寒天マウント:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウントの基本的な方法

- まず、E3中程度から低融点のアガロースを添加し、アガロースが完全に溶解するまで加熱します。アガロースを摂氏37度に冷却し、トリカイン溶液を加えます。次に、E3培地で胚を含むペトリ皿にトリカインを加えて胚に麻酔をかけます。ペトリ皿を渦巻いて、中央の胚を収集します。

トランスファーピペットを使用して、最小限の培地で1つの胚を描きます。ピペットを直立位置に保持し、胚を跳ね返してピペットの先端に配置します。次に、アガロースを希釈してゲル化を防ぐ余分な培地を追加せずに、胚をアガロース溶液に入れます。アガロース内で胚を穏やかに混合し、ピペットを使用して溶液をイメージングプレートのウェルに移します。

プレートを顕微鏡下に置き、ピペットチップを使用して胚を目的の向きに配置します。アガロースが固まったら、その上にトリカインを含むE3培地を注ぎ、寒天の水分を保ち、胚を画像化します。プロトコルの例では、イメージングと解析のためにパラビオティックゼブラフィッシュの胚をマウントします。

融合した胚の画像を取得するには、0.8%低融点アガロースを調製します。まだ熱いうちに、1ミリリットルのアガロースを37°Cの加熱ブロックにセットした1.5ミリリットルのマイクロチューブに分注します。胚を含む25ミリリットルのE3培地に、1ミリリットルあたり4ミリグラム、pH 7.0トリカインを1ミリリットル加えることにより、パラバイオティック胚に麻酔をかけます。胚が真ん中に溜まるように皿をそっと回します。

次に、先端の広いプラスチック製トランスファーピペットを使用して、できるだけ少ない液体で胚を引き上げます。次に、ピペットを直立させ、胚をそっと跳ね返らせて、ピペットの一番下に落ち着くようにします。次に、アガロースの表面にあるピペットチップに軽く触れて、胚を低融点アガロースの1ミリリットルアリコートに移します。ピペットから余分な液体を捨て、ピペットを使用してアガロース内の胚を穏やかに混合します。

次に、ピペットを使用して、アガロースと胚をガラス底の6ウェルプレートのウェルに移します。実体顕微鏡下で、ティーイング針の端に固定されたゲルローディングチップを使用して、胚をカバーガラスに近づけ、イメージングに適した方向に配置します。アガロースが硬化し、トリカインを含む培地をウェルに添加した後、倒立広視野落射蛍光レーザー走査型共焦点顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。

胚全体の視野を得るには、4倍の主観値を使用します。20倍対物レンズを使用して、特定の組織をイメージングします。テキストプロトコルに従って画像を処理します。