家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

次の実験の全体的な目標は、機械的なDNA均質化とPCR阻害剤の除去を組み合わせた新しいDNA抽出技術を開発すること、および家禽生産連続体に沿った環境サンプルへのゴールドスタンダードおよび体細胞抽出法を開発することです。これは、まず環境サンプルをビーズの混合物を含むマイクロ遠心チューブに分割し、複雑な環境サンプルを効果的に均質化することによって達成されます。2番目のステップは、チューブを高出力ホモジナイザーに配置して、細菌細胞と環境マトリックスから核酸を効率的に放出することです。

次に、ホモジネートは、PCR阻害結合段階を通じて、ゴールドスタンダードの酵素的DNA抽出法の出発物質として使用されます。最後のステップは、サンプルをDNA抽出ロボットワークステーションに配置して、抽出されたDNAサンプルをユーザーに提供し、多くのダウンストリームアプリケーション、最終的には定量的PCRおよびアルミニウムMiSeqプラットフォームを使用したマイクロバイオーム分析を使用して、この新しいハイブリッド法が、機械的または酵素的抽出法でサンプルを処理する場合と比較して、全細菌群集の定性的および定量的評価の最良の組み合わせを提供することを示すために使用されました一人。この方法は、家禽生産の連続体に沿った微生物群集の分析に関する洞察を提供しますが、同様に複雑な環境サンプルを含む豚や作物生産などの他の農業システムにも適用できます。

今日、この手順を実演するのは、私の研究室の学生であるKaitlyn Griffinです。実験を開始するには、ウォーターバスを摂氏95度に設定します。次に、0.33 グラムを 3 回繰り返して重量を量り、合計 1 グラムの室温、土壌、または糞便物質を 2 ミリリットルの溶解マトリックス ET チューブ交換手袋に分析します。

825マイクロリットルのリン酸ナトリウム緩衝液と275マイクロリットルの予備溶解溶液またはPLSをサンプルチューブに加えます。次に、チューブを14, 000Gで5分間遠心分離機に混合した後、サンプルを15秒間ボルテックスします。上清をデカントし、700マイクロリットルの緩衝液A SLを加えます。次に、チューブを5秒間ボルテックスします。

汚染を防ぐために一度に1つのチューブを開きます。次に、サンプルをFast Prep 24装置に入れる前に、コニカルチューブに総体積の10%のヘッドスペースがあることを確認します。サンプルを毎秒6メートルの速度で40秒間均質化します。

高速プレップ24とホモジナイズ後のボルテックスの違いに注意してください。サンプルを14, 000 Gで5分間遠心分離します。上清を滅菌済みの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、さらに700マイクロリットルのSLバッファーで溶解マトリックスETチューブ内の残りのサンプルに移し、再均質化して遠心分離します。

上記の設定を使用して、サンプルチューブにプラスチック製のロッククリップを配置して、サンプルチューブが飛び出して上清が摂氏95度の水浴で5分間インキュベートされないようにします。次に、各マイクロ遠心分離機チューブを開いて圧力を解放し、チューブを再び閉じ込めて15秒間ボルテックスします。サンプルを 14, 000 GS で 1 分間遠心分離します。

遠心分離後、上清1.2ミリリットルを滅菌済みの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。次に、タブを含むブリスターパックを開いているマイクロ遠心チューブの真上に置き、タブをブリスターパックからチューブにそっと押し込みます。インヒビットXタブとチューブの接触を避けるため、各サンプルにインヒビットXタブを1つずつ追加します。

次に、サンプルが均一にオフホワイトの液体に変わるまでチューブをボルテックスします。サンプルを室温で1分間インキュベートし、チューブの底に残っている粒子を避けながら、14, 000チーズで5分間遠心分離します。すべての液体を滅菌済みの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。

次に、チューブを全速力で5分間遠心分離します。自動DNA精製を開始する前に、ワークステーションに適切な量のフィルターチップとバッファーが含まれていることを確認してください。次に、ローターアダプターにエルシアンチューブとフィルターチューブを追加し、ローターアダプターの中央のスロットに各サンプルの400マイクロリットルを追加します。

ローターアダプターをワークステーション遠心分離機に置き、すべてのマイクロ遠心分離機チューブの蓋がローターアダプター内に適切に固定されていることを確認します。滅菌済みの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにプロテイナーゼK溶液を加え、ワークステーションのスロットAにセットします。ワークステーションのシェーカーセクションに2ミリリットルのセーフロックマイクロ遠心分離管を追加し、サンプルチューブの蓋がしっかりと配置されていることを確認します。

ワークステーションのタッチスクリーンを使用して、DNA便ヒト便病原体検出プロトコルを選択し、後続の画面を読み取って、ワークステーションが正しくロードされたことを確認します。すべてのチェック画面に合格したら、[開始] を選択してプロトコルを実行します。次に、サンプルをローターアダプターから取り出します。

遠心分離蒸発ベースのシステムを使用して、個々のサンプルの3つの繰り返し精製を組み合わせます。サンプルをトリスEDTAバッファーで最終容量100マイクロリットルに再溶出します。最後に、サンプルにキャップをし、下流の分析に必要になるまで摂氏マイナス20度に置きます。

このグラフは、機械的方法が、糞便およびリターサンプルの全体的に最も高い細菌正規化遺伝子存在量の推定値を一貫して提供したことを示しています。酵素法は、すべてのケースで推定値が最も低かった。新しいハイブリッド抽出法により、定性的および定量的な全細菌群集推定値の最適な組み合わせが得られました。

テストした3つの抽出方法のうち。この新しい半自動ハイブリッドDNA抽出法の実行方法をよりよく理解し、複雑な環境サンプルからの微生物群集の定性的および定量的評価におけるその有用性を確認できるはずです。