Name: ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 30 s
Description: 学ぶ ヒト一次サンプルおよびインビトロ培養におけるメガカリオサイト分化段階の免疫フェノタイピング戦略。フローサイトメトリーとFACSを用いて、増加する倍性レベルを含むMK成熟を詳細に分析し、造血研究と臨床応用の基盤を提供します。

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マルコス・ペレス・バステルレチェア、ロレナ・ロドリゲス・ロレンツォ、ベゴーニャ・ガルシア・メンデス(HUCA)、パロマ・セレッソ、アルムデナ・パエロ、マリア・デ・ラ・ポベダ=コロモ(HCSC)に技術サポートを感謝します。この研究は、A.B.、RYCフェローシップ(RYC-2013-12587)への医療助成金(ロシュSP200221001)によって部分的にサポートされました。デ・エコノミア・イ・コンペティティビダード、スペイン)とI +D 2017助成金(SAF2017-85489-P;シエンシア大臣、イノバシオン・イ・ウニバーシダーデス、スペイン、フォンドス・フェデエル)からセベロ・オチョア・グラント(PA-20-PF-BP19-014)までコンセヘリア・デ・シエンシア,イノバシオン・イ・ウニヴェルシダーデス・デル・プリンシパド・デ・アストゥリアス州)からP.M.-Bへ。そして、A.A.-Hへの壁内ポスドク助成金2018(フンダシオン・パラ・ラ・インベスティガシオン・イ・ラ・イノバシオン・ビバイサニタリア・デ・アストゥリアス - FINBA、オビエド、スペイン)。私たちは、彼の知識(と時間)、特にマルチカラータグ付き抗体パネルミックスと単色ビーズ制御製剤に関する彼の賢明なアドバイスを共有してくれたライニエ・ファン・デル・リンデンに感謝します。

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<li>Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prospective+Isolation+Of+Viable%2C+High+Ploidy+Megakaryocytes+From+Adult+Murine+Bone+Marrow+By+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting.</a> Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).</li>
<li>Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+Of+Human+Megakaryocytes+By+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting.</a> Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).</li>
<li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+The+Quest+For+In+Vitro+Platelet+Production+By+Re-Tailoring+The+Concepts+Of+Megakaryocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation.</a> Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).</li>
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視聴覚材料の生産は、BDバイオサイエンスによってサポートされました。

フローサイトメトリーによる巨核生物の研究に焦点を当てた研究のほとんどは、系統特異的な表面マーカー(すなわち、CD42A/CD42B、CD41/CD61)のみを使用したMKサブセットの同定に限定され、以前のMK分化段階は十分に検討されていません。本稿ではヒト巨核代の包括的なフローサイトメトリー特性解析に取り組む免疫フェノタイピング戦略を示す。全体として、MK特異的および非特異的な表面マーカー(表1および2)を同じフローサイトメトリー抗体パネルに組み合わせることの有用性を、より詳細な方法で巨大核化の研究に向けて強調したいと思います。私たちの新しいアプローチは、造疫性疾患の診断および/または予後を支援するための強力なツールとして役立つ可能性があります。提示されたパネルと組み合わせは決定的ではないと考えています。我々は、人間の一次源(主にBMサンプル)における表面マーカーの非常に動的な挙動を観察した。より多くの研究が必要であり、うまくいけば、科学界は、単一の病理に焦点を当てた研究からの観察と、巨核球形成が診断または予後にどのように役立つかに関するフィードバックに関して、このアプローチを適用し始めるでしょう。導入セクションで述べ...

巨核球(MC)は、主にホルモントロンボポエチン(TPO)によって調整される巨核球症と呼ばれる複雑なプロセスに続いて、造血幹細胞(HSC)から発症する。巨核代の古典的な見解は、HSCからの細胞の旅を、コミットされた前駆細胞および前駆細胞の階層的な段階の連続を通して記述し、最終的には成熟したMKにつながる。成熟の間、MKはエンドミドーシスの複数のラウンドを経験し、血小板産生のための十分な膜表面を提供する複雑な細胞内境界膜系(DMS)を開発し、成熟した血小板1、2、3によって受け継がれる異なる顆粒に含まれる多数の因子を効率的に生成し、パックする。その結果、成熟したMKは、高倍数核(>64Nにも達する)を特徴とする大細胞(40〜60μm)です。最近の研究では、HSCが特定の生理病理学的状態4、5、6、7、8、9、10、11に応答して従来の系統コミットメントチェックポイントをバイパスしてMKに分化する代替ルートを示唆している。これらの知見は、成熟したMKに対する造血性分化が生物学的ニーズに対応する連続的かつ適応的なプロセスであることを強調している。
細胞生物学に関する知識の増加と巨核代種症12の分子的側面に関する知識が高まる中、フローサイトメトリーによるプロセスの研究に特化した研究のほとんどは、系統特異的な表面マーカー(CD42A/B、CD41/CD61)を用いた成熟したMCの同定に限定されているが、MK分化段階は未踏のままである。我々は以前に、ヒト15に適応し、適用してきたマウス骨髄および骨髄由来MK培養13、14において巨核代を上演する戦略を文書化した。本稿では、ヒトの主要なソース(骨髄-BM-および末梢血-PB-)またはMK特異的および非特異的表面マーカー(CD61、CD42B、CD49B、CD31、CD71)を組み込んだパネルを用いたインビトロ培養物において、HSCから成熟したMCまで、巨核化の特徴を可能にする免疫フェノタイピング戦略を示す。MKは、大きなサイズと脆弱性にもかかわらず、上記の細胞表面マーカーを使用して免疫整形され、細胞の破裂や損傷を最小限に抑えるために、圧力とノズル径の特定の条件下で蛍光活性化細胞選別によって濃縮することができます。この技術は、人間の健康と病気における巨核代と血小板産生の複雑さをよりよく理解することを目的として、マルチオミクスのアプローチを促進する。注目に値する、それは需要の増大の臨床文脈で診断と予後を助けるために有用なツールとして提起する。
この原稿では、MK特異的および非特異的な表面マーカーを主要なソースまたは生成されたインビトロから統合したパネルを用いて、ヒト巨核代を上演する戦略を文書化する。さらに、蛍光活性化細胞選別機、好ましい分数および成熟したMKを用いて、並べ替えプロトコルを提供します(図1)。この手順は、サイズが大きく、また、MK の脆弱性が大きいため、技術的に難しいため、一般的ではありません。しかし、それは以前マウスとヒト骨髄サンプルの両方で採用されており、技術の進歩により、毎回16、17、18より良い結果が得られます。MCまたはMK前駆体を研究できるヒトの主要な情報源には、骨髄、臍帯血および末梢血などが含まれる。各サンプルの分析のために関連する細胞分数を分離するための適切なサンプル処理が重要です。標準的な手順を組み込み、巨大核代の研究を目指す際に考慮すべきいくつかの考慮事項があります。

<table><tbody><tr><td>MKソーティングに必要な</td><td>130ミクロン ノズル</td><td>BD</td><td>643943</td></tr><tr><td>5810R 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>細胞の分離と洗浄</td></tr><tr><td>A-4-62 スイングバケットローター</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>細胞の分離と洗浄</td></tr><tr><td>エアロスプレー プロ 血液学 スライドステイナー/細胞遠心分離</td>機 <td>ELITech グループ</td><td></td><td>スライドをMat-Gr&で染色する自動細胞診装置うーん;nwald Giemsa</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター Galaxy 170 S</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Cell Incubation</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>サイトスピンの調製には</td></tr><tr><td>FACSAria IIu ソーター</td><td>BD</td><td></td><td>レーザー 488 nm および 633 nm</td></tr><tr><td>FACSCanto II フローサイトメーター</td><td>BD</td><td></td><td>レーザー 488 nm 、 633 nm 、 405 nm</td></tr><tr><td>オリンパス顕微鏡 BX 41</td><td>オリンパスの</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>オリンパスの顕微鏡 BX 61</td><td>オリンパスの</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>ゾーイ 蛍光細胞イメージャー</td><td>BioRad</td><td></td>の<td>顕微鏡写真</td></tr><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td></td>を得るため</tr> 脂質 <tr><td>コレステロール 成人のウシ</td>血清<td>から豊富な Sigma-Aldrich</td><td>L4646</td><td>または類似の</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td>幹<td>細胞Technologies</td><td>#07801</td><td>または類似の</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333または</td><td>類似の</td></tr><tr><td>組換えヒトエリスロポエチン(EPO)</td><td>&nbsp;R&D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>または類似</td></tr>の<tr><td>組換えヒト幹細胞因子 (SCF)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&trade;</td><td>PHC2115</td><td>または類似</td></tr>の<tr><td>組換えヒトトロンボポエチン(TPO)</td><td>Thermo Fisher Scientific、Gibco&trade;</td><td>PHC9514</td><td>またはTPO受容体アゴニスト</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー分析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルク</td><td>A7906-100G</td><td>または類似の</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD</td><td>552843</td><td>ヒト細胞の抗体は、一般的にマウス由来のものです。</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td>または類似の</td></tr><tr><td>BD FACS Accudrop Beads</td><td>BD</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>CD31 AF-647</td><td>BD</td><td>561654</td><td>マウス抗ヒト</td></tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>Immunostep</td><td>31F-100T</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD</td><td>555821</td><td>マウス抗ヒト</td></tr><tr><td>CD41 PE</td><td>BD</td><td>555467</td><td>マウス抗ヒト</td></tr><tr><td>CD41 PerCP-Cy5.5</td><td>BD</td><td>333148</td><td>マウス抗ヒト</td></tr><tr><td>CD42A APC</td><td>Immunostep</td><td>42AA-100T</td><td>我々は非特異的な結合を観察しました...評価する必要がある</td></tr><tr><td>CD42A PE</td><td>BD</td><td></td> 558819 <td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>CD42B PerCP</td><td>Biolegend</td><td>303910</td><td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>CD49B PE</td><td>BD</td><td></td> 555669 <td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>CD61 FITC</td><td>BD</td><td>555753</td><td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>CD71 APC-Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>334109</td><td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ヒト BD Fc ブロック</td><td>BD</td><td>564219</td><td>Fc ブロッキング - コントロール</td></tr><tr><td>キット PE-Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>313212</td><td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>リネージュ カクテル 2 FITC</td><td>BD</td><td>643397</td><td>マウス 抗ヒト</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>メルク</td><td>R6513</td><td>または類似</td></tr><tr><td>トリトン X-500</td><td>メルク</td><td>93443-500ML</td><td>または類似のもの</td></tr><tr>選別<td></td><td></td><td></td><td>用セルストレーナー</td></tr><tr><td>CellTrics Filters 100 micrometers</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2328</td><td>セルストレーナー</td></tr><tr><td>注:一般的な試薬/化学物質(PBS、EDTAなど)や使い捨て品(チューブなど)、または以前に公開された標準プロトコルで指定されている試薬は指定していません。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトmkの免疫フェノタイピングと細胞選別

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

巨核球(MK)分化は、非常に多倍(>64Nに達する)および非常に大きな細胞(40-60 μm)をもたらす多くのエンドミトティックサイクルを包含する。細胞生物学と分子レベルでの巨核代の急速な知識とは対照的に、フローサイトメトリーによる巨核生物の特徴付けは、系統特異的な表面マーカーを用いた成熟したMCの同定に限定される一方、以前のMK分化段階は未踏のままである。ここでは、MK特異的および非特異的な表面マーカーを含むパネルを用いたヒトの一次源または インビトロ 培養において、連続したMK分化段階の同定を可能にする免疫フェノタイピング戦略を提示する。その大きさと脆弱性にもかかわらず、MKは上記のパネルを使用して免疫フェノタイプすることができ、圧力およびノズル直径の特定の条件下で蛍光活性化細胞選別によって濃縮される。このアプローチは、ヒトにおける巨核代と血小板産生の複雑性をよりよく理解することを目的として、マルチオミックス研究を促進する。巨核代の特徴付けが良いと、系統関連の病理や悪性腫瘍の診断や予後に根本的なものとなる可能性があります。

骨髄と策略 図4では、患者からのBMサンプル(吸引)における巨核代の代表的な免疫型解析を示す。CD71とCD31に対して細胞分数をプロットする際には、CD31- CD71- (赤)、CD31 - CD71+ (青)、CD31 + CD71- (オレンジ)、CD31+ CD71+ CD71+ CD71 + (濃い緑色) および CD31++ CD71ミッドクリーム (CD31 +CD71ミッドクリーム) の 6 つの主要な集団をゲートしました。これらの集団は、常に同じ位置に存在するとは限らない(一定のサイトメーター設定を考慮して)、それが見ることができるように、それは考慮されるべきです。これは、病理学的状態と骨髄の状態に固有の可能性があります。パネ...

ここでは、巨核球分化の特徴付けに関する免疫型付け戦略を紹介し、その戦略が蛍光活性化細胞選別機を用いて異なる段階で巨核球を選別する方法を示す。この方法論はヒトの一次組織に適用できるが、 インビトロの培養で生成された巨核球にも適用できる。

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

ISPAアストゥリアス公国健康研究所の血小板研究所のアンドレア・アセビス・ウエルタ博士研究員です。これはオビエド、スペインに位置しています。こんにちは.こんにちは.私はローラ・グティです

immunophenotyping-cell-sorting-human-mks-from-human-primary-sources

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。...

マウスメガ核球前駆細胞の分離

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。...

ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

学ぶ ヒト一次サンプルおよびインビトロ培養におけるメガカリオサイト分化段階の免疫フェノタイピング戦略。フローサイトメトリーとFACSを用いて、増加する倍性レベルを含むMK成熟を詳細に分析し、造血研究と臨床応用の基盤を提供します。

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化インビトロからのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

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ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

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