ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

次の実験の全体的な目標は、植物の葉におけるタンパク質の一過性発現の予測モデルを生成することです。これは、一過性発現の最も重要なパラメータを特定し、それらがタンパク質蓄積に与える影響を定量化するための実験デザインを設定することで達成されます。第2のステップとして、遺伝子をクローニングしてアグロバクテリアに導入し、葉に注入して一過性のタンパク質発現を引き起こします。

次に、タンパク質の発現レベルを決定するために、葉のサンプルを分析します。実験モデル評価のデザインに基づいて、さまざまな年齢の葉やさまざまなインキュベーション条件での一過性タンパク質発現レベルのパターンを示す結果が得られます。この手法の主な利点は、一度に1つの因子のような既存の方法と比較して、葉の年齢や位置別の葉などの異なるパラメータ間の相互作用を検出して定量化できることです。

実験の結果に対する特定の要因の影響を特徴付けるためによく使用される「一度に1つの要素」のアプローチは、実験中の個々の実行が弦の真珠のように整列し、設計空間のカバレッジが低くなるため、最適ではありません。DOE戦略の実験計画法とは対照的に、一度に複数の因子を変動させると、結果として得られるモデルの適用範囲が向上し、精度が向上します。さらに、一度に 1 つの要素で偏った設計空間カバレッジ。

また、実験では最適な操作領域を特定できず、最適でない解決策を予測できないこともありますが、DOE戦略では望ましい条件を特定できる可能性が高くなります。このフローチャートは、DOE 戦略を計画するプロセスを示しています。最初のステップは、デザインに含めるための関連要因と応答を特定することです。

本実証では、モデル抗HIVモノクローナル抗体2種、G12、蛍光マーカー、プロテインDSレッドの発現レベルを、既往実験に基づいて測定します。関連性があると見なされる最小検出可能な差は、2つのG 12の場合は10マイクログラム/ミリリットル、DSレッドの場合は20マイクログラム/ミリリットルです。さらに、2つのG 12とDS redのシステムの推定標準偏差の近似値は、それぞれミリリットルあたり4マイクログラムと8マイクログラムになります。

この DOE 戦略を計画するための残りの手順についてはここでは説明しませんが、詳細は添付の原稿に記載されています。2つのG 12とDS redは、タバコ植物で一過性に発現します。植物栽培の手順を開始するには、10 x 10 x 8センチメートルの岩壁ブロックを脱イオン水で広範囲に点滅させて準備し、残留化学物質を除去します。

その後、各岩壁ブロックに1〜2個のタバコの種子を配置し、続いて肥料で短時間フラッシュすることにより、肥料種子タバコ植物の新たに調製した溶液でブロックを平衡化します。種子を洗い流さないように注意し、適切な条件下で温室で42日間発芽させて栽培します。培養物をOD 600ナノメートルの5.0に成長させることにより、AUM FASSを調製します。

培養物を水と2倍の浸潤培地で希釈し、注入前に注入に必要なOD600ナノメートルに一致させます。fasion懸濁液のatumのOD 600ナノメートルを確認して、注射用の葉を準備します。ピペットチップで注射部位の表皮を優しく引っ掻き、AUM Fasion溶液の流入を促進します。.

その際、葉身が破裂しないようにしてください。AUMファシオン懸濁液を含むシリンジを葉身に対して垂直に保持し、バレルを治療する肋間野に接触させ、出口を葉の底側にそっと押し込みます。.同時に、葉の上面を軽く押して、葉身がずれたり破れたりしないようにします。

シリンジピストンをそっと押し下げます。AUMファッションソリューションは、処理された領域がより暗く、緑色で、しっとりと見えることによって示されるように、葉身内の細胞間空間に入ります。注射中は、シリンジが葉に対して垂直に保たれていることを確認してください。.

そうしないと、細菌懸濁液が高圧下で拍車がかかる可能性があります。肋間野全体にオウム、オウム、ファスが浸透するまで、この手順をいくつかの位置で繰り返します。次に、注射後に次の肋間場に進み、インキュベーション期間が完了したら、DOEによって決定された条件下で植物をインキュベートします。

サンプリングを開始します。ハンドヘルドペーパータオルで葉を安定させ、コルクの借り手を使用して、DOEが示した位置と時間に処理された肋間フィールドから4〜5枚の葉ディスクを取り外します。サンプリング中に植物から葉全体を取り除かないでください。

各サンプルの質量を決定し、サンプル名と質量でラベル付けされた1.5ミリリットルのプラスチック反応チューブに入れます。タンパク質定量の前に、サンプルをマイナス20°Cまたはマイナス80°Cで保存してください。このプロセスは、サンプルの安定性とリーフディスクサンプルからタンパク質を抽出するための保存温度に応じて、この段階で数か月間一時停止する場合があります。

サンプル質量1ミリグラムあたり3ミリリットルの抽出バッファーを加え、大きな破片が残らなくなるまで電気乳棒を使用して反応チューブ内でリーフディスクを粉砕します。サンプルの過熱を防ぐため、遠心分離後にチューブが暖かく感じるときはいつでもチューブを氷の上に置きます。分散した固形物を除去するには、上清をきれいな1.5mm反応チューブに移します。

DS赤色蛍光を2回連続して測定します。96のよく遊んだリーダーで、各サンプルに530個の25ナノメートル励起フィルターと590個の35ナノメートル発光フィルターが取り付けられています。2 回の読み取りと 3 回のテクニカルレプリケートで蛍光を平均化し、ミリリットルあたり DS 赤 0 マイクログラムを含むブランク コントロールで記録された値を減算します。

また、標準希釈線のリードからこの値を減算し、これらの空白補正値を線形回帰に使用して参照曲線を生成します。次に、参照曲線の傾きを使用して、サンプルで測定された蛍光をDSの赤色濃度に変換します。2つのG 12抗体の濃度を決定する手順はここでは示されていませんが、添付の原稿に詳述されています。

Design Expertソフトウェアは、解析ノードでのデータ分析と評価に使用されます。分析する応答を選択し、最初に変換タブでなしを選択します。「適合サマリー」タブに進むと、調査対象のシステムにとって重要な因子に関する一般情報が表示されます。

ソフトウェアは、モデルタブでの重要性に基づいて初期モデルを提案します。初期モデルは、フィットサマリー結果に基づいて事前に選択されます。自動モードを使用して、Innovaタブでこのモデルを編集します。

必要に応じて、推奨モデルと含まれる因子を調査します。P 値が事前定義されたしきい値を超える因子や、機構的な考慮事項に基づいて低い因子を手動で削除するには、モデル タブに戻り、選択を手動に変更して、モデルから適切な因子を削除します。[診断] タブに進み、モデルの品質を確認し、モデルに強い影響を与えるデータセット内の潜在的な外れ値を検出します。

診断ツールのすべてのタブを調べて、ボックスCoxプロットで提案されている場合は[according tab]で変換タイプを調整し、[model graphs]タブで解析手順を再開します。評価されたモデルを、3つなどの限られた数の数値因子で視覚化します。応答曲面表現は、最適な特性を評価するのに役立ちます。

手動応答サーフェスは、調査中の応答に対する 2 つの要因の影響のみを示しています。応答に対する追加の因子の影響は、因子ツールウィンドウでその値または水準を変更することによって明らかになります。または、因子ツールウィンドウで因子を右クリックし、目的の独立変数軸を選択することで、因子をプロット軸に割り当てることもできます。

因子レベルを操作し、因子ツールを使用してグラフ座標に割り当てます。[ファイル] タブの [グラフをファイルにエクスポート] コマンドを使用してグラフをエクスポートします。最適化ノードの数値サブノードを使用して、モデル因子に応じて目的の応答を数値的に最適化し、基準タブで特定の制約を適用できます。

「criteria」タブで提供された入力に基づいて、「solutions」タブで数値解を計算して調べます。これらの解をスプレッドシートなどの他のソフトウェアにエクスポートして、高応答値または低応答値に関連付けられた因子設定を明らかにするための詳細な分析を行います。これは、3つ以上の数値因子を調査し、この代表的な研究では3D表現が難しい場合に役立ちます。

DOE戦略を用いて、dsの一過性発現に対する異なるプロモーターと5つのプライムRSの効果を調べました。この表には、過渡式モデルに含まれる赤色の係数と調査対象の範囲が示されています。太字の係数は、この実験に固有のものです。

イタリック体の係数は、後で説明する別の実験のためのものです。すべての離散的な数値因子に対して、少なくとも 3 つの水準が選択され、二次基本モデルの計算が可能になりました。DOE実行の選択には、回帰モデルの係数の最も正確な推定値を取得するための最適な選択アルゴリズムが選択されました。

設計の専門家が最初に提案した設計は 90 回の実行で構成されていましたが、FDS は予測の 1% 標準誤差を達成するには不十分でした。デザインを合計 210 回まで最適に拡張すると、この問題が解決され、フラット カーブで示されるデザイン空間全体で FDS が 100% になり、フラット カーブで示されるデザイン空間全体で予測精度が均一になり、210 回すべてのランで DS の赤濃度が決定され、データがログ 10 に変換されました。モデル因子は、α レベルが 0.100 の 3 次モデルから自動的に後方選択することによって選択されました。

これにより、適合度が有意でなく、多重相関係数の値が高い有意なモデルが得られました。すべてのモデル因子のP値は0.05未満であったため、モデルを手動で操作する必要はありませんでした。このモデルには、太字で強調表示された 3 つの因子交互作用が含まれていましたが、これらは FDS グラフの初期の 2 次基本モデルの再評価の一部ではありませんでした。

最終予測モデルに含まれるすべての因子を使用したところ、予測の標準誤差のFDSは、追加の3因子交互作用を含めることによって有意に減少していないことが明らかになりました。Design Expert のモデル品質診断ツールは、残差の正規プロットが線形動作を示し、残差対予測プロットで特定のパターンが観察されなかったため、データ変換が有用であり、モデルに欠損係数がないことを示しました。また、実験の過程では、隠れた時間従属変数を示す傾向はありませんでした。

それどころか、モデルの予測は、すべての点が対角線の近くにあるため、観測されたディアス赤色蛍光と非常によく一致していました。したがって、選択したモデルは、8日間続く浸潤後のインキュベーション期間中に、異なるプロモーター5プライムUTRの組み合わせによって導出された非鉛系タバコ葉におけるDS redの過渡発現を予測するのに役立つと仮定され、データ変換を伴わない人工線形回帰モデルも選択されました間違った因子選択と変換の結果を説明するために。ここで明確に見られるように、残差の正規プロットは予想される線形動作から逸脱しており、残差対予測プロットにはランダムな散布図ではなく V 字型のパターンがあります。

さらに、残差対実行プロットでは、2つの極値が強調表示されます。対角線から逸脱した小さい値と大きい値の両方について予測が不十分でしたが、タバコの葉の過渡的なDS赤発現の最適なモデル応答曲面を以下に示します。このモデルは、葉の年齢が有意な要因であり、古い葉の発現レベルが低いこと、たとえば、プロットAとプロットBの葉2は、プロットCとプロットDの葉6などの若い葉と比較して、葉のDS赤の蓄積の進行は線形でも指数関数的でもなく、浸潤後のインキュベーションの8日間でシグモイド曲線をたどりました。

CAMV 35 SSプロモーターとの5つのプライムUTRの組み合わせは、NOSプロモーターとの組み合わせよりも強いDSレッド発現をもたらしました。TLとCHSの比較からわかるように、5プライムUTRもDSの右発現に有意な影響を与えたが、発現強度は随伴するプロモーターに依存していた。また、この予測モデルでは、nas CHSやCAMV 35 SS CHSなどのプロモーター5プライムUTRの組み合わせの特定のペアが、すべての葉で定義された比率と2日を超えるインキュベーション時間から30%未満のバランスの取れた発現レベルをもたらしたことを示しました。

このようなバランスの取れた発現は、定義された化学量論を持つ多量体タンパク質の発現に有用です。DOEアプローチは、タバコ中の2つのG 12およびDS redの同時生産のためのインキュベーション条件と収穫スキームを最適化するためにも使用されました。この実験に含まれた一過性発現に影響を与える要因は、600ナノメートルのイタリック体とインキュベーション時間です。

異なる年齢の植物における各タンパク質の発現について、予測モデルが確立されました。若葉は播種後40日で収穫されました 古い葉は播種後47日で収穫されました。次に、これら4つのモデルが評価され、個々のモデルで有意であることが判明した各因子を含むコンセンサスモデルが確立されました。

その後、コンセンサスモデルがすべての初期データセットを依然として適切に表現していることが確認されました。その後、コンセンサスモデルを使用して、両方のタンパク質の最適なインキュベーション温度と細菌OD600ナノメートルを特定し、若い植物と古い植物のすべての葉と葉の位置のタンパク質濃度を予測しました。濃度プロファイルとバイオマスデータの統合により、絶対タンパク質収量が得られました。

次に、タンパク質の絶対量を関連する下流のコストと相関させ、植物齢ごとの各葉の処理の費用便益分析を可能にしました。若い植物では、古い植物と比較して、同じ量のDS redと2つのG 12の約65%が見つかりましたが、平均バイオマスが約50%低いにもかかわらず、若い植物の比タンパク質発現が高いことを反映しています。その結果、若い植物は、古い植物に比べて全体的なバイオマスが低いにもかかわらず、短い成長期間でタンパク質が高濃度に達するため、一過性発現に有利であることが明らかになりました。

最後に、古い植物の葉をすべて処理することは、1〜3の葉を捨ててバッチあたりの植物の数を増やすよりも費用がかかることもわかりました。したがって、DOEベースのモデルは、実験の最終ステップをマークするだけでなく、プロセス分析のより複雑な側面を容易にするために他のデータと組み合わせるのにも適しています。このビデオを見れば、植物の一過性タンパク質発現を調査するための A DOE の設定方法と分析方法について十分に理解できるはずです。