の仕分け

本手順の全体的な目的は、大型粒子用COPAフローサイトメーターを用いて、糸状ストレプトミセスによって形成された菌糸ペレットをサイズに基づいて分級することである。これはまず、目的の細菌株を育成し、続いてサンプリングを行うことで達成される。第二のステップでは、サンプル株をCOPAで測定する。

その後、データはイン・シリコで解析され、菌糸ペレットはユーザー定義のパラメータに従って分類されます。最終的に、これらの解析を用いてペレットサイズの不均一性をさらに特性評価することが可能です。本手法はストレプトマイセス属に使用できますが、糸状菌などの他の生物にも適用可能です。本手順の実演は、当研究室の博士課程学生であるMaRous Petrusが行います。

まず、各細菌サンプルのために、金属製コイルバネを備えた滅菌済みの250 mL三角フラスコに、100 mLの酵母エキス・マルトエキス培地と0.2 mLの2.5 M塩化マグネシウムを加えて培養を行います。次に、各フラスコに1 × 10⁸個のStreptomycesの胞子を接種し、胞子濃度を1 × 10⁶個/mLとして、30 °C、180 RPMの振盪条件下で細菌を培養します。2日後、フラスコを緩やかに振盪して細胞を均一に分散させながら、滅菌済みの5 mLピペットを用いて各培養液から5 mLのサンプルを回収します。

その後、各サンプルを個別の15 milliliterコニカルチューブに分注します。Copus解析でサンプルを評価するために、Copusプラスポンプコンピューターと488 nanometerアルゴンレーザーの電源が入っていることを確認し、Bio Sourceソフトウェアを開きます。シース液ボトルが満たされており、廃液ボトルが空であることを確認してから、「Start and Run」をクリックします。

488ナノメートルのアルゴンレーザーをスタンバイからオンに切り替えます。約60秒後にレーザーの準備が完了します。「完了」をクリックし、圧力計を確認してください。「圧力」の隣にあるチェックボックスをオンにします。

次に、システムによるフローセルのプライミング完了後、遅延設定が11、幅が7であることを確認します。しきい値を、シグナルについては50に、飛行時間（time of flight）の最小値については40に設定します。その後、サンプルカップ内の残った水を拭き取ってください。

約50 millilitersのPBSを加え、次にstrep demyサンプルのうちの1つを0.1 milliliter、カップに加えます。カップが適切に閉まっていることを確認し、acquireをクリックしてデータ収集を開始します。少なくとも2,500 eventsが収集された時点で、1秒あたり30から50 eventsになるよう流速を調整してください。

「Click」、「stop」を選択し、その後「store」をクリックして、各サンプルの細菌ペレットを分取するための統計解析用データを保存します。まず分取制限を設定し、飛行時間（time of flight）の最小値と最大値の詳細を入力します。あるいは、「regions」を選択し、「define gate region」でゲート領域を定義して、目的のサイズおよび特性を持つペレットを選択するための領域を作成します。

ソートパラメータに適合したペレットを回収するため、50 mLチューブを設置します。次に、ソートするペレット数を設定し、[sort manually]をクリックして選択したパラメータでソートを行います。ソート終了後、残りのサンプルを除去し、サンプルカップを水で2回洗浄してください。

装置をシャットダウンする前に、サンプルカップを70% ethanolで洗浄します。次に、システムを2回運転させます。1回は塩素水で、もう1回は純水で運転し、その後オーバーフロー容器を空にします。洗浄後、「stop」をクリックしてシステム内の圧力を解放します。

モーターが停止したら、プログラムを終了し、「パージなしでシャットダウン」をクリックします。次に、コンピューター、COPA、レーザー、およびポンプの電源を切ります。Streptomycesの菌糸ペレットおよび液体培養物は、幅広いサイズが存在します。

ペレットのサイズ分布を分析するため、液体培地で2日間培養したstreptomyces cila colorの培養液を、1 mmノズルを装着したCopus Plus Profilerを用いて大粒子フローサイトメトリーに供しました。ここに、典型的なCopusの出力散布図を示します。x軸は飛行時間（time of flight）を表しています。

ペレットのサイズが大きければ大きいほど、レーザービームを通過する時間は長くなります。Y軸は消光度（extinction）を示しており、これは物体の光学的密度を表します。各点は、レーザービームを通過する個々のペレットに対応しています。これらのデータポイントをヒストグラムにプロットしたところ、この代表サンプルにおけるサイズは正規分布していないことが示されました。

分布は対数右裾に偏っているように見えました。データセットを変換しても正規分布にはならなかったため、粒径分布が2つの正規分布の混合であると想定して説明できるかを確認するため、データを数学的にモデリングしました。モデリングの結果、実際に、全ペレットの92%を占める平均サイズ248 micrometersの小ペレット集団と、全ペレットの8%を占める平均サイズ319 micrometersの大ペレット集団が存在することが示されました。

ここでは、大および小のペレット集団からソートされたマイクロコロニーの代表的な解析結果を示します。2つの集団の平均ペレットサイズをソートの境界として定義することで、2つのサイズ分布の重複部分からのペレットのソートを制限しました。248 µm未満のペレットは小ペレット集団に由来すると見なし、319 µmより大きいペレットは大ペレット集団に由来すると見なしました。ソートされたペレットの顕微鏡解析により、この手順に従って、それらが明確に異なるサイズであることが確認されました。

この不均一性の根底にあるメカニズムを解明するために、次世代シーケンシングやプロテオミクスなどの他の手法を用いることができます。