定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング
2014年1月22日
私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。
この手順の全体的な目標は、定量的PCRによって脳脊髄液中のマイクロRNAをプロファイリングし、Gen Xプロフェッショナルソフトウェアを使用してデータを分析することです。これは、最初に脳脊髄液サンプルから全RNAを単離することによって達成されます。2番目のステップは、RNAをCDNAに転写するために逆転写を行うことです。
次に、CDNAをサイバーグリーンマスターミックスと混合し、742のユニークな配列のプライマーを含む384ウェルプレートにロードし、リアルタイムPCRを使用して増幅します。最後のステップは、リアルタイム増幅から取得したデータを分析することです。最終的に、結果は、コントロールの倍率変更、増加または減少として表現し、さまざまなグラフィック表現で視覚化できます。
したがって、チップアレイなどの既存の方法に対する私たちの技術の主な利点は、私たちの方法が非常に感度が高く、必要なRNAの量が最小限であることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、生成される大量のデータとデータ分析のためのソフトウェアの使用のために苦労するでしょう。まず、作業領域とピペットにRNA Zapをスプレーします。
まず、CDNA合成では、テンプレートRNAサンプルをヌクレアーゼフリー水で1マイクロリットルあたり5ナノグラムの濃度に希釈します。次に、5 x 反応バッファーを氷上に静かに置き、解凍します。次に、RNAスパイクに40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて試薬を再懸濁し、チューブをボルテックスして15〜20分間氷上に置きます。
次に、冷凍庫から酵素を取り出し、チューブをフリックして氷の上に置きます。また、すべての試薬が解凍したら、すぐにスピンダウンします。1.5 mL EPHチューブに5 x 反応バッファー酵素を添加して、逆転写酵素ワーキング溶液を調製します。
ヌクレアーゼフリー水とRNAスパイクをテンプレートで混合し、表1に示す割合で混合します。次に、作業溶液を最大速度で1〜2秒間ボルテックスして混合します。溶液を10秒間短時間スピンダウンした後、作業溶液をヌクレアーゼフリーPCRチューブに分注します。
次に、テンプレートRNAをPCRチューブに直接追加します。反応を1〜2秒間穏やかにボルテックスして、すべての試薬が完全に混合されていることを確認し、チューブを10秒間スピンダウンします。サンプルをPCRマシンに入れ、ここに示す設定を入力します。
次に、レトロな文字起こしに従ってプログラムを開始します。CDNAはリアルタイムPCR増幅の準備ができており、摂氏マイナス20度で最大5週間保存できます。リアルタイムPCR増幅を開始するには、まずCDNAとPCRマスターミックスを氷上に置きます。
PCRマスターミックスバイアルを融解中にアルミホイルで覆うことにより、PCRマスターミックスバイアルを光から保護します。ボルテックスを解凍したら、PCRマスターで1〜2秒間混合します。次に、2000マイクロリットルの2つのXPCRマスターミックスと1,980マイクロリットルの水を15ミリリットルの円錐管に組み合わせます。
混合物に20マイクロリットルのCDNAを加え、溶液を1〜2秒間穏やかにボルテックスします。次に、冷蔵遠心分離機で溶液を1,500倍Gで摂氏4度で1分間回転させます。次に、PCR反応ミックスをマルチチャンネルピペットリザーバーに入れます。
プレートシールを取り外す前に、冷蔵遠心分離機ですぐに使用できるプレートをGの1,500倍で簡単に回転させます。次に、CD NAを含むPCRマスターミックス10マイクロリットルを384ウェルプレートの各ウェルに分注します。16チャンネルピペットを使用し、光学シールフィルムでプレートをシールします。
マスターミックスを加えた後、冷蔵遠心分離機でプレートを1,500倍Gで短時間回転させ、溶液をウェルの底に引き込みます。サンプルを混合し、気泡を取り除き、実験を一時停止します。この時点で、反応は摂氏4度の光から保護された場所に最大24時間保存します。
次に、表2に詳述されているパラメータに従って、リアルタイムPCR増幅および融解曲線解析を行います。解析を開始するには、Roche light cycler で 2 次微分解析方法を選択します。次に、定量化サイクルまたは CQ 値を計算します。
データをテーブルとしてエクスポートし、テキストファイルとして保存します。次に、最初にgon import wizardボタンをクリックし、次に次のウィンドウで[start]をクリックして、データをGen Xにインポートし、フォーマット機器とプレートレイアウトファイルを選択します。プレートレイアウトのExcelファイルは、GONのWebサイトからダウンロードできます。
次に、パネル1をインポートし、[次へ]をクリックします。このステップでは、ファイルのインポート後に生成されるテーブルに、事前定義された列、サンプル名の編集、および分類列の追加と削除が含まれます。完了したら [次へ] をクリックし、データを保存します。
次に、データエディタにロードします まず、前処理メニューからINTERPLATEキャリブレーションを選択してプレート間のデータをキャリブレーションし、すべてのプレートが同じパラメータを使用して計算されるようにします。次に、閾値 cycle または ct より大きいデータを破棄するカットオフ値を定義します。マイクロRNAのCTが3つのレプリカのうち1つのレプリカで大きい場合、その読み取り値は他の2つのプローブからのCTの平均に置き換えられます。
参照遺伝子を定義するには、すべてのサンプルで同様のCQ値を持つmicroRNAのリストを選択し、遺伝子ノルムを実行します。次に、得られた参照遺伝子を用いてデータを正規化します。結果の値はデルタ ct に対応します。
空の列とほぼ空の列を削除するには、前処理ウィンドウを開いて [検証シート] を選択し、下の行の [空の列の削除] 行で [適用] を選択します。有効なデータの割合を選択し、[適用] をクリックします。すべてのサンプルに共通のマイクロRNAのみを比較する場合は、100%を選択します。
最終的なMDFファイルをGen Xにロードし、データマネージャーを開いてクラスターを分類し、マイクロRNAとサンプルをヒートマップと樹状グラムで視覚化します。次に、サンプルのグループを選択して作成し、完了したら[適用]をクリックします。次に、コントロールパネルウィンドウで、[実行]をクリックします。
ヒート マップを TIFF やビットマップなどの目的の形式で保存し、必要に応じてヒート マップをコピーして変更します。このグラフィックバーは、10の可能なマイクロRNA参照遺伝子を分析するために、Gen X内のGノルムアプリケーションから取得されました。これらの結果は、MIR622およびMI1,266が最も安定して発現するマイクロRNAであることを示しています。
ここに示されている箱ひげ図は、HIVEおよび脳炎のないHIVプラスのグループ内の統計的に有意な11のmicroRNAのそれぞれのデータの分布を示しています。各列のプロットは、中央値、第 1 四分位数、第 3 四分位数、および最大値と最小値を示します。この手順に従うと、任意の体液、組織サンプル、および培養細胞に対してミネラルプロファイリングを実行できます。
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概要
本プロトコルでは、リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液（CSF）中のmicroRNAをプロファイリングする方法について解説します。この手法は、他の体液、培養細胞、または組織検体から抽出したRNAにも適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 分子生物学
- ゲノミクス
背景
- マイクロRNAは、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしています。
- 脳脊髄液は、神経生物学的プロセスの研究における貴重なソースとなります。
- リアルタイムPCRにより、RNAの定量分析が可能になります。
- マイクロRNAプロファイルを理解することは、神経疾患の診断に役立ちます。
研究目的
- 定量的PCRを用いて、脳脊髄液（CSF）中のmicroRNAをプロファイリングする。
- さまざまな生物学的試料におけるRNA解析のための信頼性の高い手法を提供する。
- Gen X professionalソフトウェアを用いたデータ解析を容易にする。
使用した手法
- CSFサンプルからの全RNAの抽出。
- RNAをcDNAに変換するための逆転写。
- 384ウェルプレートでのSYBR Greenマスターミックスを用いたcDNAの増幅。
- フォールドチェンジを決定するためのリアルタイムPCR結果のデータ解析。
主な結果
- 742種類の固有なmicroRNA配列のプロファイリングに成功。
- 定量結果をコントロールに対する倍率変化（fold change）として提示。
- データ視覚化により、さまざまなグラフィック表現を提供。
- 本手法は、他のサンプルタイプへの適応性があることを実証。
結論
- このプロトコールは、脳脊髄液（CSF）におけるmicroRNAのプロファイリングに有効です。
- リアルタイムPCRは、他の生物学的試料にも適用可能です。
- 得られた結果は、神経生物学的メカニズムの理解を深めるのに役立ちます。
よくある質問
産業界における重要性
脳脊髄液中のmicroRNAを定量リアルタイムPCRでプロファイリングすることで、疾患に関連する分子シグネチャーを感度良く検出でき、神経変性疾患や複雑な疾患における早期段階のバイオマーカー探索を支援します。このワークフローは、細胞外miRNA発現に関する堅牢な定量データを提供することで、トランスレーショナルリサーチにおける予測の信頼性を向上させます。ハイスループットなmiRNAプロファイリングの統合は、バイオマーカーの検証および前臨床の転換点におけるポートフォリオ決定に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
早期発見およびターゲット検証
- 疾患メカニズムに関連するmiRNA介在性の調節経路の解析を可能にする。
- 対照群のCSFサンプルに対する疾患群のCSFサンプルにおけるmiRNA発現変化を定量化することで、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 標準化のための安定したリファレンスmiRNAを特定することにより、生物学的リスクの低減を促進する。
- さらなるバリデーションに向けた候補バイオマーカーの優先順位付けのための定量的な根拠を提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 検証済みのPCRパネルを用いて、742種類の固有ターゲットにわたる標準化され再現性のあるmiRNA定量を実現します。
- ダウンストリームのスクリーニングや比較解析に適した、高コンテンツの定量的出力を生成します。
- CSF、血漿、組織を含む多様なサンプルタイプにおいて、アッセイの拡張性とプラットフォームの再利用を可能にします。
- 低発現miRNAの高感度な検出を保証することで、堅牢な化合物評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 神経疾患および腫瘍学的適応における、miRNAプロファイリングと疾患関連バイオマーカー探索を整合させます。
- サンプル間およびコホート間の比較を可能にすることで、探索から前臨床検証までの継続性を確保します。
- リスク調整済みデータを提供し、バイオマーカー候補のトランスレーショナル研究への移行を支援します。
- 疾患フェノタイプに関連するmiRNAシグネチャーを定量化することで、予測的なリスク低減を強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この定量PCRベースのmiRNAプロファイリング法は、バイオマーカーの探索から検証に至る一連の流れに適合しており、初期探索、アッセイ開発、およびトランスレーショナルリサーチのワークフローを橋渡しするものです。
- 探索生物学： CSFにおけるmiRNA発現変化を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 大規模なmiRNAプロファイリングに向けた、再現性の高いハイスループットアッセイの準備を可能にします。
- 分析： 頑健な条件比較のための定量的なフォールドチェンジデータおよび統計出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 前臨床および臨床のサンプルタイプ間で、バイオマーカーの整合性と連続性を確保します。
- エンタープライズでの再利用： 複数の生物学的マトリックスにおけるmiRNAプロファイリングのための、拡張性と適応性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： バイオマーカー探索における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用上の価値： 高感度かつ最小限のRNA投入量でmiRNA定量を標準化します。
- 戦略的価値： 強固で定量的なバイオマーカー評価を可能にすることで、go/no-go判断および資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整済み優先順位付けと、バイオマーカー候補の推進を支援します。
実施上の考慮事項
- RNAの取り扱い、qPCRのセットアップ、および専用ソフトウェアを用いたデータ解析の専門知識が必要です。
- ハイスループットqPCR装置および検証済みプライマーパネルへのアクセスが必要です。
- データの正規化およびリファレンス遺伝子の選択において、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 様々なサンプルタイプに適応可能ですが、低発現または分解したRNAについては最適化が必要な場合があります。
- 正確な解釈と可視化には、データ解析の複雑さとソフトウェアの習熟度が極めて重要です。
