マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

本手順の全体的な目的は、マウス新生児から皮質ミクログリアを単離することです。まず、マウス新生児から皮質脳組織をマイクロダイセクションで切り出し、次に、混合グリア細胞培養をin vitroで17～21日間育成することでこれを達成します。

次に、これらの混合グリア培養物からミクログリアを単離します。最後のステップは、さらなる実験のためにミクログリア細胞を細胞培養プレートに播種することです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察およびELISAを用いて、この単離プロトコルがミクログリアの免疫表現型と機能を保持していることを示します。

マイクロマイクロダイセクション（微細切除）に含まれるSEP（髄膜剥離）は実施が困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。この手順を成功させるには、速度と精度の両方が求められます。具体的には、操作が遅すぎると細胞の回収率が低下し、一方で髄膜の除去が不十分であると、グリア細胞の培養系が汚染され、グリア細胞の増殖が妨げられることになります。

まず、以下にMCMと表記するミクログリア完全培地を調製します。仔マウス1匹につき1フラスコ分を調製し、少なくとも1時間インキュベートします。この平衡化ステップが成功のために不可欠です。

次に、分注液を調製し、氷上で冷却します。必要な培地として、蛹1匹あたり6 mLのMCMを分注し、解剖前に37 °Cの恒温水槽で温めておきます。水平気流ワークステーションと解剖用顕微鏡を70%エタノールで拭き上げます。

次に、処置に必要な滅菌済みの手術器具を作業エリアに配置します。頭部を回収するための解剖用培地を入れた滅菌ディッシュと、解剖用のディッシュをそれぞれ準備します。脳組織を細切するための細切用培地を、専用のディッシュに分注します。

斬首および脳の摘出後、摘出したばかりの脳を解剖顕微鏡下に置き、背側を上にして乾燥した状態に保ちながら、構造を確認します。ピンセットの先端を中脳と皮質の境界に挿入し、脳を固定します。固定後、背側の皮質髄膜を完全に除去します。

次に、ミクログリアの純度と収量を最大限に高めるため、腹側髄膜を除去します。すべての髄膜組織を完全に除去することが不可欠です。皮質を脳の残りの部分から分離します。

皮質の腹側または内側に残っている可能性がある皮質髄膜を、完全に取り除いてください。髄膜組織を除去した後、皮質をあらかじめ準備しておいたミンシングディッシュに入れます。クラス2生物学的安全キャビネット内で、ハサミを用いて脳組織を細かく刻みます（ミンシング）。

細切にした組織を15 mmコニカルチューブに移します。回収率を最大にするため、ハサミと細切用ディッシュの両方を、それぞれ1 mLの細切用培地で洗浄します。これらの洗浄液を回収し、細切にした組織が入った15 mLコニカルチューブに加えます。

組織懸濁液を1〜2分間静置し、刻んだ組織をチューブの底に沈殿させます。その後、沈殿した組織を乱さないように注意しながら、上清を2 mL慎重に取り除いて廃棄します。あらかじめ温めておいたMCMを3 mL、刻んだ組織に加えた後、組織を激しくトリチュレーション（pipetting）します。

トリエーション完了時に、識別可能な固形組織が残っていないことを確認してください。同じピペットチップを使用してMCMをさらに 3 mL加え、チップに残っている微細化した試料を回収します。回収後、細断した組織を遠心分離して細胞をペレット化します。

完了後、ペレット化した細胞を生物安全キャビネットに戻します。上清を慎重に取り除き、廃棄してください。静かに再懸濁します。

細胞ペレットを2 mLの温めたMCMで懸濁し、その後、細胞再懸濁液をあらかじめ準備したフラスコに加えます。細胞を24時間インキュベートします。24時間後、フラスコを手掌で軽く叩き、組織残渣を分散させます。

タッピングの前後に細胞を確認し、デブリが完全に除去されていることを確かめます。次に、培地を新鮮なMCMに交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。毎日細胞を確認し、増殖とコンタミネーションを監視してください。

約17～21日後、ミクログリア細胞を回収できる状態になります。細胞の準備が整ったかを確認するには、倒立相差顕微鏡で観察してください。コンフルエンシーが約40%に達し、小さな光輝する球状の細胞が単層状に重なって増殖していれば、ミクログリアの回収が可能です。

ミクログリアを単離するため、フラスコを実験台に強く叩きつけます。この撹拌により、ミクログリアの接着性が低い特性を利用して、他のグリア細胞から分離させることができます。フラスコのキャップをパラフィルムで密閉し、温度制御された非加湿回転シェーカーを用いて、混合グリア培養物を5時間回転させます。

この時間が経過した後、ミクログリアがフラスコの表面から剥離したことを目視で確認します。倒立位相差顕微鏡で見ると、ミクログリアは明るく球形の浮遊細胞として観察されます。フラスコの底面には、アストロサイトとオリゴデンドロサイトの残留層が付着したままとなります。

次に、ミクログリアを含む上清を滅菌済みのコニカル遠心チューブに回収し、遠心分離します。ミクログリアのペレットを温めたミクログリア増殖培地で再懸濁し、血球計数計を用いて細胞濃度を測定します。24時間後、24ウェルプレートのプラスチック表面または滅菌済みのガラスカバースリップ上に細胞を播種します。

浮遊細胞およびデブリを除去するため、培地を新鮮で温めたMGMに交換します。このステップは細胞の生存およびミクログリアの静止状態を維持するために不可欠であり、この再給餌ステップの直後に、ミクログリアの純度を評価するための実験が可能です。GFPを内因的に発現するミクログリア由来の細胞培養物を、マクロファージ抗原であるIBA oneで染色し、DAPIで対比染色しました。

細胞核を可視化した結果、95%以上の細胞においてGFP-IBA1とDAPIの共局在が認められた。LPSによる刺激後、ミクログリアは小型の分枝状表現型からアメーバ状の形態へと劇的な形態変化を示した。p65の免疫組織化学染色により、通常条件下ではp65が細胞質全体にびまん性に局在していることが確認された。

一方、Pam P 65に2時間曝露した後、免疫反応性は細胞核へと劇的に移行し、単離されたミクログリアが生物化学的な免疫機能を有していることが確認されました。また、PAMまたはLPSへの曝露後、炎症性サイトカインTNF alphaの分泌量を測定しました。このビデオを視聴することで、最良の結果を得るための新生マウスからの皮質ミクログリアの単離方法について十分に理解できるはずです。

無菌操作を維持し、切出した皮質領域から髄膜組織を完全に除去することが重要です。