正常および疾患米国でフィブリンクロット構造を調べるための実験とイメージング技術

この手順の全体的な目標は、糖尿病や鎌状赤血球貧血、シミュレートされた糖尿病性血栓の病状で発生する異常な血栓構造の形態学的違いを調べることです。これは、鎌状赤血球患者の血液サンプルを共焦点顕微鏡で糖化した血餅構造をイメージングすることで達成されます。赤血球を含むフィブリン血栓は、リアルタイムで共焦点に画像化されます。

その後、顕微鏡分析を実施して、正常および糖化血餅構造の線維素溶解速度を評価できます。最終的に、このリアルタイム解析を使用して、異常な血餅構造に発生する形態学的差異を、それらが発生する病状に応じて評価することができます。この方法は、糖尿病や鎌状赤血球症の患者でフィブリン血栓の構造がどのように異なるかなど、血栓症と止血の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

共焦点顕微鏡法でシミュレートされた糖尿病性血栓を評価するには、まず、ヒトフィブリノーゲンを解凍し、10%蛍光標識したヒトフィブリノーゲンコンジュゲートを摂氏37度でデフロストし、温めた溶液をヒトフィブリノーゲンとフィブリノーゲンコンジュゲートをグルコーストリクス塩化ナトリウム溶液中で混合し、光から保護された溶液を摂氏37度の水浴で48時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに近づいたら、非液体ベースの接着剤を使用してガラス顕微鏡スライドの両面に薄い接着剤を貼り付けてチャンバーを作成し、次に室温係数13およびトロンビンを含むフィブリノーゲン溶液を混合して最終容量50マイクロリットルにし、すぐに30マイクロリットルのフィブリン溶液を顕微鏡スライドチャンバーに移します。次に、接着剤の上に厚さ15mmの点を持つ22 x 22ミリメートルのガラスカバースリップを置き、接着剤が血栓と相互作用しないように注意しながら、チャンバーの開いた側面を透明な接着剤で密封します。

フィブリンの塊を摂氏21〜23度で2時間重合させます。次に、40 x 対物レンズと 488 ナノメートルのアルゴンレーザーを使用して血鎤の共焦点顕微鏡画像を取得し、鎌状赤血球患者の血栓を評価します。まず、赤血球サンプルを無血清細胞培養培地で1ミリリットルあたり100万細胞で希釈し、穏やかなピペッティングにより、5マイクロリットルの適切な細胞標識溶液と細胞を混合します。

摂氏37度で20分後、細胞が遠心分離機にある間に、細胞を摂氏37度培地で3回洗浄し、新たに調製したフィブリノーゲン溶液第13因子とトロンビンをちょうど示したように混合します。次に、標識した赤血球10マイクロリットルをフィブリン溶液に移し、すぐに細胞溶液30マイクロリットルを接着チャンバーに分注します。ガラス顕微鏡スライド上で、2時間後にフィブリンを摂氏21〜23度で重合させ、波長488ナノメートルと633ナノメートルの励起レーザーを使用して血栓の共焦点画像を取得し、蛍光標識されたフィブリンと赤血球をそれぞれ励起します。

線維素溶解速度と糖化血餅構造を評価するには、今回示したように、まず糖化血餅を調製します。ただし、フィブリン凝固溶液を接着チャンバーに分注した後は、チャンバーの端をシールしないでください。代わりに、脱水症を防ぐために、250ミリリットルの水を含む密閉されたエンクロージャー内で血栓を摂氏21〜23度で重合させます。

1時間半後、示したように共焦点顕微鏡で血栓の画像を取得します。次に、25マイクロリットルのプラスミンをチャンバーの開放端にピペットで移し、毛細管現象によりプラスミンが血栓全体に分散するのを待ちます。最後に、共焦点顕微鏡ソフトウェアの時系列機能を開き、取得モードをクリックして時系列を選択します。

次に、サイクル数と記録時間間隔を選択して、プラスミン誘発血餅溶解のリアルタイムビデオ映像をキャプチャすると、正常血栓と糖化血栓の解析により、血栓重合中に因子13を添加した場合と添加しない場合の両方で、糖化血栓は正常血栓よりも密度が高く、細孔が小さいことが明らかになりました。実際、国連の糖化血栓では、フィブリン濃度が低く、フィブリン濃度が高い糖化血栓で観察される構造よりも密度の低い構造を作り出します。鎌状赤血球症患者のフィブリン血栓には赤血球が含まれており、これらの個人のフィブリノーゲン濃度が高いため、健康なフィブリン血栓よりも密度の高い構造を示します。

さらに、鎌状赤血球患者由来の赤血球は、フィブリンネットワークに織り込まれる赤血球の塊である凝集体と性別を形成する自然な傾向により、正常な患者で観察されるものとは形態が著しく異なる異常な血栓構造が形成されます。最後に、正常血栓と糖化血栓の線維素溶解速度の分析では、十分なプラスミンがない場合、シミュレートされた糖尿病血栓のフィブリンに対する能力が著しく損なわれていることが示されています。この研究は、血栓症と止血の分野の研究者、特に鎌状赤血球症と糖尿病の結果として併存する病状を発症する患者に道を開くのに役立ちます。