Name: 定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング法。定量リアルタイムPCRとGen Xソフトウェアを用いて、742種類のマイクロRNAを検出し、神経疾患のバイオマーカー探索や神経生物学的メカニズムの解明に貢献します。

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国立精神衛生研究所から：記載されたプロジェクトは、受賞番号R01MH079751（F·ペルッツィPI）によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立精神衛生研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

マイクロRNAは、翻訳を阻害および/ ​​またはmRNA分解2を促進することにより、遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAである。による無細胞条件で​​の高い安定性のために、マイクロRNAは、多くの体液中で検出されている。さらに、マイクロRNAの別個の発現プロフィールがヒトの癌3-9の様々な段階および/ ​​または進行と相関している。 古典チップアレイまたは最新の深いシーケンシング技術を含むマイクロRNAのプロファイルを作成するために利用できるいくつかのツールがあります。しかし、我々はRNAの最小量を必要とするというさらなる利点を有する高感度のqPCRプラットフォーム10,11を利用することを選んだ。 miRCURY LNAユニバーサルRT microRNAのPCRプロトコールは、完全な2のパネルアレイの40 NGを20μlのcDNA合成反応あたり20 ngの全RNAを使用するように最適化されています。 valuablを扱うときにRNAの少量を使用するオプションを持つことは非常に重要である<html> EなどCSF...

マイクロRNAは、転写後に遺伝子発現を調節する非コードRNA（長さ21〜23ヌクレオチド）の小さなファミリーに属する。マイクロRNAは、比較的安定であると思われる細胞外空間に分泌させることができる。 miRNAの発現の変化を決定するmiRNAプロファイルを行い、大量のデータを処理する、バイオマーカーの同定に向けた重要なステップであることができるが威圧されてもよい。 ここでは、敏感なリアルタイムPCRによって（他の体液に適用）脳脊髄液におけるmiRNA発現の変化を決定するためのプロトコルを記載している。また、統計分析および結果のグラフ表示を含む、データ分析のためのソフトウェアの使用を記載している。全体の手順は、比較的容易かつ簡単であり、プロファイリングおよびリアルタイムPCRマシンの数が利用可能な、比較的迅速されるサンプルの数に応じ。実験の部は、取り扱いの精度が要求さ384ウェルプレートへピペッティングRNA、ジェネックスを用いてデータ解析部インフォマティクスと統計の一部の基本的な知識を必要とする。

<table><tbody><tr><td colspan="4">表 3.機器一覧</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus マルチチャンネルピペッター </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip ピペットチップ </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> サーマルサイクラー C1000 </td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ml ロープロファイル, クリアPCRチューブ </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> フラットキャップストリップ </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480リアルタイムPCRシステム</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 シーリングホイル</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機 5804R </td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> スイングバケットローター、4 プレース </td><td>エッペンドルフ</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> ベンチトップミニ遠心分離機 </td><td>フィッシャー</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> ベンチトップボルテックス</td>フィ<td>ッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ、滅菌済み </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Matrix 試薬リザーバー、25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ ミニ遠心分離機シグマ 1-15</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ベンチトップ渦 </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 4.試薬一覧.</td></tr><tr><td> Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase フリー </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA すぐに使用できるPCR Human Panels (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA isolation Kit, 40 isolations</</td><td>p>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 RNA carrier </td><td>Roche Applied Science</td><td>10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> エタノール 100% </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> Nuclease free water </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

定量リアルタイムpcrを用いて脳脊髄液マイクロrnaプロファイリング

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html>マイクロRNA（miRNA）は、それらの翻訳抑制を調節することにより、mRNAおよびその結果として、上に位置する部位を標的とするRISCを誘導することにより、遺伝子制御の強力な層を構成している。 miRNA発現の変化は、すべての主要な複雑な疾患の発症に関与することが示されている。さらに、最近の知見は、miRNAが細胞外環境に分泌し、それらが高い安定性で循環することができ、血流および他の体液を入力することができることを示した。このような循環のmiRNAの機能は、主にとらえどころのないままですが、このようなmiRNAプロファイリングアレイのような体系的な高スループットのアプローチは、神経変性疾患や癌のいくつかのタイプを含むいくつかの病的状態におけるmiRNAシグネチャーの同定につながるている。この文脈において、脳脊髄液中のmiRNA発現プロファイルの同定は、我々の最近の研究で報告されたように、バイオマーカー分析のためのmiRNAの魅力的な候補にする。 _content &quot;&gt;このようなマイクロアレイ、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）、および深いシーケンシングなどのマイクロRNAのプロファイリングに利用できるいくつかのツールがあります。ここでは、定量的リアルタイムPCRにより脳脊髄液中のマイクロRNAのプロファイルを作成するための感度の高い方法を記載している。私たちは、 Exiqon社のマイクロRNAを使用し、すぐに使用できるPCR法人間のパネルIと742のユニークな人間のマイクロRNAの検出を可能にする二V2.R、我々は、三連の実行で配列を行い、我々は処理され、ジェネックスプロフェッショナル5ソフトウェアを使用してデータを分析した。 このプロトコルを使用して、我々は成功した細胞株および初代細胞の様々な種類のマイクロRNA、CSF、血漿、およびホルマリン固定パラフィン包埋組織をプロファイルしています。

この研究からの結果は、以前に公開されている1。geNormアプリケーションを使用して、候補参照マイクロRNAの解析から1の結果を示す図 。したがって、2つのマイクロRNAは、miR-622及びmiR-1266は、参照遺伝子として同定されたおよびmiRNA値を正規化するために使用した。 CSFの研究のために、我々は、サンプルの三つのグループを有していた：HIV-（n = 10）に、HIVE脳炎なし（n = 4）に、およびHIV +（HIV +、n = 5）であった。二つのグループは、HIVEおよびHIV +は、HIV-対照群と比較した。統計分析の後に（2.3.3項）11マイクロRNAの発現レベルは、統計的に有意な1発見された。 図2は 、この11マイクロRNA、のmiR-1203-1224-3P、-182 *、-19B-2 *のボックスプロットを表し-204、-362-5P、-484、...

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

本手順の目的は、定量PCRを用いて脳脊髄液中のmicroRNAをプロファイリングし、Gen X Professionalソフトウェアを用いてデータを解析することです。まず、脳脊髄液サンプルから全RNAを単離します。次に、RNAをcDNAに転写するため、逆転写反応を行います。次に、CDNAsを、742個のユニークな配列に対するプライマーが入った384ウェルプレートに充填されたCyber Greenマスターミックスと混合し、リアルタイムPCRを用いて増幅させます。最終ステップは、リアルタイム増幅から得られたデータを解析することです。最終的に、結果はコントロールに対する増加または減少の倍率変化として的に表し、さまざまな形式のグラフで可視化することができます。本手法のチップアレイなどの既存手法に対する主な利点は、感度が非常に高く、必要となるRNA量が極めて少ないことです。一般的に、この手法を初めて行う方は、生成されるデータ量が膨大であることや、データ解析ソフトの使用に苦労することがあります。まず、作業領域とピペットにRNA Zapをスプレーしてください。まず、cDNA合成のために、テンプレートRNAサンプルをヌクレアーゼフリーウォーターを用いて5 ng/µLの濃度に希釈します。次に、5x反応バッファーを氷上に静かに置いて融解させます。その後、RNAスパイクインに40 µLのヌクレアーゼフリーウォーターを加えて試薬を再懸濁させ、チューブをボルテックスした後、氷上で15〜20分間静置します。次に、フリーザーから酵素を取り出し、チューブを軽く叩いてから氷上に置きます。また、すべての試薬が融解したら、速やかにスピンダウンしてください。1.5 mLのephチューブに、5 x 反応バッファーと酵素を加えて、逆転写酵素ワーキングソリューションを調製します。表1に示した割合に従い、ヌクレアーゼフリー水とRNAスパイクインテンプレートを混合します。次に、最大速度で1〜2秒間ボルテックスし、作業溶液を混合します。溶液を10秒間短時間遠心し、その後、作業溶液をヌクレアーゼフリーPCRチューブに分注します。次に、テンプレートRNAをPCRチューブに直接加えます。すべての試薬が十分に混ざるように、反応液を1〜2秒間軽くボルテックスし、チューブを10秒間スピンダウンします。サンプルをPCRマシンにセットし、ここに示す設定を入力します。次に、逆転写後のプログラムを開始します。cDNAはリアルタイムPCR増幅に使用可能な状態であり、-20°Cで最大5週間保存できます。リアルタイムPCR増幅を開始するには、まずcDNAとPCRマスターミックスを氷上に置きます。PCRマスターミックスのバイアルを融解させる際、アルミホイルで覆い、光から保護します。融解後、PCRマスターミックスを1〜2秒間ボルテックスし

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我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。...

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。...

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

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エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

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分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。...

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

色素ベースの化学および液滴デジタルPCR技術を使用した無細胞マイクロRNA定量のための高感度で正確な方法が説明されています。...

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs...

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

学ぶ脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング法。定量リアルタイムPCRとGen Xソフトウェアを用いて、742種類のマイクロRNAを検出し、神経疾患のバイオマーカー探索や神経生物学的メカニズムの解明に貢献します。

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

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