1分子FRETによるDNAループを研究

次の実験の全体的な目標は、DNA結合タンパク質を使用せずに、二本鎖DNAのループダイナミクスがDNAの固有の形状によってどのように影響を受けるかを調べることです。これは、異なる曲率の二本鎖DNA断片に色素分子を組み込むことで達成され、蛍光共鳴、エネルギー移動、またはフレットによってDNAのループを監視できます。その後、単一のDNA分子からの可逆的なループおよびループ解除のイベントは、全反射顕微鏡で観察できます。

DNAのループ速度は、各単一分子蛍光の時間軌跡から外挿できます。最終的には、フラグメントの固有の形状に対するDNAのループ確率を測定できます。このDNAループアッセイの主な利点は、A DNAのループ動態に影響を与える可能性のあるA DNA結合タンパク質に依存しないことです。

シンプルなプロトコルは、蛍光共鳴エネルギー移動と呼ばれる技術と、PCRベースのDNA合成を使用することです。DNAの探索確率を測定するには、まず、10 MER配列を繰り返すことにより、グローバルに湾曲したDNAを設計します。例えば、この代表的な配列は186塩基対の湾曲したDNAであり、Xはランダムな追加塩基であり、繰り返される10量体の配列に隣接する配列はアダプター配列である。

次に、プライマー1とプライマー2でPCRを行い、フレットドナーSI3でプライマー2を5プライムエンドで標識します。次に、プライマー3とプライマー4でPCRを行い、フレットアクセプターSCI 5標識をバックボーンとプライマー3の5プライムエンドでビオチンリンカーで行います。PCRクリーンアップキットを使用してPCR産物を精製した後、SCI 3標識産物とSCI 5標識産物をバッファーに混合し、それぞれ0.4マイクロモルと0.1マイクロモルの最終濃度で鎖交換します。

次に、ストランドを摂氏98.5度で2分間インキュベートし、毎秒0.1°Cのランプ速度で摂氏5度まで徐々に冷却し、次に摂氏5度で2時間インキュベートします。ストランドを交換してフローセルを準備するには、ドリルプレスとダイヤモンドドリルビットを使用して、3インチ×1インチのスライドガラスの2つの反対側の端に沿って6〜7対の穴を作成します。すべての穴が開けられたら、スライドを流水でこすり、目に見えるガラス粉を取り除きます。

スライドを直立させてガラス瓶に入れ、蒸留水を入れます。瓶を15分間超音波処理してから、スライドをアセトン洗浄専用のガラス瓶に移します。瓶にアセトンを入れ、スライドをアセトンでさらに15分間超音波処理します。

次に、スライドにエタノールをスプレーし、次に水でスライドをすすぎ、スライドをポリプロピレンジャーに移します。ポリプロピレンジャーに5モルの水酸化カリウムを充填し、最後の洗浄後さらに15分間スライドを超音波処理し、蒸留水でスライドをすすぎ、続いてさらに15分間洗浄します。その後、カバースリップを洗浄した後の超音波処理。

同様に、準備したばかりの80マイクロリットルのPEG溶液を各スライドに分配し、次にカバースリップをペグの上に静かに下げます。45分後、ピンセットを使用してスライドからカバースリップを取り外し、スライドとカバースリップを大量の蒸留水ですすいでください。次に、カバーがスリップし、スライドが乾いたら乾燥させて乾燥させ、スライド全体に薄い両面テープの細片を置いてチャネルを形成し、ストリップの上にカバースリップを滑り込ませ、カバースリップをしっかりと押して液体のタイトチャネルを形成します。

次に、5分間のエポキシを使用してチャネルの端をシールし、顕微鏡検査用の分子を固定します。まず、15マイクロリットルのノイトラジン溶液を1つのチャネルに注入します。2分後、100マイクロリットルのT50バッファーでチャネルをすすぎ、次に50マイクロリットルのDNAサンプルをチャネルに注入します。

5分後、結合していないDNAを100マイクロリットルのT50バッファーで洗い流し、酸素捕捉システムを含むイメージングバッファーでチャネルを満たします。次に、顕微鏡の対物レンズに液浸油を敷き、標本クリップを使用してフローセルを顕微鏡ステージに貼り付けます。532ナノメートルレーザーをオンにします。

モニター上の蛍光画像のライブビューを使用して罰金を科します。ピントを調整します。532ナノメートルのレーザーをオンにしてデータ取得を開始します。

ほとんどの分子が画像を処理および解析するために光漂白されている場合は、データ取得を停止し、MATLABスクリプトを使用して、高フレット信号と低フレット信号の間の複数の遷移を示すすべての単一分子の時間トレースを調べます。ループ状態とループ解除状態を特定し、適合した 2 つのガウス曲線間の交点を決定することで、2 つの分布を分離するしきい値を見つけます。次に、SF 強度を SCI 3 と SF 強度の合計で割って F フロント効率を計算します。

ループ状態を高いフレット値で割り当て、ループ解除状態を低いフレット値で割り当てる。次に、MATLABスクリプトを使用して、ループした、つまりさまざまな時間経過で高フレット状態に達した分子またはNFTの累積数を解析します。データ取得の開始以来、NFTに指数関数を当てはめることで、ループレートKサブループを抽出することができます。

NFTがbiを増加させると、基本的には方程式で示されるように二重指数関数を当てはめることができます。この場合、この方程式からKサブループが取得され、J因子の流れが決定されます。30〜50ピカモルのビオチンsci 5オリゴまたはプライマー3の20マイクロリットルを、ちょうど示したようにナットtravainコーティングチャネルの1つに

次に、100マイクロリットルのT50でチャネルをすすぎ、未結合のオリゴを洗い流し、PS3オリゴを添加した新たに調製したイメージングバッファーをチャンバーに流します。532ナノメートルのレーザーをオンのままにしてから、640ナノメートルのレーザーを短時間オンにして、表面に結合したSFオリゴの位置を特定します。次に、640ナノメートルのレーザーをオフにして、フレット信号の監視を開始します。

MATLAB スクリプトを使用して、非結合状態で開始する分子の数を解析します。これは、sci 5強度が低いですが、後でIL状態に変わります。つまり、scifi強度のトレースから時間の関数としてscifi強度が高い場合、この数のane分子と時間をプロットし、曲線を単一の指数関数で近似してイーリングレートを取得します。

K サブアニル、異なるSI 3オリゴ濃度で実験を繰り返して、ひざまずく速度と反応物濃度との間の直線性を確認します。傾斜から2次ひざまずく速度定数K素数サブエールを抽出します。最後に、K サブループが同じバッファー条件下で測定されたループ速度である J 係数を計算して、二本鎖 DNA の固有曲率がループに及ぼす影響をテストします。

この実験では、1つの直線と1つの湾曲した186塩基ペア。二本鎖DNAは、ストレートDNAと比較してそれぞれ構築されました。湾曲したDNAは、同じ期間により多くの高フレットイベントを生成することが決定されました。

また、湾曲したDNAは、同じ取得時間内にストレートDNAの4倍の頻度でループし、DNAの固有の湾曲がループダイナミクスに大きな影響を与えることを示しています。この最終解析ステップでは、J因子は、ループ率を1次(ニーリングレート定数)で割ることによって計算され、以前の知見と一致して、ストレートDNAで61プラスマイナス3ナノモル、曲線DNAで265プラスマイナス48ナノモルと決定されました。この手順に続いて、温度、非ひずみ、粘度などのループ移動性に対する事故因子の影響を調べることができます。

このプロトコールは、DNAの高分子物理学の研究だけでなく、研究初心者や一般の聴衆に単一分子蛍光の力を実証するのにも役立ちます。