急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態
2014年11月23日
私たちは、超音波と内視鏡検査という2つの補完的なイメージングモダリティを使用して、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を説明するためのマトリゲルプラグアッセイについて説明します。細胞外マトリックス(ECM)模倣ゲルであるマトリゲルは、コンディショニング培地(C.M.)に分泌される血管新生因子を宿主(マウス)に導入するために使用されます。
次の実験の全体的な目標は、超音波と内視鏡を使用して、がん細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を示すことです。これは、腫瘍細胞が存在しない状態でマウスに腫瘍様環境を生成するためのプラグを最初に埋め込むことによって達成されます。次に、血管密度とプラグ内の機能血管の割合が評価されます。
最後のステップでは、血管の形態が視覚化されます。最終的に、細胞によって分泌されるプロおよび抗血管新生因子とそれらの血管新生への影響との間のバランスは、2つの相補的なイメージングモダリティによって、内部、生命、およびさまざまな時点で評価できます。従来のマトリゲルプラグアッセイのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、補完的な生体内イメージングモダリティを利用しながら、細胞によって分泌された因子のプールを分析できることです。
この手順を実証するのは、彼女が私の研究室のFアンドラ博士課程の学生を実行し、細胞外マトリックスまたはECM模倣ゲルプラグ血管新生を評価するために超音波を使用するには、80マイクロリットルの新しく準備された調整された培地を含む1.5ミリリットルのeinorチューブを1つ置くことから始まります。手順の最も難しい部分は、氷のように冷たいチップを使用して、気泡なしでゲルを注入することです。穏やかな混合とゆっくりとした注入により、最適なゲル投与が保証されます。
次に、氷冷した1000マイクロリットルのチップを使用して、摂氏4度の氷冷した600マイクロリットルを一晩混合します。解凍したECM模倣ゲルを、気泡を形成しないように注意しながらメディアに取り込む。つま先つまみで鎮静を確認した後、各マウスの腹部を剃り、27ゲージの針を装備した氷冷した1ミリリットルの注射器を使用してゆっくりと皮下下投与します。
動物1匹につき1本のEEND DPHチューブの内容物を注入します。全ボリュームが投与されたら、固化が発生するまで針を数分間所定の位置に保持します。3週間後、マウスの腹部を再度剃り、脱毛クリームで余分な毛を取り除き、マイクロマニピュレーターのステージ上でマウスを仰臥位に固定します。
次に、30ゲージの針を装備した1ミリリットルの注射器に生理食塩水を入れます。次に、針を尾静脈の内側に置きます。針をしっかりと固定し、シリンジを緩めます。
次に、トランスデューサーを目的のスキャン領域の中央に配置し、[3D]をクリックして3Dモーターステージを初期化します。[3D] をクリックします。再度、スキャン距離とステップサイズを入力してスキャンを押します。
表示された3D画像データでプラグ全体がスキャンされたことを確認します。そうでない場合は、プラグ全体が見えるようにトランスデューサーを調整し、示したように領域を再度スキャンします。次に、コントラストを選択し、時間ゲイン補正またはtgcコントロールを調整して画像を暗くし、バイアルミキサーを使用してマイクロバブルを45秒間アクティブにします。
次に、50マイクロリットルのマイクロバブルと50マイクロリットルの生理食塩水を1ミリリットルの注射器で混合します。緩めたシリンジが入った生理食塩水を入れた注射器を活性化したマイクロバブルが入った注射器に交換し、希釈したマイクロバブルを各マウスの尾静脈に注入します。気泡が定常状態に達するまで数秒待ってから、[3D]をクリックして[スキャン]を選択し、[3Dを取得]を選択します。
コントラストを強化した画像。[ストアを表示] をクリックして画像データを保存し、[3D] と [3D を破棄] を選択します。マイクロバブルを破壊するには、もう一度 3D をクリックし、スキャンを選択して破壊後のシナループを取得します。
次に、もう一度 [ストアを表示] をクリックします。次に、参照設定で[参照の作成]をクリックし、[試験管理]を選択します。破壊前のシナループを開きます。
次に、[プロセスセナ]をクリックして、緑色のコントラストオーバーレイを生成します。次に、超音波画像診断ソフトウェアで3Dへのロードを選択します。次に、[モード設定]をクリックし、[ボリューム]をクリックして[並列]を選択します。
次に、一連の輪郭をセグメント化してターゲット組織の3Dボリュームを作成し、[完了]をクリックしてセグメンテーションを完了します。ファイバー共焦点内視鏡を使用してECM模倣ゲルプラグ血管系の形態を評価するには、1ミリリットルあたり10ミリグラムの200マイクロリットルを注入し、Cで標識されたデキストランを各実験動物の尾静脈に適合させます。次に、プラグから約1センチメートルのところに小さな切開を加え、プラグを無傷に保ちながら、内視鏡プローブをプラグの上にそっと置きます。
プローブが所定の位置に配置されたら、フットペダルを使用してスタートレーザーを押します。蛍光が画面に表示されたら、フットペダルで選択を押して、映画の合間に最大32番目の長い映画を取得し、プローブの先端を水の入ったチューブで洗います。撮影が終了したら、綿棒で先端を清掃して、平均血管径を分析します。
次に、「detect micro vessels」をクリックして血管検出モジュールウィンドウを開き、「preferences」をクリックします。対象の統計で平均血管の直径を確認してください。表示モードのウィンドウと表示ヒストグラムバーはマークされます。
「検出」をクリックして、選択した測定値を表示します。血管に隣接する領域の蛍光シグナル強度を解析するには、create circle ROIを選択し、対象領域に円を作成します。最後に、ROI 内の [ヒストグラムの計算] を選択して、丸で囲まれた領域に関連する値を計算します。
ここでは、U 87 mg で調整された中負荷プラグ内の機能的な血管の広範な動員が、マイクロバブルコントラスト強化超音波イメージングによって明らかになります。逆に、休眠中の腫瘍発生細胞からの馴化培地を含むプラグ内では、血流はほとんど検出されません。これらの新たに形成された血管の形態は、これらの代表的な画像で示されているように、フィットcデキストラン投与後の血管の繊維共焦点内顕微鏡検査によってさらに強調され、U 87 mgの馴化培地を装填したプラグ内の血管がどのように示すかに注意してください典型的な漏れのある鈍い拡大した血管形態。
また、血管が肥大し、高度に絡み合っていることからも、非連続的で緩慢な流れが見られ、周囲に血液の漏出が見られるほか、血管の外側に高い蛍光シグナルが見られることからも明らかです。一度習得すると、この技術は血管新生の動力学を最適化するために、いくつかの時点で数時間で行うことができます。
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概要
本研究では、超音波およびエンドミクロスコピーを用いて、がん細胞から分泌される因子の血管新生能を評価するためのマトリゲルプラグアッセイについて記述します。この手法により、マウス内に作製した腫瘍様環境における血管密度および形態の評価が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 血管新生
背景
- 血管新生は、腫瘍の増殖と転移において極めて重要です。
- 血管新生促進因子と抑制因子のバランスを理解することが不可欠です。
- 従来の方法では、分泌因子の効果的な解析が困難な場合があります。
- 相補的なイメージング技術を用いることで、血管新生の評価を向上させることができます。
研究の目的
- がん細胞分泌因子の血管新生能を明らかにする。
- マウスモデルを用いてMatrigelプラグアッセイを実施する。
- 血管密度および機能を評価する。
使用方法
- 腫瘍環境を模倣するためのマウスへのマトリゲルプラグの移植。
- 血管密度および機能性血管の評価。
- イメージング法を用いた血管形態の可視化。
- 血管新生因子の経時的な評価。
主な結果
- マウスにおける腫瘍様環境の構築に成功。
- 血管密度の定量的な評価を実現。
- 血管形態の可視化を実証。
- 血管新生因子のバランスに関する知見を獲得。
結論
- Matrigelプラグアッセイは、血管新生能を効果的に評価します。
- 相補的なイメージング手法により、詳細な知見が得られます。
- この手法は、がん生物学への理解を深めます。
よくある質問
産業界における重要性
本手法により、バイオ医薬品の研究開発において、生理的に適切なin vivo環境で腫瘍細胞から分泌される複雑な因子プールの血管新生能を評価することが可能になります。定量的超音波イメージングと高解像度エンドミクロスコピーを組み合わせることで、血管の機能性と形態に関する機序的な知見が得られ、ターゲットの検証および血管新生調節治療薬のリスク低減を支援します。このアッセイは、血管新生促進因子と抑制因子のバランスの早期評価を可能にし、ポートフォリオの決定に情報を与え、がん治療薬開発における後期の生物学的リスクを低減させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：がん細胞から分泌される因子プールの正味の血管新生出力を評価することにより、治療仮説を検証する。
- 運用的価値：腫瘍模倣マトリックスにおける血管密度と灌流をリアルタイムで測定することで、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値：因子分泌プロファイルと血管表現型を相関させることでメカニズム的なリスク低減をサポートし、ターゲットの優先順位付けに寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：条件付き培地を入力として、血管新生または抗血管新生化合物をスクリーニングするための標準化され再現性のある生物学的システムを構築します。
- 定量的な出力：化合物スクリーニングにおいて、血管密度、機能的血管の割合、平均血管径などの測定可能なエンドポイントを算出します。
- 拡張性と再利用性：複数の時点での縦断的モニタリングをサポートし、キネティクス解析や、要因ライブラリまたは遺伝的摂動にわたるプラットフォームの再利用を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 急速に成長する神経膠芽腫（グリオブラストーマ）の血管新生微小環境をモデル化し、前臨床段階の有効性試験へのトランスレーショナルな架け橋を提供します。
- バイオマーカーの一致： 血管形態（例：漏出性血管、拡張血管）と機能的読み取り値との相関を可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカーの探索を支援します。
- リスク調整後の進展： 時間経過に伴う血管新生反応を定量化することで、Go/No-go判断を容易にし、前臨床段階における進展の不確実性を軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、初期のターゲット検証からリード最適化、そして前臨床検証に至るまでの創薬プロセスに組み込まれ、生化学的および表現型スクリーニングを補完する機能的なリードアウトを提供します。
- 基盤生物学的な発見： 複雑な因子の混合物の血管新生能を明らかにすることで、血管新生調節におけるパスウェイレベルの影響を明確にし、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 標準化された定量的な血管読み取り値（血管密度、機能性）を提供し、ウェル間やタイムポイント間での試験条件の信頼性の高い比較を可能にします。
- 分析： 超音波由来の灌流指標とエンドミクロスコピーに基づく形態計測分析というマルチモーダルデータを提供し、比較分析および構造活性相関の検討に役立てます。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの因子分泌をin vivoでの血管系の結果に結びつけ、疾患に関連した血管表現型を用いて、発見から前臨床検証までの連続性を支援します。
- 組織内での再利用： 腫瘍学プロジェクト全体で、因子プール、抗体、または低分子化合物の血管新生または抗血管新生活性を評価するための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 分泌因子のプロファイルと機能的な血管系のアウトカムを関連付けることで予測の信頼性を高め、血管新生調節におけるメカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 再現性のあるプラグ形成、標準化されたイメージングプロトコル、およびオペレーターや施設間で定量可能なエンドポイントを通じて、評価を標準化します。
- 戦略的価値： 血管新生を標的とする候補物質の早期リスク低減を可能にし、生物学的に不活性なアプローチへの投資を最小限に抑えることで、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 血管新生活性の直接的な証拠を提供することで、リスク調整後の優先順位付けに情報を与え、促進的および抑制的な血管新生メカニズムの区別をサポートします。
実施上の検討事項
- 超音波造影剤の取り扱いやファイバー共焦点内視鏡の操作を含む、in vivo イメージング技術の専門知識が必要です。
- 3D電動ステージを備えた高周波超音波システムとマイクロバブル造影剤、および蛍光デキストラン標識が可能な内視鏡プラットフォームへのアクセスに依存します。
- 研究間での再現性を確保するため、プラグの作製、イメージングパラメータ、および画像解析ワークフローのチーム間での標準化が必要です。
- 生理学的妥当性を維持するため、異なる細胞株、腫瘍の種類、またはストローマ共培養に本モデルを適用する際の適応上の検討事項が含まれます。
- 本アッセイはエンドポイント測定であるため、各タイムポイントで動物を犠牲にする必要があり、個体ごとの縦断的なサンプリングが制限されます。
バイオファーマ よくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Extracellular Matrix (ECM)–mimic Gel Plug Inoculation into Mice
2:43
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vascularization Using Ultrasound
5:31
Evacuation of ECM–mimic Gel Plug Vasculature Morphology Using Fibered Confocal Endomicroscopy
7:23
Results: Representative ECM–mimic Gel Plug Imaging
8:40
Conclusion
