Name: 家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶ ハイブリッドDNA抽出法で家禽生産環境サンプルの細菌群集を定性的・定量的に評価する方法。機械的ホモジナイゼーションと酵素抽出を組み合わせ、複雑な環境サンプルから高品質なDNAを抽出し、微生物叢解析の精度を向上させる。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、サンプル取得の支援に対してLatoya WigginsとKatelyn Griffinに感謝し、サンプリングと分子分析におけるLaura Lee Rutherfordの支援に対しても感謝したいと思います。 また、アルゴンヌ国立研究所のSarah Owens氏にも、マイクロバイオーミクスサンプルの調製とシーケンシングについて感謝します。これらの調査は、農業研究サービス、USDA CRISプロジェクト「家禽加工システムにおける病原体削減および処理パラメータ」#6612-41420-017-00および「家禽における食品媒介病原体の特性評価のための分子的アプローチ」#6612-32000-059-00によって同様に支援されました。

環境家禽生産試料の1。機械的均質化<ol style="margin-left: 40px;"><li>抽出前に、95℃の水浴を設定し、水浴時間がその温度に到達させる。 </li><li> 2ミリリットルライジングマトリックスEチューブに土壌や糞便材料の0.33グラムを秤量。 <ol><li>これは、チューブの容量を超えるには、次の解決策の原因となりますので、チューブ内の試料の0.33グラムを超えないようにしてください。 </li><li>計量前のRTに凍結サンプルを解凍する。 </li><li>土壌/糞便1gの合計を分析するために、各個々の環境サンプルのための3レプリケート0.33グラムのサンプルを秤量。 </li><li>抽出前に円錐形の行列チューブ内の-20℃で保存サンプルは、必要に応じて。 </li></ol></li><li>サンプルチューブに825μlのリン酸ナトリウム緩衝液およびPLS溶液を275μLを加える。 〜15秒間ボルテックスを用いて混合した後、5分間14000×gでサンプルを遠心する。 </li><li> supernaをデカントTANTおよびバッファASLの700μlを添加する。 5秒間ボルテックスを用いて混ぜる。 <ol><li>ヘッドスペースは、この時点で円錐管で利用可能（〜10％の総量）があることを確認してください。ヘッドスペースがない場合には、チューブは、交差汚染および/または試料の損失につながる可能性があり、次の均質化工程中に漏れる傾向を有する。 </li></ol></li><li>ファストプレップ24インストゥルメントにサンプルを置き、40秒間6.0メートル/秒の速度でサンプルを均質化する。 </li><li> 5分間14000×gで均質化されたサンプルを遠心。無菌の2ミリリットルの微量遠心チューブに上清を移し。 </li><li>サンプルからのDNAの回収を最大にするために、繰り返し同じ滅菌2mlのマイクロ遠心チューブに上清を組み合わせ、1.4~1.6ステップ。 </li></ol>サンプルホモジネートからの阻害剤の2酵素阻害注：このプロトコルはのQIAamp DNAスツールミニキットを使用しています。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>インキュベート上清中に残った細胞からのDNAの回収を最大にするため5分間95℃の水浴中で上清。 <ol><li>ほとんどのグラム陰性菌を含む試料を、70℃でインキュベートする。グラム陽性生物（家禽糞便試料の場合である）が存在する場合は、95℃でインキュベートする。 </li><li>チューブがオープン「ポップ」と、潜在的に圧力などのサンプル量がこれらの密封されたマイクロチューブに構築することができ失わないことを保証するためにマイクロチューブ上のクリップをロックするプラスチックを使用してください。 </li></ol></li><li>圧力、再キャップマイクロチューブを解除し、15秒間ボルテックスを用いて混合する各マイクロ遠心チューブを開きます。 </li><li> 、1分間14000×gでサンプルを遠心上清の1.2ミリリットルを削除し、新たな無菌の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに入れてください。 </li><li>各サンプルに1 InhibitExタブを追加し、サンプルが均一に白/オフホワイト液体になるまでボルテックスを用いて混ぜる。 <ol><li>トンを避けるサンプルを含むマイクロ遠心チューブにそれを配置しながらInhibitExタブをouching。これを実現するために、オープンなマイクロ遠心チューブの上に直接タブを含むブリスターパックを置き、静かにブリスターパックから出て、マイクロ遠心チューブにタブを押してください。 </li></ol></li><li> 5分間14000×gでRT（〜25℃）で1分間のサンプルと遠心をインキュベートします。 </li><li> 5分間14000×gでの滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブと遠心分離機にすべての液体を転送します。 <ol><li>液体を転送する際にステップ2.5の終了時にマイクロ遠心管の底にペレット化した可能性が残っている粒子状物質を避けてください。 </li></ol></li></ol> QIAcubeロボットワークステーションを使用して3.自動DNA精製注：プラスチック消耗品の数、遠心分離機内のサンプルローター·アダプターの配置、およびバッファ/ソリューションの必要なボリュームがNUMに依存している実行されているサンプルのBER。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>ローター·アダプター内の適切なスロットに溶出チューブとフィルタチューブを追加します。各サンプルについて、ローターアダプタの中央のスロットに400μlを添加する。精製されるサンプルの数に応じて適切な配置で、ワークステーションの遠心分離機ロータアダプタを置きます。 <ol><li>そうしないと、障害が精製プロトコルの遠心分離工程のうちの1つの間にせん断につながる可能性があるので、マイクロ遠心チューブの蓋のすべてが適切にローターアダプタ内に固定されていることを確認します。 </li></ol></li><li>ワークステーションに千μLと200μlのフィルターチップの必要数を追加し、バッファの必要量と供給バッファーボトルを埋める。 注：この精製プロトコル（AL、AW1、AW2、及びAE）に必要なバッファがすべてのQIAamp DNAスツールミニキット内に含まれています。ユーザはAW府のために必要とされる100％エタノールを供給する必要がffers及び精製工程に用いられる溶液として。 </li><li>無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内に供給さプロテイナーゼK溶液の必要量を追加して、ワークステーション上のスロットAにそれを置く。また、ワークステーションのシェーカーセクションに2ミリリットル安全ロック微量サンプルチューブRBの（精製されたサンプルの数に等しい）に必要な数を加える。 <ol><li>マシンが最初に必要なすべてのプラスチックと液体が要求されたために利用可能であることを確認するためにワークステーションをスキャンするときにこれを行うには失敗がエラーになりますので、サンプル管の蓋がしっかりと、ワークステーション上の適切なスロットに配置されていることを確認してください実行。 </li></ol></li><li>ワークステーション上でタッチスクリーンを使用して、DNAスツールを選択 - 人間スツール - 病原体検出プロトコル、およびワークステーションが正しくロー​​ドされたことを確実にするために、後続の画面をお読みください。いったんすべてのチェック画面が渡され、このプロトコルを実行するために、開始を選択します。 <ol><li> 12以上のサンプルからDNAを抽出した場合は12個のサンプルの実行がワークステーション上で完了するために〜72分かかるため、サンプルの次のセットのための均質化処理（ステップ1）を開始します。 </li></ol></li><li>その後の下流の分析に必要とされるまで-20℃で、ローター·アダプターからサンプルを削除し、それらをキャップ、と場所。 <ol><li>この時点で、遠心分離/蒸発ベースのシステムを使用して個々のサンプル（合計で分析量= 1グラム）のための3の反復精製を兼ね備えています。トリスETDAバッファー100μlの最終容量に複製し、再溶出を組み合わせる。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+currently+used+commercial+DNA-extraction+methods+give+different+results+of+clostridial+and+actinobacterial+populations+derived+from+human+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+ecology%22%5BJournal%5D)">The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples.</a> FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).</li>
<li>Tang, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+isolation+of+DNA+from+pig+faeces+and+comparison+of+five+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods.</a> Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).</li>
<li>McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+methods+for+extraction+of+bacterial+DNA+from+human+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples.</a> Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).</li>
<li>Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+kits+for+PCR-DGGE+analysis+of+human+intestinal+microbial+communities+from+fecal+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens.</a> Nutrition journal. 9, 23(2010).</li>
<li>Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+method+affects+microbial+community+profiles+from+soils+and+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment.</a> Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).</li>
<li>Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+Bacterial+DNA+Extraction+from+Faecal+Samples%3A+Comparison+of+Three+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+microbiology+journal%22%5BJournal%5D)">Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods.</a> The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).</li>
<li>Claassen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+efficiency+of+five+different+commercial+DNA+extraction+kits+for+extraction+of+DNA+from+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples.</a> Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).</li>
<li>Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+methods+for+analysis+of+turkey+cecal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota.</a> Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).</li>
<li>Salonen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fecal+DNA+extraction+methods+with+phylogenetic+microarray%3A+effective+recovery+of+bacterial+and+archaeal+DNA+using+mechanical+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis.</a> Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+direct+boiling+method+with+commercial+kits+for+extracting+fecal+microbiome+DNA+by+Illumina+sequencing+of+16S+rRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags.</a> Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+extraction+and+purification+of+DNA+from+the+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome.</a> PloS one. 7, 33865(2012).</li>
<li>Qu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Metagenomics+Reveals+Host+Specific+Metavirulomes+and+Horizontal+Gene+Transfer+Elements+in+the+Chicken+Cecum+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome.</a> PloS one. 3, 2945(2008).</li>
<li>Sekelja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abrupt+temporal+fluctuations+in+the+chicken+fecal+microbiota+are+explained+by+its+gastrointestinal+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin.</a> Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).</li>
<li>Oakley, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poultry-Associated+Microbiome%3A+Network+Analysis+and+Farm-to-Fork+Characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations.</a> PloS one. 8, 57190(2013).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nitrogen+retention+and+microbial+populations+in+poultry+litter+treated+with+chemical%2C+biological+or+adsorbent+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+management%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments.</a> Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).</li>
<li>Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+mineralization+of+organic+nitrogen+forms+in+poultry+litters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+quality%22%5BJournal%5D)">Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters.</a> Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).</li>
<li>Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alum+addition+on+microbial+communities+in+poultry+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+science%22%5BJournal%5D)">The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter.</a> Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+QIAamp+DNA+Stool+Mini+Kit+for+ecological+studies+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota.</a> Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).</li>
<li>Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precalence+of+Methanobrevibacter+smithii+and+Methanosphaera+stadtmanae+detected+in+the+human+gut+using+an+improved+DNA+detection+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol.</a> PloS one. 4, 7063(2009).</li>
<li>Harms, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+nitrifying+bacteria+in+a+municipal+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+and+technology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant.</a> Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).</li>
<li>Rothrock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvolume+DNA+quantification+methods+for+use+with+volume-sensitive+environmental+DNA+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+natural+and+environmental+sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts.</a> Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).</li>
<li>Navas-Molina, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNavas-Molina%2C+JA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCHIME+improves+sensitivity+and+speed+of+chimera+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.</a> Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyNAST%3A+a+flexible+tool+for+aligning+sequences+to+a+template+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.</a> Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).</li>
<li>Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FastTree+2%E2%80%93approximately+maximum-likelihood+trees+for+large+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments.</a> PloS one. 5, 9490(2010).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+microbial+community+in+an+anaerobic+swine+waste+treatment+lagoon%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon.</a> Anaerobe. 16, 74-82 (2010).</li>
<li>Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+alum+treatment+on+the+concentration+of+total+and+ureolytic+microorganisms+in+poultry+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+environmental+quality%22%5BJournal%5D)">Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter.</a> Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).</li>
<li>Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+shifts+in+microbial+population+structure+within+poultry+litter+associated+with+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+science%22%5BJournal%5D)">Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties.</a> Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

使用したDNA抽出法の両方糞便やごみの試料について定量的および定性的全細菌コミュニティの見積もりを行うこと、試料を支持することは、以前に1,3,6見られるDNA抽出法の依存性を分析します。糞とゴミサンプルの両方のために、DNA抽出方法の性能の順序は、定量的（機械&gt;ハイブリッド&gt;酵素）と定性的な（酵素&gt;ハイブリッド&gt;機械）全細菌コミュニティの見積もりの​​ために異なっていた。ハイブリッド法は、最も高い定量的または定性的な推定値を生成しなかったが、両方の場合において、ハイブリッド法は、それによって定性的および定量的な全体の最適な組み合わせを生成する、最高性能の抽出方法（ 図1、表2）と統計的に類似した結果が得られた試験した3つの抽出方法の細菌群集の見積もり。これは、細菌のコミュニティプロフィールを留意すべきNE環境試料4,5,8,9,11,12、およびこれらの差動効果を使用してエスこの研究の結果に見られるように強く（ 図2、表1）、DNA抽出法により行うことができ、他の以前の研究は、強くてもよい試験データの...

複雑な臨床サンプルや環境サンプルを分析する場合、DNAの抽出には主に2つの方法が使用されます。1つ目は、激しいビーズ叩きステップを使用してマトリックスを機械的に破壊することであり、2つ目は、マトリックスを酵素で破壊して細菌細胞を化学的に放出し、同時にマトリックスからPCR阻害剤を阻害することです。これら2種類の抽出方法の方法が異なることを考えると、適切なDNA抽出法がサンプルと分析の両方に大きく依存することが以前の研究で示されたことは驚くべきことではありません。これまでの比較DNA抽出研究では、環境サンプル1-3からのDNAの質と量の改善には、いくつかの方法がより適切であることが示されていましたが、他の方法では、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)4-6、末端制限断片長多型(T-RFLP)7、自動リボソーム遺伝子間スペーサー解析(ARISA)8、系統発生マイクロアレイ9などのコミュニティレベルの分析に改善が見られました.したがって、特に近年の細菌群集分析の進歩を考えると、環境サンプルの種類とそれらのサンプルに対して行われる分析の種類に応じて、適切なDNA抽出方法を使用または開発する必要があります。
次世代のシーケンシングは、より定量的なコミュニティ評価(例えば、定量的PCR（qPCR）)と併せて、環境科学や臨床科学でより普及しつつありますが、これらのデータセットに対するDNA抽出法の効果を決定するための研究はほとんど行われていません。ほとんどのDNA抽出比較研究は、農業動物のサンプルではなく、ヒトまたはヒトモデルサンプル10,11からの微生物叢群集の推定値を扱っていました。家禽に焦点を当てた数少ない次世代シーケンシング研究は、特定のメタゲノム12,13またはマイクロバイオミクス14の問題を扱っていました。彼らは、得られたマイクロバイオミクス分析に対するDNA抽出法の影響については議論しませんでした。家禽の生産に関連する環境サンプル(糞便、トイレ砂/寝床、牧草地の土壌など)の複雑な性質を考慮すると、DNA抽出方法を慎重に選択する必要があります。家禽関連の環境サンプルには多数のPCR阻害剤が含まれていることが知られており、PCRおよびその後の下流分析15〜17には最大500倍のDNA抽出物希釈が必要とされている。したがって、DNA抽出法をこれらのタイプのサンプルに最適化することは、マトリックスを物理的に破壊するだけでなく、存在する多数の阻害剤を削減/排除できるようにするためにも不可欠です。
酵素抽出法であるQIAamp DNA Stool Mini Kitは、困難な腸/糞便サンプル1,18,19からDNAを抽出する際の「ゴールドスタンダード」と考えられており、家禽環境サンプル8,14にも成功裏に適用されています。独自のマトリックスを使用してPCR阻害剤を酵素的に除去することは、これらのタイプの環境サンプルにこの方法を使用する最大の利点の1つであり、自動化されたワークステーションを使用してスループットを大幅に向上させる(およびサンプル処理エラーを減らす)能力も同様です。主な欠点の1つは、細菌細胞を環境マトリックスから物理的に切り離すための機械的な均質化ステップがないことです。家禽由来ではない腸および糞便サンプルを検査する場合、DNA抽出プロトコル内にビーズビーキングまたは機械的破壊ステップを追加すると、抽出効率9、DNA収量/品質1,4,5が大幅に向上し、豊富さ、多様性、およびカバレッジ5,6,11の点でダウンストリームコミュニティ分析が大幅に改善されました。.これらの研究では、機械的ビーズビーディング法を「ゴールドスタンダード」酵素法と比較しただけでなく、酵素プロトコールに機械的ビーズビーディングステップを追加して結果を改善した研究もありました6,9,11。
上記の研究の結果によると、家禽関連の環境サンプルから細菌群集分析（定性的および定量的両方）を改善することができます。これは、酵素法に機械的な均質化ステップを追加することです。したがって、この研究の目標は2つありました:(1)機械的(強力な均質化ステップ)抽出方法と酵素的抽出方法(PCR阻害剤の除去と自動化)の両方の最も望ましい側面を利用する新しいDNA抽出技術を開発すること、および(2)この新しい方法の定量的(qPCR経由)および定性的(マイクロバイオミクス経由)細菌群集評価を代表的な機械的および酵素的方法と比較すること。

<table><tbody><tr><td>Lysing Matrix Eチューブ</td><td>MPBio</td><td>6914-050</td><td>さまざまなサイズが利用可能で、猫の最後の3つの数字があります。いいえ。サイズを示します(-050 = 50チューブ、-200 = 200チューブ、-1000 = 1,000チューブ)</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム溶液</td><td>MPBio</td><td>6570-205</td><td>個別に購入することも、糞便用のFastDNAスピンキット(Cat.No. 116570200)</td></tr><tr><td>PLS バッファー</td><td>MPBio</td><td>6570-201</td><td></td></tr><tr><td>バッファー ASL (560 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19082</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 24 ホモジナイザー</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td>48 x 2 ml HiPrep アダプター (Cat.No.116002527)機械的均質化ステップ</td></tr><tr><td>QIAamp DNAスツールミニキット</td>のスループットを2倍にするために利用可能 <td>Qiagen</td><td>51504</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube24 (110V)</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>予備的な結果は、QIAcube HT(Cat.No.9001793)はスループットを向上させるために使用できますが、このマシンには異なる消耗品が必要であり、より多くの比較作業を行う必要があります。</td></tr><tr><td>フィルターチップ、1,000 ml (1024)</td><td>Qiagen</td><td>990352</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ、200 ml (1024)</td><td>Qiagen</td><td>990332</td><td></td></tr><tr><td>QIAcubeローターアダプター (10 x 24)</td><td>Qiagen</td><td>990394</td><td>ローターアダプターキットに含まれている1.5 mlの微量遠心チューブには、代替品があります。&nbsp;Sarstedtマイクロチューブ1.5ml安全キャップ、Catです。No. 72.690</td></tr><tr><td>サンプルチューブ RB (2 ml)</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td>代替品: Eppendorf Safe-Lok マイクロ試験管, Cat.No. 022363352</td></tr></tbody></table>

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドdna抽出法

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

DNA抽出プロトコールの有効性が検討されて試料の種類とを行う下流の分析の両方のタイプに大きく依存することができる。新しい細菌群集解析技術（ 例えば、microbiomics、メタゲノミクス）の使用は、農業と環境科学に普及してきており、これらの分野内の多くの環境試料は、物理化学的に及び微生物学的に一意であることができることを考えると（ 例えば、糞便およびリットル/寝具サンプルから家禽生産スペクトル）、適切かつ効果的なDNA抽出法を慎重に選択する必要がある。したがって、新規な半自動ハイブリッドDNAの抽出方法は、環境家禽生産サンプルで使用するために開発された。機械的および酵素：この方法は、DNA抽出の2つの主要なタイプの組み合わせである。特に環境に関する用に製剤化ビーズビーティングを用いた2段階の強い機械的均質化工程（タルサンプル）、「ゴールドスタンダード」糞便サンプルは、サンプルマトリックスからの細菌およびDNAの除去を促進し、グラム陽性細菌のコミュニティのメンバーの回収率を向上させるための酵素DNA抽出方法の初めに添加した。ハイブリッド方式の酵素抽出部が開始された後、残りの精製プロセスは、サンプルのスループットを増大させ、試料処理エラーを減少させるために、ロボットワークステーションを使用して自動化した。定量的な（16S rRNAを定量PCRを用いて）および定性的を考慮した場合、厳格な機械的および酵素的DNA抽出法と比較して、この新規なハイブリッド方法は、（microbiomicsを使用して）最高の全体的な組み合わせの性能を提供し、総細菌群集の推定家禽の糞及びリターサンプルを処理する際に。

この研究では、新鮮な糞便糞とゴミサンプルは、米国南東部の商業ブロイラーハウス（〜25000羽）から回収した。ブロイラーは（ セキショクヤケイ ）コブ-500が交差した、と彼らはサンプリング時に59日齢であった。新鮮糞便及びリターサンプルは（冷却パッドの近くに、給水器/給電線の近くに、給水器/給電線との間に、排気ファンの近く）ハウス内の4つの領域から回収し、そしてこれらの領域の各々からのサンプルは、5つのプールされたが含まれていその領域内からのサンプル。家の4分野からのサンプルを抽出し、定量的/定性的サンプルタイプ（糞便またはリットル）に応じて別々に分析した。以下に示すデータは、両方の環境試料の種類の家全体の平均値を表す。 総16S rDNAの存在量、サンプル中に含まれる全細菌コミュニティの推定値は、以前に公開し使用して決定した以前に21を説明した。3の抽出方法の蛍光分析に基づいて、各抽出法（から回収された定量PCRプロトコル20エド 、そして値はDNAの量を使用して標準化した、 図1は ...

環境家禽生産サンプルで使用するための新しい半自動ハイブリッドDNA抽出法が開発され、全細菌群集の量的および質的推定値に関して、一般的な機械的および酵素的抽出方法よりも改善が実証されました。

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

次の実験の全体的な目標は、機械的なDNA均質化とPCR阻害剤の除去を組み合わせた新しいDNA抽出技術を開発すること、および家禽生産連続体に沿った環境サンプルへのゴールドスタンダードおよび体細胞抽出法を開発することです。これは、まず環境サンプルをビーズの混合物を含むマイクロ遠心チューブに分割し、複雑な環境サンプルを効果的に均質化することによって達成されます。2番目のステップは、チューブを高出力ホモジナイザーに配置して、細菌細胞と環境マトリックスから核酸を効率的に放出することです。次に、ホモジネートは、PCR阻害結合段階を通じて、ゴールドスタンダードの酵素的DNA抽出法の出発物質として使用されます。最後のステップは、サンプルをDNA抽出ロボットワークステーションに配置して、抽出されたDNAサンプルをユーザーに提供し、多くのダウンストリームアプリケーション、最終的には定量的PCRおよびアルミニウムMiSeqプラットフォームを使用したマイクロバイオーム分析を使用して、この新しいハイブリッド法が、機械的または酵素的抽出法でサンプルを処理する場合と比較して、全細菌群集の定性的および定量的評価の最良の組み合わせを提供することを示すために使用されました一人。この方法は、家禽生産の連続体に沿った微生物群集の分析に関する洞察を提供しますが、同様に複雑な環境サンプルを含む豚や作物生産などの他の農業システムにも適用できます。今日、この手順を実演するのは、私の研究室の学生であるKaitlyn Griffinです。実験を開始するには、ウォーターバスを摂氏95度に設定します。次に、0.33 グラムを 3 回繰り返して重量を量り、合計 1 グラムの室温、土壌、または糞便物質を 2 ミリリットルの溶解マトリックス ET チューブ交換手袋に分析します。825マイクロリットルのリン酸ナトリウム緩衝液と275マイクロリットルの予備溶解溶液またはPLSをサンプルチューブに加えます。次に、チューブを14, 000Gで5分間遠心分離機に混合した後、サンプルを15秒間ボルテックスします。上清をデカントし、700マイクロリットルの緩衝液A SLを加えます。次に、チューブを5秒間ボルテックスします。汚染を防ぐために一度に1つのチューブを開きます。次に、サンプルをFast Prep 24装置に入れる前に、コニカルチューブに総体積の10%のヘッドスペースがあることを確認します。サンプルを毎秒6メートルの速度で40秒間均質化します。高速プレップ24とホモジナイズ後のボルテックスの違いに注意してください。サンプルを14, 000 Gで5分間遠心分離します。上清を滅菌済みの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、さらに700マイクロリットルのSLバッファーで溶解マトリックスETチューブ内の残りのサンプルに移し、再均質化して遠心分離します。上記の設定を使用して、サンプルチューブにプラスチック製のロッククリップを配置して、サンプルチューブが飛び出して上清が摂氏95度の水浴で5分間インキュベートされないようにします。次に、各マイクロ遠心分離機チューブを開いて圧力を解放し、チューブを再び閉じ込めて15秒間ボルテックスします。サンプルを 14, 000 GS で 1 分間遠心分離します。遠心分離後、上清1.2ミリリットルを滅菌済みの2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。次に、タブを含むブリスターパックを開いているマイクロ遠心チューブの真上に置き、タブをブリスターパックからチューブにそっと押し込みます。インヒビットXタブとチューブの接触を避けるため、各サンプルにインヒビットXタブを1つずつ追加します。次に、サンプルが均一にオフホワイトの液体に変わるまでチューブをボルテックスします。サンプルを室温で1分間インキュベートし、チューブの底に残っている粒子を避けながら、14, 000チーズで5分間遠心分離します。すべての液体を滅菌済みの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。次に、チューブを全速力で5分間遠心分離します。自動DNA精製を開始する前に、ワークステーションに適切な量のフィルターチップとバッファーが含まれていることを確認してください。次に、ローターアダプターにエルシアンチューブとフィルターチューブを追加し、ローターアダプターの中央のスロットに各サンプルの400マイクロリットルを追加します。ローターアダプターをワークステーション遠心分離機に置き、すべてのマイクロ遠心分離機チューブの蓋がローターアダプター内に適切に固定されていることを確認します。滅菌済みの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにプロテイナーゼK溶液を加え、ワークステーションのスロットAにセットします。ワークステーションのシェーカーセクションに2ミリリットルのセーフロックマイクロ遠心分離管を追加し、サンプルチューブの蓋がしっかりと配置されていることを確認します。ワークステーションのタッチスクリーンを使用して、DNA便ヒト便病原体検出プロトコルを選択し、後続の画面を読み取って、ワークステーションが正しくロードされたことを確認します。すべてのチェック画面に合格したら、[開始] を選択してプロトコルを実行します。次に、サンプルをローターアダプターから取り出します。遠心分離蒸発ベースのシステムを使用して、個々のサンプルの3つの繰り返し精製を組み合わせます。サンプルをトリスEDTAバッファーで最終容量100マイクロリットルに再溶出します。最後に、サンプルにキャップをし、下流の分析に必要になるまで摂氏マイナス20度に置きます。このグラフは、機械的方法が、糞便およびリターサンプルの全体的に最も高い細菌正規化遺伝子存在量の推定値を一貫して提供したことを示しています。酵素法は、すべてのケースで推定値が最も低かった。新しいハイブリッド抽出法により、定性的および定量的な全細菌群集推定値の最適な組み合わせが得られました。テストした3つの抽出方法のうち。この新しい半自動ハイブリッドDNA抽出法の実行方法をよりよく理解し、複雑な環境サンプルからの微生物群集の定性的および定量的評価におけるその有用性を確認できるはずです。

a-hybrid-dna-extraction-method-for-qualitative-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、空気サンプルフィルターからの大気中の生物学的粒子の2つの補完的な分析が説明されています:エンドトキシンとDNAの抽出と検出です。...

エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。...

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

ここでは、協調検出およびサルモネラの quasimetagenomic シーケンスを通じてサブタイピングの食糧および環境内細菌叢解析からの DNA のサンプルを準備するためのプロトコルを提案する.併用文化濃縮、原因菌分離 (IMS)、複数の変位の増幅 (MDA) により、サルモネラ食糧および環境試料からゲノム DNA...

食品および環境試料からのサルモネラの準メタゲノム解析

環境の粒子状物質の生物学的組成を理解することは、その人間の健康や病気の広がりの重要な影響の研究にとって重要です。ここでは、異なる環境条件下における浮遊微生物をよりよく調べるバイオエアロゾル サンプリング方法の 3...

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。...

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

ここでは、市販のブロイラー系統であるRoss...

微生物叢研究のための商業ラインからの無菌急成長ブロイラーの生産

このプロトコルは、尿細菌の培養、シーケンシング、および デノボ...

短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ

このプロトコルは、嫌気性腸内細菌の分離を改善するための2つの方法論を提示します。1つ目は、さまざまな培地を使用してさまざまな細菌を分離することに焦点を当てています。2つ目は、特定の微生物群、おそらくミオイノシトールを同化して、その生態学的意義を完全に理解するための培養ステップに焦点を当てています。...

鶏の消化管からの嫌気性細菌の培養を強化するための戦略

家禽中の サルモネラ 菌を低レベルで正確に定量することは、現在の産業および規制上の課題です。このプロトコルは、生および調理済み家禽製品中の サルモネラ...

生および調理済み鶏肉製品中の サルモネラ菌 を定量するための修正最確数アッセイ

信頼性が高く正確な現場展開可能なDNA分析は、多くの産業にとって非常に重要です。本論文では、現場での環境微生物分析のための2つの方法を提案します。1) 生物学的抽出フィールドキットを用いた環境サンプルから微生物DNAを分離する方法、2) フィールドqPCRユニットを用いたDNA解析です。...

生物学的抽出フィールドキットとフィールドqPCRユニットを用いた現地での微生物DNA解析

学ぶ ハイブリッドDNA抽出法で家禽生産環境サンプルの細菌群集を定性的・定量的に評価する方法。機械的ホモジナイゼーションと酵素抽出を組み合わせ、複雑な環境サンプルから高品質なDNAを抽出し、微生物叢解析の精度を向上させる。

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

さらに動画を探す