組換えセルラーゼCEL5Aの式から

本実験の全体的な目的は、タバコにおいて標的タンパク質を一過性に発現させ、短期間での植物ベースの酵素発現の実現可能性を確認することである。この一過性発現は、目的遺伝子を組み込んだベクターを含むアグロバクテリウム腫瘍形成菌（Agrobacterium tumefaciens）の株をタバコの葉に浸潤させることで達成される。浸潤後の培養ステップを経て、植物の葉を回収し、タンパク質抽出液を部分精製して酵素作動液を得る。次に、植物ベースの発現が酵素に及ぼす影響を評価し、その酵素活性を検証するためにタンパク質分析を行う。

ウェスタンブロッティング、zy、および基質分解アッセイに基づき、タンパク質のサイズ、想定される糖鎖付加の影響、および酵素活性を示す結果が得られます。本手法は、植物バイオマスの変換に関する重要な疑問の解決に寄与し、タバコで一過性発現させた後の酵素活性に関する知見を提供することも可能です。浸潤ステップでは、注射器や衣服によって葉が損傷しやすいため習得が困難であり、また実験は無菌条件下で実施するため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

アグロバクテリウムの単一コロニーを、抗生物質を含む酵母エキスブロス 10 mL を入れた三角フラスコに植え継ぎます。次に、接種したブロスを 26 °C で 180 RPM の振盪条件下、36 ～ 40 時間培養します。その後、各培養液から 200 µL を取り出し、前述と同じ抗生物質を含む酵母エキスブロス 20 mL に接種し、同様の条件下で 36 ～ 40 時間培養します。

2 µLのアセトフェノン、100 µLの40%グルコース溶液、およびpH 5.6の1 M MES緩衝液200 µLを用いて培養物を誘導し、そのまま一晩インキュベートします。次に、温室から植物を取り出し、浸潤を容易にするため、ピペットチップを使用して植物の上から3枚目から5枚目の葉のAB軸側を切り込みます。その後、シリンジに浸潤用培地を満たし、あらかじめ作った切り込みの1か所に当てます。

軸葉側に指を添えてシリンジを固定し、葉の葉脈内に慎重に培地を注入します。TR cell 5:00 AM cherryを発現している葉の切片において蛍光を可視化するために、緑色光を放出する携帯型光源を植物に照射します。赤色フィルターを通して観察すると、TR cell 5:00 AM cherryからの蛍光がはっきりと確認できます。

発現タンパク質を抽出するために、P track ERTR cell five Aを含むAUMを浸潤させたタバコ葉を選択し、1 gずつに切り分けます。次に、それらをあらかじめ冷却した乳鉢に入れ、試料に適量の液体窒素を加えます。乳棒を用いて、葉を粉末状になるまで研磨します。

非浸潤のタバコ葉を用いて同様の操作を繰り返し、コントロールサンプルを得ます。次に、1 mMのphenyl methyl suen fluorideを含むPBSを2 mL、粉砕した葉組織に加え、葉組織の大部分が懸濁するまで混合します。この抽出液を 15,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。

次に、ペレットを廃棄し、タンパク質を含むS natinを55 °Cで10分間インキュベートして、部分精製したTR cell five Aを調製し、その後室温でさらに10分間静置します。次に、SNATを室温で15,000 ×g、10分間遠心分離します。ペレットを廃棄し、タンパク質を含むsnatを以降の工程に使用します。

さらなるアッセイ。また、対照試料を得るために、非浸潤植物に対しても部分精製工程を実施します。この手順では、エチルセルロースと水を混合して1.5%溶液を作成し、溶解するまで攪拌しながらインキュベートします。

A-C-M-C-S-D-Sページゲルを作製するには、10 mLのSDSページゲル混合溶液中の水1 mLを1.5% CMC 1 mLに置き換え、通常通りにゲルを流し込みます。次に、SDS存在下で試料を沸騰させ、変性させます。泳動は200 Vで、色素前線がゲルの下端に達するまで50分間行います。その後、この1.5% C-M-C-S-D-Sページゲルを用いて、ゲル内でのタンパク質リフォールディングを行います。

pH 6.5の20 millimolar リン酸クエン酸緩衝液に1.5% beta cyclodextrinを溶解して使用します。ゲルをこの溶液に浸し、室温で緩やかに振盪しながら15分間インキュベートします。beta cyclodextrin溶液を廃棄し、ゲルを水で軽く洗浄した後、pH 4.8の50 millimolar 酢酸ナトリウム緩衝液中で室温にてさらに15分間インキュベートします。

次に、リフォールドした15%C-M-C-S-D-Sページゲルを、30 mM 酢酸ナトリウム緩衝液中で50 °Cで20分間インキュベートし、CMC zymographyを行います。CMCが分解された部位を可視化するため、0.1% コンゴレッド溶液を用いてゲルを10分間染色し、1 M 塩化ナトリウムを用いて30分間、またはバンドが鮮明になるまで脱色します。最後に、0.3% 酢酸でゲルを洗浄します。アッセイの実施直前に、より鮮明な画像を得るため、4 MUC 2倍濃度作動液を調製し、4 MUC 作動液 100 µL を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで分注します。

次に、各サンプル100 µLを適切なウェルに分注し、励起波長360 nm、蛍光波長465 nmを用いて各サンプルを3連（triplicate）で測定します。蛍光分光法により、0分時点の蛍光強度を測定します。続いて、プレートに粘着蓋をして50 °Cで20分間インキュベートします。

続いて、凍結させて反応を停止させます。その後、0分時の時点と同じパラメータを用いて、エンドポイントの蛍光値を測定します。20分時の蛍光値から0分時の蛍光値を差し引き、アッセイ実行直前の酵素活性による蛍光変化量を決定します。

A-O-C-M-C 2倍希釈用作業溶液を調製します。次に、1.5 mLチューブにサンプル50 µLと作業溶液50 µLを混合します。続いて、サンプルを50 °Cで20分間インキュベートします。

250 µLの沈殿溶液を加えて反応を停止させます。続いて、各サンプルを10秒間激しくボルテックスし、サンプルと沈殿溶液を完全に混合させます。その後、サンプルを室温で10分間インキュベートし、再度ボルテックスしてから、1000 Gsで10分間遠心分離します。

その後、各サンプルのSNATから200 µLを、撹拌せずに96ウェルプレートに分注します。ペレットの酵素活性は、可溶化した色素のレベルが高いことで示されます。これを波長590 nmの吸収分光法を用いて測定します。

このステップでは、ろ紙の円形ディスクを1.5 mLまたは2 mLチューブに入れます。ろ紙ディスクに60 mM酢酸ナトリウム100 µLとサンプル100 µLを加え、50 °Cで300 RPMの振盪をかけながら20時間インキュベートします。

さらに、アッセイの直前に、ろ紙を加えない個別のサンプルをコントロールとしてインキュベートします。PABA溶液Aを1 mLとPABA溶液Bを9 mLを含む1.5 x PABAワーキングソリューションを調製します。使用時まで氷上で保存してください。次に、0.5 mL耐熱チューブにサンプルを調製します。

サンプルは、45 µLの水、フィルターペーパーとともにインキュベートした各溶液5 µL、および100 µLのPABAワーキングソリューションで構成されます。その後、同様に調製したサンプルコントロールおよび5つの標準試料をランさせます。次に、サンプル、コントロール、および標準試料を100 °Cで正確に10分間インキュベートし、室温でさらに10分間冷却します。

溶液100 µLを96ウェルプレートに分注し、分光光度計を用いて波長410 nmでアッセイを行います。還元糖の放出量を決定するため、フィルターペーパー試料の値から個々の試料コントロール値を差し引きます。以下に、発現カセットおよびタバコ植物におけるタンパク質発現を示す画像を示します。

これは、通常の光の下、および赤色フィルターを用いた緑色光の下での、タバコ葉の浸潤後の様子です。ここでは、赤色で示されるTR cell 5:00 AM cherryの発現が明確に確認できます。SDS-PAGEゲル、ウェスタンブロット、およびCMCザイモグラムは、T cell five Aのサイズと活性を示しています。全可溶性タンパク質が分離されており、クマシーブルー染色で可視化できます。T cell five AのHisタグ領域に対するウェスタンブロッティングによりタンパク質のサイズが確認され、さらにCMCに対するセルラーゼ活性がコンゴレッドで染色したザイモグラムによって示されています。ここで見られるのは、TR cell five Aを一過性に発現させたタバコ葉由来の全可溶性タンパク質であり、熱沈殿精製の前後の状態を示しています。TR cell five Aは可視化される中で最大のバンドであり、ウェスタンブロットおよびCMCザイモグラムでも確認できます。

また、熱沈殿後におけるTcell five Aを含まないタバコ植物由来の全可溶性タンパク質、および市販のtresa cellulase混合物由来のタンパク質についても示します。この図は、TR cell five Aの酵素活性定量を示しています。TR cell five Aを4 MUC Azo CMCまたはろ紙とともにインキュベートし、基質の分解をフルオロ44muアゾ染料の放出、またはPBAの呈色変化による還元糖の定量によって測定しました。この手順に続き、タンパク質標的化などの他の手法を用いて、タンパク質の局在が酵素の安定性と活性にどのように影響するかについて、さらなる情報を得ることができます。

このビデオを視聴することで、タバコへのタンパク質の過剰発現方法についての明確な理解が得られたとともに、セルロースバイオマス変換のための酵素活性の評価方法に関する十分な知識を習得できたはずです。