサイバーグリーンマスターミックスと混合し、742のユニークな配列のプライマーを含む384ウェルプレートにロードし、リアルタイムPCRを使用して増幅します。最後のステップは、リアルタイム増幅から取得したデータを分析することです。最終的に、結果は、コントロールの倍率変更、増加または減少として表現し、さまざまなグラフィック表現で視覚化できます。

したがって、チップアレイなどの既存の方法に対する私たちの技術の主な利点は、私たちの方法が非常に感度が高く、必要なRNAの量が最小限であることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、生成される大量のデータとデータ分析のためのソフトウェアの使用のために苦労するでしょう。まず、作業領域とピペットにRNA Zapをスプレーします。

まず、CDNA合成では、テンプレートRNAサンプルをヌクレアーゼフリー水で1マイクロリットルあたり5ナノグラムの濃度に希釈します。次に、5 x 反応バッファーを氷上に静かに置き、解凍します。次に、RNAスパイクに40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて試薬を再懸濁し、チューブをボルテックスして15〜20分間氷上に置きます。

次に、冷凍庫から酵素を取り出し、チューブをフリックして氷の上に置きます。また、すべての試薬が解凍したら、すぐにスピンダウンします。1.5 mL EPHチューブに5 x 反応バッファー酵素を添加して、逆転写酵素ワーキング溶液を調製します。

ヌクレアーゼフリー水とRNAスパイクをテンプレートで混合し、表1に示す割合で混合します。次に、作業溶液を最大速度で1〜2秒間ボルテックスして混合します。溶液を10秒間短時間スピンダウンした後、作業溶液をヌクレアーゼフリーPCRチューブに分注します。

次に、テンプレートRNAをPCRチューブに直接追加します。反応を1〜2秒間穏やかにボルテックスして、すべての試薬が完全に混合されていることを確認し、チューブを10秒間スピンダウンします。サンプルをPCRマシンに入れ、ここに示す設定を入力します。

次に、レトロな文字起こしに従ってプログラムを開始します。CDNAはリアルタイムPCR増幅の準備ができており、摂氏マイナス20度で最大5週間保存できます。リアルタイムPCR増幅を開始するには、まずCDNAとPCRマスターミックスを氷上に置きます。

PCRマスターミックスバイアルを融解中にアルミホイルで覆うことにより、PCRマスターミックスバイアルを光から保護します。ボルテックスを解凍したら、PCRマスターで1〜2秒間混合します。次に、2000マイクロリットルの2つのXPCRマスターミックスと1,980マイクロリットルの水を15ミリリットルの円錐管に組み合わせます。

混合物に20マイクロリットルのCDNAを加え、溶液を1〜2秒間穏やかにボルテックスします。次に、冷蔵遠心分離機で溶液を1,500倍Gで摂氏4度で1分間回転させます。次に、PCR反応ミックスをマルチチャンネルピペットリザーバーに入れます。

プレートシールを取り外す前に、冷蔵遠心分離機ですぐに使用できるプレートをGの1,500倍で簡単に回転させます。次に、CD NAを含むPCRマスターミックス10マイクロリットルを384ウェルプレートの各ウェルに分注します。16チャンネルピペットを使用し、光学シールフィルムでプレートをシールします。

マスターミックスを加えた後、冷蔵遠心分離機でプレートを1,500倍Gで短時間回転させ、溶液をウェルの底に引き込みます。サンプルを混合し、気泡を取り除き、実験を一時停止します。この時点で、反応は摂氏4度の光から保護された場所に最大24時間保存します。

次に、表2に詳述されているパラメータに従って、リアルタイムPCR増幅および融解曲線解析を行います。解析を開始するには、Roche light cycler で 2 次微分解析方法を選択します。次に、定量化サイクルまたは CQ 値を計算します。

データをテーブルとしてエクスポートし、テキストファイルとして保存します。次に、最初にgon import wizardボタンをクリックし、次に次のウィンドウで[start]をクリックして、データをGen Xにインポートし、フォーマット機器とプレートレイアウトファイルを選択します。プレートレイアウトのExcelファイルは、GONのWebサイトからダウンロードできます。

次に、パネル1をインポートし、[次へ]をクリックします。このステップでは、ファイルのインポート後に生成されるテーブルに、事前定義された列、サンプル名の編集、および分類列の追加と削除が含まれます。完了したら [次へ] をクリックし、データを保存します。

次に、データエディタにロードします まず、前処理メニューからINTERPLATEキャリブレーションを選択してプレート間のデータをキャリブレーションし、すべてのプレートが同じパラメータを使用して計算されるようにします。次に、閾値 cycle または ct より大きいデータを破棄するカットオフ値を定義します。マイクロRNAのCTが3つのレプリカのうち1つのレプリカで大きい場合、その読み取り値は他の2つのプローブからのCTの平均に置き換えられます。

参照遺伝子を定義するには、すべてのサンプルで同様のCQ値を持つmicroRNAのリストを選択し、遺伝子ノルムを実行します。次に、得られた参照遺伝子を用いてデータを正規化します。結果の値はデルタ ct に対応します。

空の列とほぼ空の列を削除するには、前処理ウィンドウを開いて [検証シート] を選択し、下の行の [空の列の削除] 行で [適用] を選択します。有効なデータの割合を選択し、[適用] をクリックします。すべてのサンプルに共通のマイクロRNAのみを比較する場合は、100%を選択します。

最終的なMDFファイルをGen Xにロードし、データマネージャーを開いてクラスターを分類し、マイクロRNAとサンプルをヒートマップと樹状グラムで視覚化します。次に、サンプルのグループを選択して作成し、完了したら[適用]をクリックします。次に、コントロールパネルウィンドウで、[実行]をクリックします。

ヒート マップを TIFF やビットマップなどの目的の形式で保存し、必要に応じてヒート マップをコピーして変更します。このグラフィックバーは、10の可能なマイクロRNA参照遺伝子を分析するために、Gen X内のGノルムアプリケーションから取得されました。これらの結果は、MIR622およびMI1,266が最も安定して発現するマイクロRNAであることを示しています。

ここに示されている箱ひげ図は、HIVEおよび脳炎のないHIVプラスのグループ内の統計的に有意な11のmicroRNAのそれぞれのデータの分布を示しています。各列のプロットは、中央値、第 1 四分位数、第 3 四分位数、および最大値と最小値を示します。この手順に従うと、任意の体液、組織サンプル、および培養細胞に対してミネラルプロファイリングを実行できます。