マウスにおけるタキサンの薬物動態学的および薬力学的分析のための頸動脈煎茶

この手順の全体的な目標は、頸動脈を介して目的の薬物を注入して、薬物の薬物動態プロファイルを分析することです。これは、最初にポリエチレンチューブからカスタムカテーテルを作成し、次にカテーテルをマウス頸動脈内に固定することによって達成されます。次に、マウスを頸動脈カテーテルを介して自動輸液ポンプに取り付けます。

最終ステップでは、薬物を一定の速度でマウスに注入し、血液サンプルを一定の間隔で収集します。最終的に、液体クロマトグラフィー、質量分析法を使用して、組織および血漿サンプル内の薬物の濃度を決定します。ボーラス注射、腹腔内注射、尾静脈注射、頸静脈注入などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、臨床注入率を代表することと、一般的に頸静脈挿入よりも簡単に実行できることです。

この方法は、薬物のin vivo分布など、薬理学における重要な質問に答えたり、阻害剤やモジュレーターがタンパク質の機能に影響を与えるかどうかを判断したりすることができます。実験用のカテーテルを準備するには、まず、ブンゼンバーナーに低い定常炎を確立します。次に、チューブを炎の近くに保持して、ポリエチレンを柔らかくします。

チューブが溶け始めたら、両端をゆっくりと引き離して、直径約0.25mmのチューブの細い部分を作成します。次に、細い部分に沿って約0.75センチメートルのところにチューブの斜めの端を切り取り、その端を炎にすばやく通すと、わずかに丸みを帯びて拡大します。先端がわずかに後ろに引っ掛かるため、動脈への挿入中にチューブを固定するのに役立ちます。

チューブが細くなり始めた点から6.0センチメートルのところでチューブを切断してカテーテルを作り、次に鈍い針を装備した注射器に200マイクロリットルのヘパリン溶液を充填します。針をカテーテルの幅の広い方の端に挿入し、カテーテルにヘパリンを充填します。気泡が出ないように注意してください。

次に、針とカテーテルを無菌場所に保管して、頸動脈を分離します。動物の首の正中線の少し右側に1センチの縦方向の切り込みを入れることから始め、次に鉗子を使用して脂肪と筋肉を分離し、気管を露出させます。頸動脈は気管と平行に走っています。

次に、動脈を覆っている筋膜を慎重に分離し、VA神経を軽く脇に引っ張ります。頸動脈とVA神経の間の空間に鉗子を挿入し、鉗子をそっと開いて顔面に隙間を作ります。神経を動脈から慎重に引き離し、喉頭近くの前端のフォークから最も露出した後端までのスペースを空け、少なくとも3ミリメートルの長さの動脈を隔離します。

次に、鉗子を使用して動脈の下に絹の縫合糸を引き、安全な結び目を結び、動脈を前端に向かってできるだけ閉じます。2本目の糸を配置した後、引き込み式の結び目を結び、動脈をできるだけ後端に向かって一時的に閉じます。次に、3本目の糸を使用して、最初の2つの縫合糸の間に非常に緩い結び目を結び、留置後にカテーテルをすばやく固定するために使用されます。

カテーテルを挿入するには、下部の縫合糸の結び目をつかんで動脈を少しピンと張った状態に引っ張ります。次に、上と前部縫合糸のすぐ近くで動脈に切り込みを入れます。深く切りすぎないように注意してください。

スリットをチェックして、開口部が塞がれていないことを確認します。ヘパリン充填カテーテルをシリンジ針から取り外し、大きな空気のポケットを作らないように注意してください。両端で、カテーテルを操作して、斜めの端を下向きに、利き手に向かって少し快適な角度に配置します。

次に、縫合糸をつかんだまま、動脈を少しピンと張った状態に保つために、カテーテルをスリットにそっと挿入します。次に、鉗子を使用して前縫合糸の結び目をつかみ、カテーテルの上に動脈をそっと引き下げます。カテーテルと前部縫合糸を慎重に解放します。

次に、中央の結び目を締めて、カテーテルを動脈へのカテーテルの入り口の近くに固定し、カテーテルを通る流れを妨げないように注意します。中央の縫合糸でタイトなトリプルノットを作り、次に前方縫合糸を使用してカテーテルを動脈の入り口の下の所定の位置に固定します。次に、コネクタプラグを使用して生理食塩水リードをカテーテルに取り付け、気泡が発生しないように注意します。

次に、後部縫合糸の端をつかみ、そっと引っ張って結び目を緩め、糸を抜かずに縫合糸を動脈からカテーテルの端まで操作します。血液は、流れが妨げられていないように見えるときにカテーテルに流れ込むはずです。後部縫合糸の糸を使用して、中央縫合糸の少し上に追加の結び目を結びます。

次に、カテーテルから血液を洗い流し、止血剤を使用してカテーテルの端をコネクタプラグの近くにクランプします。コネクタをポートプラグに交換して、カテーテルの端を密閉し、止血剤を取り外します。次に、1組の鉗子を使用してカテーテルを前部縫合糸のすぐ下に保持し、別の鉗子を使用してカテーテルにねじれを押し込み、2番目のねじれを作成した後にカテーテルが横に曲がりやすくします。

同様に、マウスを左側に向け、70%エタノールとポビドンヨウ素で動物の耳の下とすぐ後ろの領域を掃除します。その領域が消毒されたら、皮膚に小さな4ミリメートルの切開を行います。次に、鉗子を使用して組織のフラップを開いたままにし、皮膚の下に鈍い中空プローブを作動させて、頬から首の空洞までのチャネルを作成します。

鉗子を使用して、プローブが出るスペースを慎重に空けてから、ポートプラグとカテーテルをプローブから出口穴にそっと通します。動物が30〜60分間回復した後、血管や臓器を押しつぶしたり収縮させたりしないように注意しながら、40センチメートルのポリエチレンチューブの一方の端に鈍い針を取り付け、もう一方の端にコネクタポートを取り付けます。次に、目的の薬物を既知の内径の注射器に引き込みます。

針をシリンジに取り付け、針とチューブを通して薬物をロードします。シリンジをポンプに配置した後、製造元の指示に従って、薬剤がコネクタからスムーズに流れるようにポンプをプライミングします。次に、プラグを差し込んで動物をポンプに接続し、マウスをしっかりと保持し、止血器を使用してカテーテルをポートプラグの近くにクランプします。

最後に、プラグをシリンジとチューブに取り付けられたコネクタと交換します。カテーテルの容積をクリアするために高速ポンプを迅速に投与し、その後すぐに目的の注入速度に切り替えます。この最初の図では、頸静脈注入後と頸動脈注入後のパクリタキセルの血漿濃度の比較が示されています。

薬物濃度は、最初の大量注入後最初の15分間で急速に低下し、次の150分で横ばいになります。それに比べて、注入が不十分な場合のパクリタキセルレベルは比較的低く始まり、アッセイ全体を通して上下に変動しますが、これはおそらく注入の初期のラインの閉塞が原因です。ここでは、3時間の注入の終わりにおける肝臓、脳、および血漿中のパクリタキセルの相対レベルが示されている 予想通り、動物は、脳組織中の低濃度の薬物と相まって、高い血漿タンパク質結合を示す 一度習得すると、この技術は適切に実施されれば45〜60分かかるはずである。

ビデオを見た後、頸動脈を分離する方法、カテーテルを挿入する方法、および注入を行う方法についてよく理解しているはずです。