Name: 定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング法。定量リアルタイムPCRとGen Xソフトウェアを用いて、742種類のマイクロRNAを検出し、神経疾患のバイオマーカー探索や神経生物学的メカニズムの解明に貢献します。

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国立精神衛生研究所から：記載されたプロジェクトは、受賞番号R01MH079751（F·ペルッツィPI）によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立精神衛生研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

マイクロRNAは、翻訳を阻害および/ ​​またはmRNA分解2を促進することにより、遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAである。による無細胞条件で​​の高い安定性のために、マイクロRNAは、多くの体液中で検出されている。さらに、マイクロRNAの別個の発現プロフィールがヒトの癌3-9の様々な段階および/ ​​または進行と相関している。 古典チップアレイまたは最新の深いシーケンシング技術を含むマイクロRNAのプロファイルを作成するために利用できるいくつかのツールがあります。しかし、我々はRNAの最小量を必要とするというさらなる利点を有する高感度のqPCRプラットフォーム10,11を利用することを選んだ。 miRCURY LNAユニバーサルRT microRNAのPCRプロトコールは、完全な2のパネルアレイの40 NGを20μlのcDNA合成反応あたり20 ngの全RNAを使用するように最適化されています。 valuablを扱うときにRNAの少量を使用するオプションを持つことは非常に重要である<html> EなどCSF...

マイクロRNAは、転写後に遺伝子発現を調節する非コードRNA（長さ21〜23ヌクレオチド）の小さなファミリーに属する。マイクロRNAは、比較的安定であると思われる細胞外空間に分泌させることができる。 miRNAの発現の変化を決定するmiRNAプロファイルを行い、大量のデータを処理する、バイオマーカーの同定に向けた重要なステップであることができるが威圧されてもよい。 ここでは、敏感なリアルタイムPCRによって（他の体液に適用）脳脊髄液におけるmiRNA発現の変化を決定するためのプロトコルを記載している。また、統計分析および結果のグラフ表示を含む、データ分析のためのソフトウェアの使用を記載している。全体の手順は、比較的容易かつ簡単であり、プロファイリングおよびリアルタイムPCRマシンの数が利用可能な、比較的迅速されるサンプルの数に応じ。実験の部は、取り扱いの精度が要求さ384ウェルプレートへピペッティングRNA、ジェネックスを用いてデータ解析部インフォマティクスと統計の一部の基本的な知識を必要とする。

<table><tbody><tr><td colspan="4">表 3.機器一覧</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus マルチチャンネルピペッター </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip ピペットチップ </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> サーマルサイクラー C1000 </td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ml ロープロファイル, クリアPCRチューブ </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> フラットキャップストリップ </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480リアルタイムPCRシステム</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 シーリングホイル</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機 5804R </td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> スイングバケットローター、4 プレース </td><td>エッペンドルフ</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> ベンチトップミニ遠心分離機 </td><td>フィッシャー</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> ベンチトップボルテックス</td>フィ<td>ッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ、滅菌済み </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Matrix 試薬リザーバー、25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ ミニ遠心分離機シグマ 1-15</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ベンチトップ渦 </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 4.試薬一覧.</td></tr><tr><td> Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase フリー </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA すぐに使用できるPCR Human Panels (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations</</td><td>p>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 RNA carrier </td><td>Roche Applied Science</td><td>10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> エタノール 100% </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> Nuclease free water </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

定量リアルタイムpcrを用いて脳脊髄液マイクロrnaプロファイリング

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html>マイクロRNA（miRNA）は、それらの翻訳抑制を調節することにより、mRNAおよびその結果として、上に位置する部位を標的とするRISCを誘導することにより、遺伝子制御の強力な層を構成している。 miRNA発現の変化は、すべての主要な複雑な疾患の発症に関与することが示されている。さらに、最近の知見は、miRNAが細胞外環境に分泌し、それらが高い安定性で循環することができ、血流および他の体液を入力することができることを示した。このような循環のmiRNAの機能は、主にとらえどころのないままですが、このようなmiRNAプロファイリングアレイのような体系的な高スループットのアプローチは、神経変性疾患や癌のいくつかのタイプを含むいくつかの病的状態におけるmiRNAシグネチャーの同定につながるている。この文脈において、脳脊髄液中のmiRNA発現プロファイルの同定は、我々の最近の研究で報告されたように、バイオマーカー分析のためのmiRNAの魅力的な候補にする。 _content &quot;&gt;このようなマイクロアレイ、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）、および深いシーケンシングなどのマイクロRNAのプロファイリングに利用できるいくつかのツールがあります。ここでは、定量的リアルタイムPCRにより脳脊髄液中のマイクロRNAのプロファイルを作成するための感度の高い方法を記載している。私たちは、 Exiqon社のマイクロRNAを使用し、すぐに使用できるPCR法人間のパネルIと742のユニークな人間のマイクロRNAの検出を可能にする二V2.R、我々は、三連の実行で配列を行い、我々は処理され、ジェネックスプロフェッショナル5ソフトウェアを使用してデータを分析した。 このプロトコルを使用して、我々は成功した細胞株および初代細胞の様々な種類のマイクロRNA、CSF、血漿、およびホルマリン固定パラフィン包埋組織をプロファイルしています。

この研究からの結果は、以前に公開されている1。geNormアプリケーションを使用して、候補参照マイクロRNAの解析から1の結果を示す図 。したがって、2つのマイクロRNAは、miR-622及びmiR-1266は、参照遺伝子として同定されたおよびmiRNA値を正規化するために使用した。 CSFの研究のために、我々は、サンプルの三つのグループを有していた：HIV-（n = 10）に、HIVE脳炎なし（n = 4）に、およびHIV +（HIV +、n = 5）であった。二つのグループは、HIVEおよびHIV +は、HIV-対照群と比較した。統計分析の後に（2.3.3項）11マイクロRNAの発現レベルは、統計的に有意な1発見された。 図2は 、この11マイクロRNA、のmiR-1203-1224-3P、-182 *、-19B-2 *のボックスプロットを表し-204、-362-5P、-484、...

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

本手順の目的は、定量PCRを用いて脳脊髄液中のmicroRNAをプロファイリングし、Gen X Professionalソフトウェアを用いてデータを解析することです。まず、脳脊髄液サンプルから全RNAを単離します。次に、RNAをcDNAに転写するため、逆転写反応を行います。次に、CDNAsを、742個のユニークな配列に対するプライマーが入った384ウェルプレートに充填されたCyber Greenマスターミックスと混合し、リアルタイムPCRを用いて増幅させます。最終ステップは、リアルタイム増幅から得られたデータを解析することです。最終的に、結果はコントロールに対する増加または減少の倍率変化として的に表し、さまざまな形式のグラフで可視化することができます。本手法のチップアレイなどの既存手法に対する主な利点は、感度が非常に高く、必要となるRNA量が極めて少ないことです。一般的に、この手法を初めて行う方は、生成されるデータ量が膨大であることや、データ解析ソフトの使用に苦労することがあります。まず、作業領域とピペットにRNA Zapをスプレーしてください。まず、cDNA合成のために、テンプレートRNAサンプルをヌクレアーゼフリーウォーターを用いて5 ng/µLの濃度に希釈します。次に、5x反応バッファーを氷上に静かに置いて融解させます。その後、RNAスパイクインに40 µLのヌクレアーゼフリーウォーターを加えて試薬を再懸濁させ、チューブをボルテックスした後、氷上で15〜20分間静置します。次に、フリーザーから酵素を取り出し、チューブを軽く叩いてから氷上に置きます。また、すべての試薬が融解したら、速やかにスピンダウンしてください。1.5 mLのephチューブに、5 x 反応バッファーと酵素を加えて、逆転写酵素ワーキングソリューションを調製します。表1に示した割合に従い、ヌクレアーゼフリー水とRNAスパイクインテンプレートを混合します。次に、最大速度で1〜2秒間ボルテックスし、作業溶液を混合します。溶液を10秒間短時間遠心し、その後、作業溶液をヌクレアーゼフリーPCRチューブに分注します。次に、テンプレートRNAをPCRチューブに直接加えます。すべての試薬が十分に混ざるように、反応液を1〜2秒間軽くボルテックスし、チューブを10秒間スピンダウンします。サンプルをPCRマシンにセットし、ここに示す設定を入力します。次に、逆転写後のプログラムを開始します。cDNAはリアルタイムPCR増幅に使用可能な状態であり、-20°Cで最大5週間保存できます。リアルタイムPCR増幅を開始するには、まずcDNAとPCRマスターミックスを氷上に置きます。PCRマスターミックスのバイアルを融解させる際、アルミホイルで覆い、光から保護します。融解後、PCRマスターミックスを1〜2秒間ボルテックスします。次に、15 mLのコニカルチューブに2 X PCRマスターミックス 2000 µLと水 1,980 µLを合わせます。混合液にCDNAを20 µL加え、1〜2秒間穏やかにボルテックスします。その後、冷蔵遠心機を用い、4 °Cで1,500 ×gにて1分間遠心分離します。次に、PCR反応液をマルチチャンネルピペット用リザーバーに移します。プレートシールを取り外す前に、準備済みのプレートを冷却遠心機で 1,500 ×g で短時間遠心します。次に、CD NAを含む PCR マスターミックス 10 µL を 384 ウェルプレートの各ウェルに分注します。分注には 16 チャンネルピペットを使用し、プレートを光学シールフィルムで密封してください。マスターミックスを添加した後、プレートを冷却遠心機で1,500 ×gで短時間遠心し、溶液をウェルの底に集めます。サンプルを混合し、気泡を除去して実験を一時停止します。この時点で、反応液を遮光した4 °Cの環境で最大24時間保存します。次に、表2に詳述されているパラメータに従って、リアルタイムPCR増幅および融解曲線分析を行います。分析を開始するには、Roche light cyclerで二次微分分析法を選択します。その後、定量サイクルまたはCQ値を算出します。データをテーブルとしてエクスポートし、テキストファイルとして保存します。次に、まずGONインポートウィザードボタンをクリックし、次のウィンドウで「Start」をクリックしてデータをGen Xにインポートします。フォーマットとして、インストゥルメントファイルとプレートレイアウトファイルを選択してください。プレートレイアウトのExcelファイルは、GONのウェブサイトからダウンロード可能です。次にパネル1をインポートし、「next」をクリックします。ファイルのインポート後に生成されるテーブルには定義済みの列が含まれています。このステップでサンプル名の編集、および分類列の追加または削除を行ってください。完了したら「next」をクリックし、データを保存します。その後、データをデータエディターにロードします。まず、プリプロセッシングメニューからINTERPLATEキャリブレーションを選択してプレート間のデータを校正し、すべてのプレートが同一のパラメータを用いて算出されるようにします。次に、しきい値サイクル（ct）より高いデータを破棄するためのカットオフ値を設定します。あるmicroRNAにおいて、3つのレプリカのうち1つのCT値が他の2つより大きい場合、その読み取り値は他の2つのプローブのCT値の平均値で置き換えられます。すべてのサンプルにおいて同様のCQ値を持つmicroRNAのリストを選択してリファレンス遺伝子を定義し、gene normを実行します。次に、得られたリファレンス遺伝子を用いてデータを正規化します。算出された値がdelta ctに対応します。前処理ウィンドウを開き、「validate sheet」を選択して空またはほぼ空の列を削除します。次に、その下の行にある「remove empty columns」の行で「Apply」を選択します。有効なデータの希望する割合を選択し、「apply」をクリックします。すべてのサンプルに共通するmicroRNAのみを比較したい場合は、100%を選択してください。最終的なMDFファイルをGen Xにロードし、データマネージャーを開いてクラスターの分類を行い、microRNAおよびサンプルのヒートマップとデンドログラムを視覚化します。次に、サンプルのグループを選択して作成し、完了したら適用をクリックします。続いて、コントロールパネルウィンドウで実行をクリックします。ヒートマップをTIFFやビットマップなどの希望する形式で保存し、必要に応じてコピーおよび修正を行います。このグラフィックバーは、10個のmicroRNAリファレンス遺伝子の候補を解析するために、Gen X内のG normアプリケーションから取得したものです。これらの結果は、MIR 622およびMI 1, 266が最も安定して発現しているmicroRNAであることを示しています。ここに示されたボックスプロットは、HIVE群および脳炎を伴わないHIV群における、統計的に有意な11種類のmicroRNAそれぞれのデータの分布を示しています。各列のプロットは、中央値、第1四分位数および第3四分位数、ならびに最大値と最小値を示しています。この手順に従い、あらゆる体液、組織サンプル、および培養細胞に対してミネラルプロファイリングを行うことができます。

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医学

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