組換えセルラーゼCEL5Aの式からトリコデルマ·タバコ植物における

次の実験の全体的な目標は、タバコで標的タンパク質を一過性に発現させ、植物由来の酵素発現の実現可能性について短期間で理解することです。この一過性の発現は、第2のステップとして目的の遺伝子を組み込んだベクターを含むアグロバクテリウム腫瘍失菌の株をタバコの葉に浸潤させることによって達成されます。インキュベーション後、浸潤した植物の葉を収穫し、タンパク質抽出物を部分的に精製して、作動酵素溶液を得る。次に、植物由来の発現が酵素に及ぼす影響を評価し、その酵素活性を確認するために、タンパク質分析を行います。

ウェスタンブロッティング、zy、および基質分解アッセイに基づいて、タンパク質サイズ、可能なグリコシル化効果、および酵素活性を示す結果が得られます。この方法は、植物バイオマス変換に関する重要な質問に答えるのに役立ち、タバコで一過性に発現した後の酵素の活性に関する洞察も提供できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、シリンジヘルガーの服によって葉が損傷しやすいため、浸潤手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。

アグロバクテリウム・トアンの単一コロニーを10ミリリットル入りの三角フラスコに移します。抗生物質を含む酵母抽出物ブロス。次に、接種したブロスを摂氏26度で36〜40時間インキュベートし、180RPMで次に振とうし、各培養物の200マイクロリットルを20ミリリットルの酵母抽出ブロスに以前と同じ抗生物質で接種し、36〜40時間後に同じ条件下でインキュベートします。

2マイクロリットルのアセトフェノン、100マイクロリットルの40%グルコース溶液、および200マイクロリットルの1モルMESバッファーでpH 5.6で培養を誘導し、一晩インキュベートし続けます。次に、温室から植物を取り出し、ピペットチップを使用して、植物の上部から3番目から5番目の葉のAB軸側に切り込みを入れ、浸潤を容易にします。次に、注射器に浸透培地を入れ、以前に作った傷の1つに置きます。

アクシオリーフ側に指でシリンジを支え、メディウムを静脈内リーフゾーンに慎重に注入します。TR細胞を発現する葉部分の蛍光を可視化するために、午前5:00に桜が緑色を発するポータブル光源で植物を照らします。赤色のフィルターを通して見ると、TR細胞5:00 AMチェリーからの蛍光がはっきりと見えます。

発現したタンパク質を抽出するには、PトラックERTR細胞5Aを含むAUMが浸潤したタバコの葉を選択し、それらを1グラムの断片に切断します。次に、それらを予冷乳鉢に入れ、サンプルに適量の液体窒素を加えます。乳棒を使って葉を粉に挽きます。

浸透していないタバコの葉でこのプロセスを繰り返して、コントロールサンプルを取得します。次に、1ミリモルのフェニルメチルスエンフッ化物を含む2ミリリットルのPBSを粉砕した葉質に加え、葉質の大部分が懸濁するまで混合します。抽出物を15, 000GSで摂氏4度で20分間遠心分離します。

次いで、ペレットを廃棄し、Sナチンを含むタンパク質を摂氏55度で10分間インキュベートすることにより、部分的に精製したTR細胞5Aを、さらに室温で10分間休ませる。次に、SNATを15, 000 GSで室温で10分間遠心分離します。ペレットを捨てて、スナットを含むタンパク質を全員に使用します。

さらなるアッセイ。また、浸潤していない植物の部分精製プロセスを実行して、コントロールサンプルを取得します。この手順では、エチルセルロースと水を混合して1.5%溶液を取得し、溶解するまで攪拌しながらインキュベー

A-C-M-C-S-D-Sページゲルを作製するには、10ミリリットルのSDSページゲル混合溶液中の1ミリリットルの水に1.5%CMCの1ミリリットルを置き換え、次にゲルを通常どおり注ぎます次に、SDSの存在下でサンプルを沸騰させて変性させます。染料の前面がゲルの底に達するまで、200ボルトで50分間電気泳動を行います。次に、15%C-M-C-S-D-Sページゲルのポイントでゲルタンパク質のリフォールディングを行います。

pH 6.5 の 20 ミリモルリン酸クエン酸緩衝液に 1.5% ベータ シクロデキストリンを使用。この溶液でゲルを室温で15分間穏やかに振とうしながらインキュベートします。βシクロデキストリン溶液を廃棄し、pH 4.8の50ミリモル酢酸ナトリウム緩衝液中で室温でインキュベートした水でゲルをさらに15分間短時間洗浄します。

次に、リフォールディングポイント15%C-M-C-S-D-Sページゲルを使用して、ゲルを30ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液で摂氏50度で20分間インキュベートすることにより、CMC zyを実行します。CMCが分解した場所を視覚化するには、0.1%コンゴレッド溶液を使用してゲルを10分間染色し、1モル塩化ナトリウムを使用して30分間、または最後に透明なバンドが観察されるまでゲルを静置し、ゲルを0.3%酢酸で洗浄します。アッセイを実行する直前に、より鮮明なイメージングを行うには、4つのMUC 2 Xワーキング溶液を4つのMUCワーキング溶液100マイクロリットルで96ウェルプレートの別々のウェルに調製します。

次に、各サンプルの100マイクロリットルを適切なウェルに加え、360ナノメートルの励起波長と465ナノメートルの発光波長を使用して各サンプルを三重に実行します。蛍光分光法により、4μの蛍光の0分時点を決定します。次に、接着蓋で覆われたプレートを摂氏50度で20分間インキュベートします。

その後、凍結して反応を止めます。その後、ゼロ分時点と同じパラメータを使用してエンドポイントmu蛍光を測定します。20分後の蛍光値から0分時点の蛍光値を差し引くと、アッセイを実行する直前の酵素活性による蛍光の変化を判定できます。

A-O-C-M-C two Xワーキングソリューションを準備します。次に、50マイクロリットルのサンプルと50マイクロリットルの作業溶液を1.5ミリリットルのチューブに組み合わせます。次に、サンプルを摂氏50度で20分間インキュベートします。

250マイクロリットルの沈殿液を加えて反応を停止します。その後、各サンプルを10秒間激しくボルテックスして、サンプルと沈殿溶液が完全に混合されるようにします。次に、サンプルを室温で10分間インキュベートし、再度ボルテックスしてから、1000 Gで10分間遠心分離します。

その後、各サンプルから200マイクロリットルのSNATを邪魔することなく96ウェルプレートに移します。ペレットの酵素活性は、より高いレベルの可溶化染料によって示されます。これを590ナノメートルの波長で吸収性分光法を使用して測定します。

この手順では。濾紙の円を1.5ミリリットルまたは2ミリリットルのチューブに入れます。100マイクロリットルの60ミリモル酢酸ナトリウムと100マイクロリットルのサンプルを濾紙サークルに加え、摂氏50度で20時間インキュベートし、300RPMを振とうします。

さらに、アッセイを実行する直前に、コントロールとしてろ紙を使用せずに個々のサンプルをインキュベートします。1 ミリリットルの PBA 溶液 A と 9 ミリリットルの PABA 溶液 B.Store を含む 1.5 x PABA ワーキング溶液を調製し、使用するまで氷上に置きます。次に、0.5ミリリットルの熱安定性チューブにサンプルを調製します。

サンプルは、45マイクロリットルの水、濾紙でインキュベートされた各溶液の5マイクロリットル、および100マイクロリットルのPABA作業溶液で構成されています。その後、サンプルコントロールと5つの標準試料を同じ方法で実行します。次に、サンプル、コントロール、標準試料を摂氏100度で正確に10分間インキュベートし、さらに室温で10分間冷却します。

溶液の100マイクロリットルを96ウェルプレートにピペットで固定し、波長410ナノメートルの分光光度計でアッセイを行います。濾紙のサンプル値から個々のサンプル制御値を差し引いて、放出される還元糖の量を決定します。これは、タバコ植物の発現カセットとタンパク質発現を示す画像です。

これは、浸透したタバコの葉が通常の光の下で、赤色のフィルターを使用して緑色の光の下で現れる方法であり、ここでは赤色で示されるTRセル5:00 AMチェリーの発現がここではっきりと見えます。T細胞5A.Theの総可溶性タンパク質のサイズと活性を示すSDSページゲルウェスタンロットとCMC zyは分離されており、T細胞5Aのヒストタグ領域に対するクマシブルー染色ウェスタンブロッティングでそれらを視覚化できますタンパク質サイズを確認し、さらにCMCに対するセルラーゼ活性はコンゴレッドで染色された異種移植片によって示されます。ここで見ることができるのは、TR細胞5Aが温度沈殿精製の前後に一時的に発現したタバコ植物の葉からの総可溶性タンパク質であり、TR細胞5Aは最大の可視バンドであり、ウェスタンロットとCMCのigraphでも見ることができます。

また、Tcell five Aが熱沈殿後にもなかったタバコ植物からの総可溶性タンパク質と、市販のトレサセルラーゼの混合物からのタンパク質も見られます。この図は、TR細胞5Aの酵素活性定量化を示しており、TR細胞5Aを4MUCアゾCMCまたは濾紙でインキュベートし、アゾ色素のフルオロ44μの放出により基質分解を測定したか、PBAの色変化から還元糖を定量することにより、この手順に続いて測定した。タンパク質ターゲティングなどの他の方法を使用して、タンパク質の局在化が酵素の安定性と活性にどのように影響するかについての追加情報を提供できます。

このビデオをご覧になった方で、タンパク質を一過性にタバコに発現させる方法について明確に理解し、酵素活性を評価する方法についても十分な知識を得ているはずです。フォロセルロースバイオマス変換。