急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態
2014年11月23日
私たちは、超音波と内視鏡検査という2つの補完的なイメージングモダリティを使用して、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を説明するためのマトリゲルプラグアッセイについて説明します。細胞外マトリックス(ECM)模倣ゲルであるマトリゲルは、コンディショニング培地(C.M.)に分泌される血管新生因子を宿主(マウス)に導入するために使用されます。
次の実験の全体的な目標は、超音波と内視鏡を使用して、がん細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を示すことです。これは、腫瘍細胞が存在しない状態でマウスに腫瘍様環境を生成するためのプラグを最初に埋め込むことによって達成されます。次に、血管密度とプラグ内の機能血管の割合が評価されます。
最後のステップでは、血管の形態が視覚化されます。最終的に、細胞によって分泌されるプロおよび抗血管新生因子とそれらの血管新生への影響との間のバランスは、2つの相補的なイメージングモダリティによって、内部、生命、およびさまざまな時点で評価できます。従来のマトリゲルプラグアッセイのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、補完的な生体内イメージングモダリティを利用しながら、細胞によって分泌された因子のプールを分析できることです。
この手順を実証するのは、彼女が私の研究室のFアンドラ博士課程の学生を実行し、細胞外マトリックスまたはECM模倣ゲルプラグ血管新生を評価するために超音波を使用するには、80マイクロリットルの新しく準備された調整された培地を含む1.5ミリリットルのeinorチューブを1つ置くことから始まります。手順の最も難しい部分は、氷のように冷たいチップを使用して、気泡なしでゲルを注入することです。穏やかな混合とゆっくりとした注入により、最適なゲル投与が保証されます。
次に、氷冷した1000マイクロリットルのチップを使用して、摂氏4度の氷冷した600マイクロリットルを一晩混合します。解凍したECM模倣ゲルを、気泡を形成しないように注意しながらメディアに取り込む。つま先つまみで鎮静を確認した後、各マウスの腹部を剃り、27ゲージの針を装備した氷冷した1ミリリットルの注射器を使用してゆっくりと皮下下投与します。
動物1匹につき1本のEEND DPHチューブの内容物を注入します。全ボリュームが投与されたら、固化が発生するまで針を数分間所定の位置に保持します。3週間後、マウスの腹部を再度剃り、脱毛クリームで余分な毛を取り除き、マイクロマニピュレーターのステージ上でマウスを仰臥位に固定します。
次に、30ゲージの針を装備した1ミリリットルの注射器に生理食塩水を入れます。次に、針を尾静脈の内側に置きます。針をしっかりと固定し、シリンジを緩めます。
次に、トランスデューサーを目的のスキャン領域の中央に配置し、[3D]をクリックして3Dモーターステージを初期化します。[3D] をクリックします。再度、スキャン距離とステップサイズを入力してスキャンを押します。
表示された3D画像データでプラグ全体がスキャンされたことを確認します。そうでない場合は、プラグ全体が見えるようにトランスデューサーを調整し、示したように領域を再度スキャンします。次に、コントラストを選択し、時間ゲイン補正またはtgcコントロールを調整して画像を暗くし、バイアルミキサーを使用してマイクロバブルを45秒間アクティブにします。
次に、50マイクロリットルのマイクロバブルと50マイクロリットルの生理食塩水を1ミリリットルの注射器で混合します。緩めたシリンジが入った生理食塩水を入れた注射器を活性化したマイクロバブルが入った注射器に交換し、希釈したマイクロバブルを各マウスの尾静脈に注入します。気泡が定常状態に達するまで数秒待ってから、[3D]をクリックして[スキャン]を選択し、[3Dを取得]を選択します。
コントラストを強化した画像。[ストアを表示] をクリックして画像データを保存し、[3D] と [3D を破棄] を選択します。マイクロバブルを破壊するには、もう一度 3D をクリックし、スキャンを選択して破壊後のシナループを取得します。
次に、もう一度 [ストアを表示] をクリックします。次に、参照設定で[参照の作成]をクリックし、[試験管理]を選択します。破壊前のシナループを開きます。
次に、[プロセスセナ]をクリックして、緑色のコントラストオーバーレイを生成します。次に、超音波画像診断ソフトウェアで3Dへのロードを選択します。次に、[モード設定]をクリックし、[ボリューム]をクリックして[並列]を選択します。
次に、一連の輪郭をセグメント化してターゲット組織の3Dボリュームを作成し、[完了]をクリックしてセグメンテーションを完了します。ファイバー共焦点内視鏡を使用してECM模倣ゲルプラグ血管系の形態を評価するには、1ミリリットルあたり10ミリグラムの200マイクロリットルを注入し、Cで標識されたデキストランを各実験動物の尾静脈に適合させます。次に、プラグから約1センチメートルのところに小さな切開を加え、プラグを無傷に保ちながら、内視鏡プローブをプラグの上にそっと置きます。
プローブが所定の位置に配置されたら、フットペダルを使用してスタートレーザーを押します。蛍光が画面に表示されたら、フットペダルで選択を押して、映画の合間に最大32番目の長い映画を取得し、プローブの先端を水の入ったチューブで洗います。撮影が終了したら、綿棒で先端を清掃して、平均血管径を分析します。
次に、「detect micro vessels」をクリックして血管検出モジュールウィンドウを開き、「preferences」をクリックします。対象の統計で平均血管の直径を確認してください。表示モードのウィンドウと表示ヒストグラムバーはマークされます。
「検出」をクリックして、選択した測定値を表示します。血管に隣接する領域の蛍光シグナル強度を解析するには、create circle ROIを選択し、対象領域に円を作成します。最後に、ROI 内の [ヒストグラムの計算] を選択して、丸で囲まれた領域に関連する値を計算します。
ここでは、U 87 mg で調整された中負荷プラグ内の機能的な血管の広範な動員が、マイクロバブルコントラスト強化超音波イメージングによって明らかになります。逆に、休眠中の腫瘍発生細胞からの馴化培地を含むプラグ内では、血流はほとんど検出されません。これらの新たに形成された血管の形態は、これらの代表的な画像で示されているように、フィットcデキストラン投与後の血管の繊維共焦点内顕微鏡検査によってさらに強調され、U 87 mgの馴化培地を装填したプラグ内の血管がどのように示すかに注意してください典型的な漏れのある鈍い拡大した血管形態。
また、血管が肥大し、高度に絡み合っていることからも、非連続的で緩慢な流れが見られ、周囲に血液の漏出が見られるほか、血管の外側に高い蛍光シグナルが見られることからも明らかです。一度習得すると、この技術は血管新生の動力学を最適化するために、いくつかの時点で数時間で行うことができます。
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概要
本研究では、超音波とエンドミクロスコピーを用いて、がん細胞から分泌される因子の血管新生能を評価するためのマトリジェルプラグアッセイについて説明します。この手法により、マウス内に作製した腫瘍類似環境における血管密度と形態の評価が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 血管新生
背景
- 血管新生は、腫瘍の成長と転移において極めて重要です。
- 血管新生促進因子と抑制因子のバランスを理解することが不可欠です。
- 従来の解析手法では、分泌因子の効果的な分析が困難な場合があります。
- 相補的なイメージング技術を用いることで、血管新生の評価を向上させることができます。
研究目的
- がん細胞から分泌される因子の血管新生能を実証する。
- マウスモデルを用いてマトリゲルプラグアッセイを実施する。
- 血管密度および機能性を評価する。
使用した手法
- 腫瘍環境をシミュレートするためのマウスへのMatrigelプラグの植え込み。
- 血管密度および機能性血管の評価。
- イメージング手法を用いた血管形態の可視化。
- 血管新生因子の経時的な評価。
主な結果
- マウスにおける腫瘍様環境の構築に成功した。
- 血管密度の定量的な評価を達成した。
- 血管形態の可視化を実証した。
- 血管新生因子のバランスに関する知見を得た。
結論
- Matrigelプラグアッセイは、血管新生能を効果的に評価します。
- 相補的なイメージング手法により、詳細な知見が得られます。
- この手法は、がん生物学の理解を深めます。
よくある質問
産業上の重要性
この手法により、バイオ医薬品の研究開発において、腫瘍細胞から分泌される複雑な因子プールの血管新生能を、生理的に適切なin vivo環境で評価することが可能になります。定量的超音波イメージングと高解像度エンドマイクロスコピーを組み合わせることで、血管の機能性と形態に関するメカニズム的な知見が得られ、ターゲットの妥当性確認および血管新生調節療法のリスク低減を支援します。このアッセイは、血管新生促進因子と抑制因子のバランスを早期段階で評価することを可能にし、オンコロジー領域の創薬におけるポートフォリオ決定に寄与し、後期段階での生物学的リスクを軽減します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：がん細胞から分泌される因子プールの純血管新生出力を評価することにより、治療仮説を検証します。
- 運用上の価値：腫瘍模倣マトリックスにおける血管密度と灌流のリアルタイム測定を通じて、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 予測的価値：因子の分泌プロファイルと血管表現型を相関させることで、メカニズム的なリスク低減をサポートし、ターゲットの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備： 条件付き培地をインプットとして、血管新生または抗血管新生化合物のスクリーニングのための、標準化され再現性のある生物学的システムを構築します。
- 定量的な出力： 化合物スクリーニングキャンペーンに向けて、血管密度、機能的血管の割合、および平均血管径などの測定可能なエンドポイントを生成します。
- 拡張性と再利用性： 複数の時点での縦断的モニタリングをサポートし、キネティクス分析や、因子ライブラリまたは遺伝的摂動にわたるプラットフォームの再利用を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 急速に成長する神経膠芽腫の血管新生微小環境をモデル化し、前臨床有効性試験へのトランスレーショナルな橋渡しを提供します。
- バイオマーカーの整合性： 血管形態（例：漏出性血管、拡張血管）と機能的リードアウトとの相関を可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカーの探索を支援します。
- リスク調整後の進展： 血管新生反応を経時的に定量化することで、Go/No-go判断を容易にし、前臨床段階における進展の不確実性を軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、初期のターゲット検証からリード最適化、そして前臨床検証に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、生化学的および表現型スクリーニングを補完する機能的な読み出しを提供します。
- 探索生物学： 複雑な因子混合物の血管新生能を明らかにし、血管新生調節における経路レベルの影響を明確にすることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 標準化された定量的な血管リードアウト（血管密度、機能性）を提供し、ウェル間や時点間での試験条件の信頼性の高い比較を可能にします。
- アナリティクス： 超音波由来の血流指標とエンドミクロスコピーに基づく形態学的分析というマルチモーダルデータを提供し、比較分析および構造活性相関に役立てます。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitro での因子分泌を in vivo での血管転帰に結びつけ、疾患に関連する血管表現型を用いて、探索から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- 企業内での再利用： 腫瘍学プロジェクト全体で、因子プール、抗体、または低分子化合物の血管新生能または抗血管新生活性を評価するための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 分泌因子プロファイルを機能的な血管新生の結果に結びつけることで予測の信頼性を高め、血管新生調節におけるメカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値： 再現性のあるプラグ形成、標準化されたイメージングプロトコル、およびオペレーターや施設を問わず定量可能なエンドポイントを通じて、評価を標準化します。
- 戦略的価値： 血管新生を標的とする候補物質の早期リスク低減を可能にし、生物学的に不活性なアプローチへの投資を最小限に抑えることで、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 血管新生活性の直接的な根拠を提供し、血管新生促進メカニズムと抑制メカニズムの差別化を支援することで、リスク調整後の優先順位付けに寄与します。
実施上の検討事項
- 超音波造影剤の取り扱いやファイバー共焦点内視鏡の操作を含む、in vivo イメージング技術の専門知識が必要です。
- 3D電動ステージを備えた高周波超音波システムとマイクロバブル造影剤、および蛍光デキストラン標識が可能な内視鏡プラットフォームへのアクセスに依存します。
- 研究間の再現性を確保するため、プラグの作製、イメージングパラメータ、および画像解析ワークフローのチーム間標準化が必要です。
- 生理学的妥当性を維持するため、本モデルを異なる細胞株、腫瘍型、またはストローマ共培養に適用する際は、適応に関する検討が必要となります。
- 本アッセイはエンドポイント評価であるため、各タイムポイントで動物を犠牲にする必要があり、個体レベルでの縦断的なサンプリングが制限されます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Extracellular Matrix (ECM)–mimic Gel Plug Inoculation into Mice
2:43
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vascularization Using Ultrasound
5:31
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vasculature Morphology Using Fibered Confocal Endomicroscopy
7:23
Results: Representative ECM–mimic Gel Plug Imaging
8:40
Conclusion
