の仕分けストレプトミセス細胞ペレット
February 13th, 2014
液体培養物を成長させたストレプトマイセスの小型不均質である菌糸体ペレットを特徴とする。ここでは、ハイスループット様式で、このようなペレットを分析し、分類する方法を記載する。これらのペレットは、成長の不均一性を理解し、制御するためのリードを提供し、更なる分析のために使用することができる。
この手順の全体的な目標は、大粒子COPAフローサイトメーターを使用して、糸状ストレプトマイセスによって形成された菌糸体ペレットをサイズに応じて選別することです。これは、まず、目的の細菌株の増殖とその後のサンプリングによって達成されます。2番目のステップでは、サンプル株がcoppaによって測定されます。
その後、データをin silicoで分析し、菌糸体ペレットをユーザー定義のパラメータに従って選別します。最終的には、これらの分析を使用して、ペレットサイズの不均一性をさらに特徴付けることができます。この方法は連鎖球菌にも使用できますが、糸状菌などの他の生物にも適用でき、この手順を実証するのは、私たちの研究室の博士課程の学生であるMaRous Petrusです。
まず、100ミリリットルの酵母抽出物、麦芽抽出培地、および0.2ミリリットルの2.5モル塩化マグネシウムを、各細菌サンプル用の金属コイルスプリングを備えた1つの滅菌250ミリリットル三角フラスコに追加して培養物を成長させます。次に、各フラスコにストレプトマイセスの8つの胞子に1×10を接種して、1ミリリットルあたり10〜6個の胞子の1倍の胞子濃度を取得し、180RPMで振とうしながら摂氏30度で細菌を増殖させます。2日後、滅菌済みの5ミリリットルピペットを使用して、フラスコを静かに振って細胞を均一に分散させながら、各培養物から5ミリリットルのサンプルを採取します。
次に、各サンプルを個々の15ミリリットルの円錐管に分注します。copus分析でサンプルを評価するには、copus plusポンプコンピューターと488ナノメートルアルゴンレーザーがオンになっていることを確認してから、バイオソースソフトウェアを開きます。シース液ボトルがいっぱいで、廃液ボトルが空であることを確認し、[開始]をクリックして実行します。
約60秒後に488ナノメートルのアルゴンレーザーをスタンバイからオンに切り替えるには、レーザーの準備が整います。[完了]をクリックしてから、圧力計を確認します。圧力の横にあるチェックボックスをクリックします。
さて、システムがフローセルをプライミングした後、遅延設定が11で、幅が7であることを確認します。しきい値を信号の 50 に設定し、飛行時間の最小値を 40 に設定します。次に、サンプルカップから残った水を取り除きます。
約50ミリリットルのPBSを追加し、次に0.1ミリリットルの連鎖球菌サンプルの1つをカップに加えます。カップがきちんと閉じていることを確認してから、[取得]をクリックしてデータの収集を開始します。少なくとも 2, 500 のイベントが収集された場合に、毎秒 30 から 50 のイベントを取得するようにフロー速度を管理します。
クリックし、停止し、保存してデータを保存し、その後の統計分析で各サンプルの細菌ペレットを選別します。最初にソート制限を設定し、最小飛行時間と最大飛行時間の値に関する詳細を入力します。または、領域を選択してからゲート領域を定義し、目的の寸法と特性を持つペレットを選択するための領域を作成します。
50ミリリットルのチューブを配置して、選別パラメータを満たすペレットを収集します。次に、ソートするペレットの数を設定し、[手動でソート]をクリックして、選択したパラメータをソートします。選別後、残ったサンプルを取り出し、サンプルカップを水で2回すすぎます。
copusをシャットダウンする前に、サンプルカップを70%エタノールで清掃します。次に、システムを2回実行します。塩素水で1回、普通の水で1回、オーバーフロー容器を空にします 清掃後、停止をクリックしてシステムから圧力を解放します。
モーターが停止したら、プログラムを閉じて、パージせずに[シャットダウン]をクリックします。次に、コンピューター、コパ、レーザー、およびポンプストレプトマイセスフォームの電源を切ります。菌糸体ペレットと液体培養物で、さまざまなサイズがあります。
ペレットサイズ分布を解析するために、2日経過した液体成長streptomyces cilaカラー培養物を、1mmノズルを装備したcopus plusプロファイラーを用いて大粒子フローサイトメトリーにかけました。ここでは、一般的なcopus出力散布図を示します。x 軸は飛行時間を表します。
アペラートが大きいほど、レーザービームを通過させるのにかかる時間が長くなります。Y軸は消滅を示し、これは物体の光学密度を表し、各点はレーザービームを通過する単一のペレットに対応します。データポイントをヒストグラムにプロットすると、この代表的なサンプルのサイズが正規分布していないことが示されました。
分布が右の対数に偏っているように見えました。データセットを変換しても、2つの正規分布の混合を仮定してサイズ分布を説明できるかどうかを評価するための正規分布には至らず、データは数学的にモデル化されました。モデリングは確かに、平均サイズが248マイクロメートルの全ペレットの92%からなる小さなペレットの集団と、平均サイズが319マイクロメートルの全ペレットの8%を占める大きなペレットの集団を示しました。
ここでは、大小のペレット集団から選別されたマイクロコロニーの代表的な分析を示します。2つの集団の平均ペレットサイズは、2つのサイズ分布の重なり合う部分からのペレットの選別を制限するために、選別のための境界を定義するために使用されました。248マイクロメートル未満のペレットは小さなペレット集団からのものであると見なされ、319マイクロメートルを超えるペレットは大きなペレット集団からのものであると見なされました。選別されたペレットの顕微鏡分析により、この手順に従ってそれらの明確なサイズが確認されました。
次世代シーケンシングやプロテオミクスなどの他の方法を実行して、この不均一性の根底にあるメカニズムを解明することができます。
概要
この研究では、液体培養されたStreptomyces培養物から菌糸体ペレットをサイズに基づいて分類する手法を、大粒子COPAフローサイトメーターを用いて提示します。この手法により、ペレットサイズの不均一性の高スループット分析が可能となり、成長制御に関する洞察を得ることができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 微生物学
- 細胞生物学
- バイオテクノロジー
背景
- Streptomycesは複雑な生活環で知られる糸状菌です。
- 成長中に形成される菌糸体ペレットは、サイズの不均一性を示します。
- この不均一性を理解することは、バイオテクノロジーの応用にとって重要です。
- フローサイトメトリーは、粒子サイズを高スループットで分析する方法を提供します。
研究目的
- サイズに基づいて菌糸体ペレットを分類する手法を開発すること。
- Streptomycesペレットのサイズ分布を分析すること。
- 成長の不均一性に関するさらなる研究のための枠組みを提供すること。
使用された手法
- 制御環境下でのStreptomyces培養物成長。
- フローサイトメトリー分析のための培養物のサンプリングと準備。
- サイズに基づいてペレットを測定および分類するためのCOPAフローサイトメーターの使用。
- サイズ分布の統計分析とペレット集団のモデリング。
主な結果
- サイズに基づいて2つの異なるペレット集団の特定。
- 小さなペレットの平均サイズは248マイクロメートル、大きなペレットの平均サイズは319マイクロメートルでした。
- サイズ分布は正規分布ではなく、顕著な不均一性を示しています。
- 顕微鏡分析により、分類されたペレットの異なるサイズが確認されました。
結論
- 開発された手法は、サイズに基づいて菌糸体ペレットを効果的に分類します。
- さらなる分析により、サイズの不均一性の背後にあるメカニズムを解明できます。
- この手法は、他の糸状生物にも適用可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Heterogeneity in mycelial pellet size directly impacts productivity in streptomycetes-based antibiotic and enzyme production, creating a bottleneck in cell factory optimization. Sorting pellets by size enables mechanistic de-risking of growth variability and supports predictive confidence in strain performance. This capability informs early discovery decisions by linking phenotypic output to bioprocess scalability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of growth heterogeneity hypotheses by isolating defined pellet subpopulations.
- Operational Value: Provides reproducible fractionation of mycelial pellets for downstream omics or phenotypic screening.
- Strategic Value: Supports target validation by linking pellet size to productivity traits in streptomycetes cell factories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-sorted pellet fractions for standardized assay inputs in enzyme or metabolite screening.
- Operational Value: Delivers quantitative time-of-flight and extinction measurements for pellet classification.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization by reducing biological noise from pellet size variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables continuity from discovery to preclinical scale by providing sorted pellets for RNA, protein, or omics analysis.
- Operational Value: Supports scalable sample preparation for mechanistic studies underlying pellet heterogeneity.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement by identifying size-correlated productivity markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic screening of pellet subpopulations prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of growth mechanisms through size-based pellet fractionation.
- Screening: Delivers assay-ready, size-homogeneous pellet samples for compound or condition testing.
- Analytics: Provides time-of-flight and extinction readouts for quantitative pellet classification and sorting.
- Translational Research: Connects sorted pellets to downstream molecular analysis for biomarker or mechanism discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pellet analysis across streptomycetes strain development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in growth studies by enabling isolation of defined pellet populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in pellet analysis across batches and strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking pellet size to productivity outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of streptomycetes strains based on size-sorted productivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and streptomycetes culture handling.
- Dependent on large particle COPAS instrumentation with appropriate nozzle and laser configuration.
- Necessitates standardization of sample preparation and sheath fluid protocols across users.
- Involves adaptation of sorting gates for different pellet size ranges in various filamentous systems.
- Limited by the need for optimization of flow rates and threshold settings for accurate pellet detection.
