腫瘍球の高スループット画像解析：自動的かつ正確にスフェロイドのサイズを測定するための使いやすいソフトウェアアプリケーション

本実験の全体的な目的は、ハイスループット画像解析ソフトウェアを使用して、明視野顕微鏡で撮影された3次元腫瘍スフェロイドのサイズを測定することです。まず、3D腫瘍スフェロイドのすべての画像を、このスフェロイドサイズ測定プログラムに適したディレクトリ構造とファイル名に整理します。次に、スフェロイドサイズ測定プログラムがアクティブ輪郭モデル（active contour algorithm）に基づいてスフェロイドの境界を自動的に算出し、そのサイズを測定します。

次に、すべての画像で最適な結果を得るために、適切に設計された品質管理チェックを行います。データの結果を分析することで、実験的処置を受けた3Dステロイドの成長を解明することができます。このコンピュータプログラムの主な利点は、強力な自動画像解析アルゴリズムと品質管理ワークフローを統合しており、ハイスループットな画像解析をサポートしている点にあります。

本ソフトウェアは、不均一またはノイズのある画像背景にも対応しています。これにより、労力を大幅に削減し、解析プロセスを高速化できます。本ソフトウェアの導入は、産業界および学術界の両方において、3D腫瘍スフェロイドを薬剤スクリーニングの日常的なin vitroモデルとする上で有益です。

Sphe sizerを使用するには、シグナル処理および画像処理ツールボックスを備えたMATLABが必要です。オプションとして、パラレルコンピューティングツールボックスを使用することも可能です。RutgersのサーバーからOID sizerをダウンロードし、インストールディレクトリに解凍してください。このディレクトリは後のステップで必要になります。次に、画像を準備してください。

まず、イメージングシステムの画像解像度と、1ピクセルあたりのミクロン数で表される画像の絶対スケールを決定します。最終的に、実験における各画像のスケールは同一である必要があります。独自の画像ファイル形式は、TIFFやjpegなどの汎用的なファイル形式に必ず変換してください。

次に、ソフトウェアで要求される特定のファイル名とディレクトリ構造を使用してファイルを保存します。ファイル名はプレート、行、列によって命名する必要があります。ファイルディレクトリは、1つのディレクトリにつき1つの実験とし、実験内の各タイムポイントに対して1つのサブディレクトリを設けるように配置してください。あるタイムポイントにおけるすべてのプレートのすべての画像は、共通のサブディレクトリに保存する必要があります。まずMATLABを開き、コマンドウィンドウでsphe sizerのインストールディレクトリに移動します。

次に、Sphe sizer one zero と入力して Enter キーを押し、この OID sizer プログラムを起動します。新しいウィンドウに表示される参照ボタンをクリックし、実験で得られたすべての画像が保存されているディレクトリを選択してください。その後、フォルダのテキストフィールドで、「include sub folders（サブフォルダを含める）」トグルを選択して品質管理を行います。

オンザフライ表示オプションを選択します。次のステップでは、画像の解像度を指定する必要があります。これは、プログラムがピクセルをミリメートルに正しく変換するために必須の操作です。この時点で、ユーザーは詳細メニューに入り、この特殊なカラーボックス内のより詳細な設定にアクセスできます。

8ビットまたは16ビット画像の場合は、「none」のままにしてください。画像が12ビットでキャプチャされている場合は、「12 bit」を選択してください。

すべての設定が適切に完了したら、「compute」をクリックして計算を開始します。計算は画像セット全体に対して実行されます。個々のセグメンテーション結果は、計算が完了するとソフトウェア上に随時表示されます。結果テーブルには、解析されたすべての球体について、フォルダ内のファイル容量、長さ、幅、および有効性の切り替え（valid toggle）が表示されます。この有効性の切り替えは、品質管理のために使用します。

結果テーブル内の任意のセルをクリックすると、確認用にオリジナル画像と品質管理画像が右側に表示されます。キーボードの下矢印キーを使用して、すべての画像を順次確認してください。スフェロイドの境界に疑わしい箇所がある場合は、オリジナル画像上の「manual initialize」をクリックして修正します。楕円ツールをドラッグして、スフェロイドをより正確に囲んでください。

結果テーブルの測定値がそれに応じて更新されます。手動による初期化で目的のステロイドの最適境界が見つからない場合は、「hand draw」ボタンを使用して元の画像を表示し、ステロイドの境界をトレースしてください。画像に有効なステロイドが含まれていない場合は、その画像の「valid」トグルをオフにしてください。

品質管理が完了したら、[format results] ボックスをクリックして結果を保存します。エクスポートされるファイル名は、[advanced to] オプションウィンドウで設定可能です。リスト出力ファイルはタブ区切りのテーブル形式で、すべての測定値を含めることができます。

出力ファイルの形式はタブ区切りテーブルであり、視覚的な確認および後続のデータ解析を容易にするため、体積値が元のプレート形式で整理されています。Sphe sizerは、様々な不利な画像条件下においても、画像上の球体の境界を堅牢に検出することが可能です。稀にこのOIDの検出が不適切に行われる場合がありますが、その際は手動初期化ツールを使用することで、ユーザーがこのステロイドの位置とサイズを手動で適切に定義できます。

極端なケースでは、ステロイドが自動的または手動初期化ツールによって、妨害要因のあるノイズの多い背景から正しくセグメンテーションされないことがあります。このような場合、本プログラムではユーザーがステロイドの境界を手書きで描画し、正確な経時的および体積的な測定値を生成することが可能です。ソフトウェアの効率性は、同一の288枚の画像セットを用い、手動解析とシングルコアおよびマルチコアコンピュータによる解析を比較することで検証されています。

ソフトウェアの再現性を実証するため、ステロイドサイザーを用いた画像解析は、手動測定よりも1枚あたりの解析速度が18倍以上速いことが示されました。24個のステロイドセットを各手法で3回ずつ解析しました。緑色で示されたステロイドサイザーは、手動解析よりも測定値の標準偏差が小さいことが示されました。

ステロイドサイザーの活用により可能となった実験において、HSP 90阻害剤およびクラドリビンの投与による腫瘍スフェロイドの増殖が検証されました。その結果、併用療法がin vivoで抗腫瘍効果を持つ可能性が示されました。本研究では、3D腫瘍スフェロイドのサイズを正確に決定するための、迅速かつ柔軟で効果的なプログラムを提示します。

ster sizeプログラムは使いやすく、ユーザーによる入力は最小限で済みます。この手順を行う際は、ステロイドが壁の端に触れることなく、視野の中心で結像していることを確認することが重要です。すべての画像は同一の対物レンズ下で撮影し、すべてのファイルがプロトコルに指示された通りに正しく命名および配置されている必要があります。