Name: 組換えセルラーゼCEL5Aの式からトリコデルマ·タバコ植物における (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 学ぶタバコ植物におけるTrCel5Aセルラーゼの一過性発現法。蛍光融合タンパク質による発現モニタリングと酵素活性評価を通じて、植物バイオマス変換への応用可能性を検討します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、BMBF Forschungsinitiativeによってサポートされていました」BioEnergie 2021 - Forschung毛皮はNutzungフォンBiomasseダイ」と科学を推進するため、ドイツ連邦政府と州政府によってエクセレンス·イニシアチブを通じて資金を供給されている優秀「バイオマスからのオーダーメイド燃料」、のクラスターをとドイツの大学での研究。

野生型のN.タバコ植物の 1。成長<ol><li> Nを成長させるタバコ L. CV。土壌へのプチハバナSR1植物は、発芽のための通常のポッティング土壌を充填適切なポットにタバコ種子を置く。 2週間後、個々のポットに苗を移す。定数22℃（暗期）または25℃（明期）および70％の相対湿度で温室で植物を培養する。 8分の16時間明/暗サイクルで照明を提供（ 例えばフィリップスIP65 400Wのランプ、180マイクロモル·秒-1·メートル-2;λ= 400〜700 nm）で毎日水。 </li></ol> TrCel5AとTrCel5A-mCherryタンパク質の2。一過性発現<ol><li>無菌条件下で、pTRAkc-ER-TrCel5AまたはpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryのいずれかを含むAgarobacterium tumefaciensの単一のコロニー（GV3101 :: pMP90RK GMR、KMR、RifR）をピックアップし、10ミリリットルの酵母抽出物を含有する三角フラスコに移すブロス（YEB、製造業者の仕様書に従って調製）培地およびカナマイシン（50 mg / ml）を、リファンピシン（50 mg / ml）を、および選択のためのカルベニシリン（100 mg / mlで）。 26℃、180rpmで36〜40時間インキュベートする。注意：タンパク質発現のための適切な構築体のデザインは、本稿の範囲外ですが、指導のため、マクリーンら 13とマンローとPellham 14の方法には、構造物の設計のために続けることができます。 </li><li>上記の抗生物質濃度をYEBの20ミリリットルを接種し、前と同じ条件でインキュベートする各培養液200μlを取る。 </li><li> 36-40時間後、2μlのアセトシリンゴン（200μM最終濃度）、100μLの40％（w / v）のグルコース溶液と1 M MES緩衝液（pH5.6）を200μl。を添加することによって培養物をpreinduce一晩インキュベートする。 </li><li> 2×浸潤緩衝液（100 g / Lのスクロース、3.6グラム/ Lのグルコース、8.6グラム/ Lムラシゲ·スクーグ基本塩を100mlを調製、）、水酸化カリウムを使用して5.6にpHを調整する。 </li><li>それは、OD 5-6の600に到達するまで1時05希釈液との文化のOD 600を測定します。 OD 600で30ミリリットル浸潤培地に必要な培養液量を計算します。 2X浸潤バッファの15ミリリットルを追加し、30ミリリットルまでのバッファを作るために、脱イオンH 2 Oを加える。 </li><li>温室から植物を取り出し、浸透を容易にするために、上から5 番目の葉に、ニックに3 回目の背軸側をピペットチップを使用しています。 </li><li>侵入を容易にするために、ニックに葉の背軸側をピペットチップを使用してください。 </li><li>浸透培地で注射器を記入し、以前に作らニックの1に（針なしで）それを置く。向軸、葉側の指で注射器をサポートしています。 interveinal葉ゾーンの組織の中に慎重に培地を押してください。注意：浸透後、上記と同様の条件で、温室内の植物を栽培しています。また、untrの同じ割合を維持浸透させた植物と同じ条件下で、コントロールとしてeated、非一過性発現植物（NTEPs）。 </li></ol>植物の葉におけるTrCel5A-mCherry発現の3。評価<ol><li> 4-6日後、Aに浸透させた植物を取る温室からpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryを含有し、蛍光分析のために、暗い部屋の中に置いツメファシエンス 。 </li><li>赤色フィルター（620から750ナノメートル）と515 nmの緑色の光を発する携帯用光源を用いTrCel5A-mCherry、光の植物を表す葉の切片の蛍光を可視化した。注：深さは、植物の葉におけるタンパク質発現の特徴付けは、光及び蛍光顕微鏡下で検査し、ビブラトームで薄切片の葉によって達成することができる。このために、以下の手順に従います。 <ol><li>浸潤葉から約5×5mmの大きさの小さな部分をカットし、アガロース50 mMリン酸緩衝液（pH 5.7）に溶解し、4％に埋め込む。 </li><li>カットビブラトームを使用して埋め込まれた葉から、80〜90ミクロンの大きさの部分。バッファまたはカバースリップで覆い、上述と同じ波長フィルタを用いて、蛍光検出器を用いて10倍の倍率で顕微鏡を使用して調べ、顕微鏡スライド上に置きます。 </li></ol></li></ol>タバコ葉から4。TrCel5A抽出<ol><li> A.に感染した植物から1グラムのおおよそのウェイトにタバコの葉から作品をカット液体窒素で予冷し乳鉢でpTRAkc-ER-TrCel5Aと場所を含むツメファシエンス 。サンプルに液体窒素を適量入れる。グラインドは予備冷却乳棒を使用して粉末に残します。 </li><li>接地葉印刷物に1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mlを加え、葉状物質の大部分が懸濁液中になるまで混合する。 4℃で20分間15,000 xgで遠心抽出物およびタンパク質を含む上清を取る。 </li><li>セントリフーガ4℃で20分間15,000×gでの抽出物とは、ペレットを破壊しないように注意しながら、タンパク質を含む上清を取る。ペレットを捨てます。 </li><li>部分的に10分間55℃でタンパク質含有上清をインキュベートすることによってTrCel5Aを精製する。 RTで10分間15,000 xgで遠心分離し、次いで、さらに10分間室温で休息できるようにする。対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。 </li><li>対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。 </li></ol> 5。、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびTrCel5A-mCherry &lt;アゾ-CMCザイモ/ pの&gt; <ol><li>購入または確立された方法15に従って（w / v）のSDS-PAGEゲル12％を準備。 </li><li> 1.5％（w / v）の溶液を得、水にCMCを溶解する。 CMC-SDS-PAGEゲルを作るために、0.1％（w / v）のCMC + 12％（重量/体積をもたらすを10mlのSDS-PAGEゲル混合液に1mlの水1.5％CMC 1mlの置き換え）SDS-PAGEゲルミックス。通常のゲルを注ぐ。注意：元の溶液中のCMCが完全に40℃（前ゲル溶液を調製する直接繰り返す）に攪拌および加熱の組み合わせにより溶解していることを確認してください。 </li><li>確立された方法12に従って、SDSの存在下で沸騰させることにより、サンプルを変性させる。陽性対照として、T.から市販のセルラーゼ混合物の1:500希釈を使用このようなTとしてデルマレー 、 デルマレー ATCC 26921。ネガティブコントロールとして非浸潤葉（NTEPs）から同様に調製したタンパク質溶液を使用しています。 </li><li>通常のプロトコル15に従って電気泳動を行って、例えば色素の先端がゲルの底に達すると停止し、電気泳動で〜50分間、200Vを使用しています。 </li><li> 0.1％を用いたものSDS-PAGEゲルを染色（w / v）のクーマシーブリリアントブルー、メタノール/氷酢酸混合物を用いて脱色。注：ラピッド染色及び脱色を穏やかな染色を加熱し、10分後、脱色液を変え、温め（ただし沸騰）第染色をした後、脱色溶液で15秒〜マイクロ波を用いて、すなわち溶液を脱色することにより行うことができるとき、または冷却し、新たな脱色液を繰り返します。 </li><li>確立されたプロトコル16,17を使用して1 SDS-PAGEゲルのウェスタンブロッティングを行う。 （二）アルカリホスファターゼに結合されたHisタグ（プライマリ）とポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体Fc領域に対するポリクローナルウサギ抗体：以下の抗体を使用してください。注：二次抗体は、ニトロブルーテトラゾールを用いて可視化を可能にするために選択されるべきであるイウムchloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39; - indolyphosphateのp-トルイジン塩（NBT / BCIP）、18に記載されているよう。 </li><li> 1.5％ゲルをインキュベートすることによって0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲル上でリフォールディングゲル内のタンパク質を用いて室温でβ-シクロデキストリン、20mMのリン酸 - クエン酸緩衝液、pH 6.5（w / v）の実行穏やかな15分19振とう。 </li><li> β-シクロデキストリンのソリューションを捨て、簡単に、H 2 Oでゲルを洗うさらに15分間50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中で、室温でインキュベートする。 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.8の中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディング0.15％CMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う</li><li> 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディングし、0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う</li><li> 30分間、またはクリアバンドが1 MのNaを使用して観察されるまで、0.1％w / vコンゴーレッド溶液及び脱染を用いて10分間ゲルを染色CL。明確に画像化のための0.3％（v / v）の酢酸でゲルを洗浄する。 </li></ol> TrCel5Aの6。4-MUC活性アッセイ<ol><li> 50％（v / v）メタノール中の10mM 4-MUCのストック溶液を調製し、RTで暗所に保管して</li><li>アッセイの直前に、1 mMの4-MUCさ60mm酢酸ナトリウム、pH 4.8で構成される4-MUC 2X作業溶液を、準備します。 </li><li> （誘導的に発現の有無TrCel5Aなし）葉タンパク質100μlを、Tから100μlの市販のセルラーゼ混合物を含む試料に、このテストを実行するレセイ 1:1,000、および純粋なH 2 Oであった。三重に各サンプルを実行します。 </li><li>ピペット96ウェルプレートの各ウェルに4-MUC作業溶液100μlを、各試料100μlを加える。 </li><li> 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光の0分の時点を決定します。 </li><li> 20プレートをインキュベート50℃分間、蒸発を防ぐために接着剤の蓋で覆った。凍結（またはμlの0.15 Mグリシン、pHは10.0と、別々のプレートの試料100μlを100とを組み合わせることにより）により反応を停止します。 </li><li> 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光のエンドポイントを決定します。蛍光値の変化を得るために、エンドポイント（20分）の時点から0分を差し引く。 </li></ol> TrCel5Aの7。アゾキシメチルセルロース活性アッセイ<ol><li> 0.5 M、RTで保存する1.5％のストック（w / v）のアゾ-CMC、および18mMの酢酸亜鉛を含有する沈殿溶液を調製酢酸ナトリウム、pH 5〜80％エタノール（v / v）で、室温で保存温度。 </li><li>アッセイの直前に、1％（H 2 O中）（w / v）のアゾ-CMCおよび60mMの酢酸ナトリウム、pH 4.8からなるアゾ-CMC倍ワーキング溶液を調製。 </li><li> 50μlのサンプルと仕事の50μLを組み合わせる1.5ミリリットルのチューブでソリューションをING。 </li><li> （一時的に発現したかTrCel5Aなし）葉タンパク質の50μLを含有する試験サンプル; T.から市販のセルラーゼ混合物100μl デルマレーは 1:1,000に希釈した。そして、純粋なH 2 O三重でサンプルおよび標準を実行します。 </li><li> 50℃で20分間、サンプルをインキュベート沈殿溶液を250μlを添加して反応を停止させます。溶液が完全に混合したことを確認するために10秒間激しくボルテックス各サンプルを。 </li><li>室温で10分間サンプルをインキュベートし、再度ボルテックスする。 10分間1,000×gでの遠心分離のサンプル。ペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェルプレートに各サンプルの上清を200μlを削除します。 </li><li> 590nmの波長で吸光度分光法を用いてアッセイ。 </li></ol> TrCel5Aの8。PAHBAHアッセイ<ol><li>ろ紙円（〜5.5ミリメートル径）をカットして穴パンチを使用してください。 100μlの60 mMののNaAc、pHは4.8、および1を追加サンプル（誘導的に発現の有無TrCel5Aなしで）の葉のタンパク質を含むいずれか、または商業Tの00μL リーゼイのセルラーゼ混合物は、1:1,000に希釈し、300rpmで振盪しながら50℃で20時間濾紙丸でインキュベートする。濾紙とインキュベートし、各試料について、個々のサンプルを対照として濾紙なし重複溶液をインキュベートする。 </li><li> RTで5 100mlの溶液を、合計濃HCl溶液、およびストアを添加してH 2 Oに溶解することによってPAHBAH 330 mMのパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）溶液Aを調製。注：最良の結果は、H 2 Oで100mlとする量を加える前に、溶解を助けるために温度下で撹拌PAHBAHスラリー、 すなわち 30ミリリットル、より小さな体積にHClを添加することによって達成される</li><li> RTでの50 mMクエン酸ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、および500mM NaOHおよびストアを含む、PAHBAH溶液Bを調製する。 </li><li> IMMEDiatelyアッセイの前に、使用するまで（4時間以内に使用する）氷上9ミリリットルの緩衝溶液、ストアに1ミリリットルのPAHBAH試薬の1.5倍の作業溶液を調製する。 </li><li>耐熱性0.2または0.5 mlチューブ内のサンプルを準備します。フィルターペーパー（ステップ8.1）、H 2 Oを45μLとPAHBAH作業溶液100μlとインキュベートし、各溶液5μlを兼ね備えています。サンプルコントロール（フィルターペーパーなしでインキュベートしたサンプル）は、同じ濃度（5μlのサンプル、45μlのH 2 O、100μlのPAHBAH使用液）の下で実行する必要があります。また、0〜0.2gのグルコース/ Lを含有する5規格（5μl）を、純H 2 Oをテストする三重でサンプルおよび標準を実行します。 </li><li>正確に10分間RTで冷却し、次いで、100℃で正確に10分間、サンプルをインキュベートする。波長410nmで96ウェルプレートおよびアッセイ分光ピペットソリューションを提供しています。最終的な取得するためのサンプルから（フィルターペーパーなしでインキュベート）個々のサンプル·コントロールを引く値。 </li></ol>

<ol><li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+for+biomass+degradation%3A+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li>
<li>Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li>
<li>Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+as+bioreactors%3A+recent+developments+and+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li>
<li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco%2C+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li>
<li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li>
<li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGIII%2C+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei%3A+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li>
<li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fluorescent+proteins%3A+innovations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li>
<li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li>
<li>Béguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li>
<li>Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li>
<li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li>
<li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+%28HPV-16%29+L1+expression+in+plants%3A+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li>
<li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9CWestern+Blotting%E2%80%9D%3A+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li>
<li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+%CE%B2-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate%E2%80%93polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li>
<li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+molecular+farming+in+the+future%3A+transient+protein+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li>
<li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function%3A+Insights+from+sequence+analysis%2C+biophysical+measurements%2C+and+molecular+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム1のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを使用することは、必要であれば、翻訳後修飾を可能にする20。明らかな利点を提供しながら、セルラーゼの構成的発現を可能にするために、植物を変更するか、成功しない可能性があり、時間がかかる方法である。このような発現されたタンパク質や誘導性発現メカニズムの隔離のような技術は、植物に成功したセルラーゼの生産の可能性を高めるが、これらはまだ確立に何カ月もかかる。ここでは、一過性発現法は、特定のセルラーゼの可能性を例示するために、実証される数日のうち以内に植物系を経て製造される。 蛍光タンパク質mCherryとの融合は、一過性のタンパク質...

<html>リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース1の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁1の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後3を必要な酵素を変更することができる。 &quot;ve_content&gt; ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能4に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間5におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー5、CEL5A、6からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖7を roylzing。 ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から9異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。 TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 - メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（RemazolbrilliantブルーR）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ12などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。

<table><tbody><tr><td>4-メチルウンベリフェリル &β;-D-セロビオシド</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>アセトシリンゴン (濃縮)</td> <td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 - カナマイシン</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 - リファンピシン</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 - カルベニシリン</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - rabbit anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - ヤギ anti rabbit AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxymethyl セルロース</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-cyclodextrin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロース</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ Trichoderma reesei ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>コンゴレッド</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>クーマシーブリリアントブルー G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>濾紙 - Rotilabo あぶらとり紙</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES バッファー</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>土壌、Einheitserde classic&nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光計 - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-ヒドロキシベンズヒドラジド&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV 光源 - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

組換えセルラーゼcel5aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。

TrCel5AとTrCel5A-mCherryを、一過性発現系（ 図1Aおよび1B）を用いてタバコ植物において首尾よく発現された。 TrCel5A-mCherry融合タンパク質の発現パターンの検査は、健康な葉の緑色光（ 図1D）の下で広範なタンパク質の発現を示した（ 図1C）を 、明らかにした。 総可溶性タンパク質の抽出を一過TrCel5Aタンパク質を発現させ、SDS-PAGEは、タンパク質の多種多様を示した葉を含有していたタバコ植物で行った本であった（ 図2A、レーン1）。植物およびNTEPsに由来する全可溶性タンパク質サンプルを発現TrCel5Aからの全可溶性タンパク質サンプルを、55℃で10分間インキュベートした。他の多くの（ネイティブタバコ）タンパク質は、この温度で​​安定していないながらTrCel5Aは55℃で安定しており、アクティブな状態を維持します。このように、多くの非ess​​entiアルタンパク...

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

本実験の全体的な目的は、タバコにおいて標的タンパク質を一過性に発現させ、短期間での植物ベースの酵素発現の実現可能性を確認することである。この一過性発現は、目的遺伝子を組み込んだベクターを含むアグロバクテリウム腫瘍形成菌（Agrobacterium tumefaciens）の株をタバコの葉に浸潤させることで達成される。浸潤後の培養ステップを経て、植物の葉を回収し、タンパク質抽出液を部分精製して酵素作動液を得る。次に、植物ベースの発現が酵素に及ぼす影響を評価し、その酵素活性を検証するためにタンパク質分析を行う。ウェスタンブロッティング、zy、および基質分解アッセイに基づき、タンパク質のサイズ、想定される糖鎖付加の影響、および酵素活性を示す結果が得られます。本手法は、植物バイオマスの変換に関する重要な疑問の解決に寄与し、タバコで一過性発現させた後の酵素活性に関する知見を提供することも可能です。浸潤ステップでは、注射器や衣服によって葉が損傷しやすいため習得が困難であり、また実験は無菌条件下で実施するため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。アグロバクテリウムの単一コロニーを、抗生物質を含む酵母エキスブロス 10 mL を入れた三角フラスコに植え継ぎます。次に、接種したブロスを 26 °C で 180 RPM の振盪条件下、36 ～ 40 時間培養します。その後、各培養液から 200 µL を取り出し、前述と同じ抗生物質を含む酵母エキスブロス 20 mL に接種し、同様の条件下で 36 ～ 40 時間培養します。2 µLのアセトフェノン、100 µLの40%グルコース溶液、およびpH 5.6の1 M MES緩衝液200 µLを用いて培養物を誘導し、そのまま一晩インキュベートします。次に、温室から植物を取り出し、浸潤を容易にするため、ピペットチップを使用して植物の上から3枚目から5枚目の葉のAB軸側を切り込みます。その後、シリンジに浸潤用培地を満たし、あらかじめ作った切り込みの1か所に当てます。軸葉側に指を添えてシリンジを固定し、葉の葉脈内に慎重に培地を注入します。TR cell 5:00 AM cherryを発現している葉の切片において蛍光を可視化するために、緑色光を放出する携帯型光源を植物に照射します。赤色フィルターを通して観察すると、TR cell 5:00 AM cherryからの蛍光がはっきりと確認できます。発現タンパク質を抽出するために、P track ERTR cell five Aを含むAUMを浸潤させたタバコ葉を選択し、1 gずつに切り分けます。次に、それらをあらかじめ冷却した乳鉢に入れ、試料に適量の液体窒素を加えます。乳棒を用いて、葉を粉末状になるまで研磨します。非浸潤のタバコ葉を用いて同様の操作を繰り返し、コントロールサンプルを得ます。次

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

環境

私達は中の真菌エンドグルカナーゼ活性をスクリーニングするために、低コスト、高スループットの方法を説明します...

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告...

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。...

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

我々は、植物におけるモノクローナル抗体およびレポータータンパク質の一過性発現に対する導入遺伝子の調節エレメント、植物の成長および発達パラメータ、およびインキュベーション条件の影響を決定し、モデル化するのに使用することができる実験アプローチの設計を記載している。...

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。...

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

細胞内レベルでは、シグナル伝達イベントは発生的および環境的な手がかりによって動的に調節されます。ここでは、タバコの一過性発現システムを使用して、動的なタンパク質間相互作用を監視し、植物細胞におけるシグナル伝達の空間的構成を明らかにするプロトコルについて説明します。...

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

従来の方法の難しさを克服するために植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現手法を開発しました。タンパク質の共発現を達成するためにカセットを表現する複数の機能的に独立して蛋白質を含んでいる単一発現プラスミドを使用する利点がかかります。...

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

ベンサミアーナ タバコ葉の生合成酵素の過渡の異種発現は新トリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。ここは、トリテルペン、この強力な植物ベースのプラットフォームを活用した類縁体の急速 (5 日間)...

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン...

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

学ぶタバコ植物におけるTrCel5Aセルラーゼの一過性発現法。蛍光融合タンパク質による発現モニタリングと酵素活性評価を通じて、植物バイオマス変換への応用可能性を検討します。

組換えセルラーゼCEL5Aの式から

さらに動画を探す