急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

私たちは、超音波と内視鏡検査という2つの補完的なイメージングモダリティを使用して、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を説明するためのマトリゲルプラグアッセイについて説明します。細胞外マトリックス(ECM)模倣ゲルであるマトリゲルは、コンディショニング培地(C.M.)に分泌される血管新生因子を宿主(マウス)に導入するために使用されます。

次の実験の全体的な目標は、超音波と内視鏡を使用して、がん細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を示すことです。これは、腫瘍細胞が存在しない状態でマウスに腫瘍様環境を生成するためのプラグを最初に埋め込むことによって達成されます。次に、血管密度とプラグ内の機能血管の割合が評価されます。

最後のステップでは、血管の形態が視覚化されます。最終的に、細胞によって分泌されるプロおよび抗血管新生因子とそれらの血管新生への影響との間のバランスは、2つの相補的なイメージングモダリティによって、内部、生命、およびさまざまな時点で評価できます。従来のマトリゲルプラグアッセイのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、補完的な生体内イメージングモダリティを利用しながら、細胞によって分泌された因子のプールを分析できることです。

この手順を実証するのは、彼女が私の研究室のFアンドラ博士課程の学生を実行し、細胞外マトリックスまたはECM模倣ゲルプラグ血管新生を評価するために超音波を使用するには、80マイクロリットルの新しく準備された調整された培地を含む1.5ミリリットルのeinorチューブを1つ置くことから始まります。手順の最も難しい部分は、氷のように冷たいチップを使用して、気泡なしでゲルを注入することです。穏やかな混合とゆっくりとした注入により、最適なゲル投与が保証されます。

次に、氷冷した1000マイクロリットルのチップを使用して、摂氏4度の氷冷した600マイクロリットルを一晩混合します。解凍したECM模倣ゲルを、気泡を形成しないように注意しながらメディアに取り込む。つま先つまみで鎮静を確認した後、各マウスの腹部を剃り、27ゲージの針を装備した氷冷した1ミリリットルの注射器を使用してゆっくりと皮下下投与します。

動物1匹につき1本のEEND DPHチューブの内容物を注入します。全ボリュームが投与されたら、固化が発生するまで針を数分間所定の位置に保持します。3週間後、マウスの腹部を再度剃り、脱毛クリームで余分な毛を取り除き、マイクロマニピュレーターのステージ上でマウスを仰臥位に固定します。

次に、30ゲージの針を装備した1ミリリットルの注射器に生理食塩水を入れます。次に、針を尾静脈の内側に置きます。針をしっかりと固定し、シリンジを緩めます。

次に、トランスデューサーを目的のスキャン領域の中央に配置し、[3D]をクリックして3Dモーターステージを初期化します。[3D] をクリックします。再度、スキャン距離とステップサイズを入力してスキャンを押します。

表示された3D画像データでプラグ全体がスキャンされたことを確認します。そうでない場合は、プラグ全体が見えるようにトランスデューサーを調整し、示したように領域を再度スキャンします。次に、コントラストを選択し、時間ゲイン補正またはtgcコントロールを調整して画像を暗くし、バイアルミキサーを使用してマイクロバブルを45秒間アクティブにします。

次に、50マイクロリットルのマイクロバブルと50マイクロリットルの生理食塩水を1ミリリットルの注射器で混合します。緩めたシリンジが入った生理食塩水を入れた注射器を活性化したマイクロバブルが入った注射器に交換し、希釈したマイクロバブルを各マウスの尾静脈に注入します。気泡が定常状態に達するまで数秒待ってから、[3D]をクリックして[スキャン]を選択し、[3Dを取得]を選択します。

コントラストを強化した画像。[ストアを表示] をクリックして画像データを保存し、[3D] と [3D を破棄] を選択します。マイクロバブルを破壊するには、もう一度 3D をクリックし、スキャンを選択して破壊後のシナループを取得します。

次に、もう一度 [ストアを表示] をクリックします。次に、参照設定で[参照の作成]をクリックし、[試験管理]を選択します。破壊前のシナループを開きます。

次に、[プロセスセナ]をクリックして、緑色のコントラストオーバーレイを生成します。次に、超音波画像診断ソフトウェアで3Dへのロードを選択します。次に、[モード設定]をクリックし、[ボリューム]をクリックして[並列]を選択します。

次に、一連の輪郭をセグメント化してターゲット組織の3Dボリュームを作成し、[完了]をクリックしてセグメンテーションを完了します。ファイバー共焦点内視鏡を使用してECM模倣ゲルプラグ血管系の形態を評価するには、1ミリリットルあたり10ミリグラムの200マイクロリットルを注入し、Cで標識されたデキストランを各実験動物の尾静脈に適合させます。次に、プラグから約1センチメートルのところに小さな切開を加え、プラグを無傷に保ちながら、内視鏡プローブをプラグの上にそっと置きます。

プローブが所定の位置に配置されたら、フットペダルを使用してスタートレーザーを押します。蛍光が画面に表示されたら、フットペダルで選択を押して、映画の合間に最大32番目の長い映画を取得し、プローブの先端を水の入ったチューブで洗います。撮影が終了したら、綿棒で先端を清掃して、平均血管径を分析します。

次に、「detect micro vessels」をクリックして血管検出モジュールウィンドウを開き、「preferences」をクリックします。対象の統計で平均血管の直径を確認してください。表示モードのウィンドウと表示ヒストグラムバーはマークされます。

「検出」をクリックして、選択した測定値を表示します。血管に隣接する領域の蛍光シグナル強度を解析するには、create circle ROIを選択し、対象領域に円を作成します。最後に、ROI 内の [ヒストグラムの計算] を選択して、丸で囲まれた領域に関連する値を計算します。

ここでは、U 87 mg で調整された中負荷プラグ内の機能的な血管の広範な動員が、マイクロバブルコントラスト強化超音波イメージングによって明らかになります。逆に、休眠中の腫瘍発生細胞からの馴化培地を含むプラグ内では、血流はほとんど検出されません。これらの新たに形成された血管の形態は、これらの代表的な画像で示されているように、フィットcデキストラン投与後の血管の繊維共焦点内顕微鏡検査によってさらに強調され、U 87 mgの馴化培地を装填したプラグ内の血管がどのように示すかに注意してください典型的な漏れのある鈍い拡大した血管形態。

また、血管が肥大し、高度に絡み合っていることからも、非連続的で緩慢な流れが見られ、周囲に血液の漏出が見られるほか、血管の外側に高い蛍光シグナルが見られることからも明らかです。一度習得すると、この技術は血管新生の動力学を最適化するために、いくつかの時点で数時間で行うことができます。