顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術インビトロ

この手順の全体的な目標は、顆粒球の機能を 2 つのパラメーター アプローチとして評価することです。これは、まず患者の血液サンプルから顆粒球をバイオ粒子と試薬でインキュベートし、酸化バーストを可視化することで達成されます。第2ステップでは、インキュベーション後の食作用をブロックし、次に目的の細胞表面受容体を標識して、顆粒球の確実な同定を可能にします。

最終的に、活性化された顆粒球サブセットは、画像ベースのフローサイトメトリーによって同定および単離できます。この方法は、食生活や栄養習慣が変化や顆粒球機能にどのように寄与するかなど、栄養学または臨床免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるEric Pradoです。

末梢血サンプルを解凍し、SIUsバイオ粒子とDHEを室温で、37°CのB浴でエチルマラム化した後、試薬が解凍されたら、滅菌フード内の4本の1.2ミリリットルチューブに20マイクロリットルのssusバイオ粒子を加えます。次に、解凍したDHEをバイオ粒子を含む各チューブに40マイクロリットル加え、ベンチのチューブを軽くたたいてチューブの底に試薬を回収します。各チューブに100マイクロリットルの混合全血を追加した後、綿の先端のアプリケーターでチューブの内側の端に沿って汚染された血液を取り除き、3サイクルの電子ピペットセットで血液と試薬を混合します。

3回目のサイクルの後、すべてのチューブを光から保護された氷のバケツに入れます。次に、40分のチューブから始めて、摂氏37度のスピードバスでチューブを10分、20分、または40分間インキュベートして、すべてのインキュベーションが同時に終了するようにします。インキュベーションの終わりに、マラメラドエチル15マイクロリットルを各チューブに分注します。

30分後、細胞をそれぞれ10マイクロリットルの適切な抗体でインキュベートします。さらに1時間後、750マイクロリットルの白血球で細胞をインキュベートし、赤血球シラミ溶液を固定します。さらに1時間後、インキュベーションで細胞を遠心分離し、上清を真空吸引して、細胞ペレットの上に100マイクロリットルの残液量を残します。

次に、希釈したばかりの7つのAとdの10マイクロリットル、PBSの50マイクロリットル、およびキャリブレーションビーズの25マイクロリットルを各サンプルに追加します。次に、チューブにキャップをし、ホイルで包み、摂氏4度で保管します。イメージベースフローサイトメーターの準備ができたら、各サンプルチューブを運転し、事前定義されたパラメーターを使用して最低3000のULU部位イベントを収集し、サンプルを分析します。

IDEAソフトウェアの自動ソフトウェア補正ウィザードを使用して、未加工の画像ファイルに補正マトリックスを適用し、補正された画像ファイルを作成します。次に、個々のCIFファイルをIDEAソフトウェアにロードし、次のプロットを生成して、各患者サンプルの顆粒球サブセットを特定します。まず、非刺激コントロールを参照標準として使用し、明視野勾配平方根平均二乗のヒストグラムを使用して、初期ゲートを確立し、焦点が合っていると考えられる細胞を特定します。

次に、一重項セルを破片とダブレットから分離するために、明視野のアスペクト比と明視野領域のドットプロットを作成します。クリーンな細胞集団が同定されたら、CD 45 と CD 66 のドットプロットを確立し B.To、CD 45 陽性の CD 66 B 陽性顆粒球を正に同定します。最後に、黄色管の明るい詳細強度と酸化バーストの明るい詳細強度のドットプロットを作成します。

チャネル1および9の明視野画像、チャネル3のバイオ粒子、チャネル4のDHE、チャネル5の7つのa、d、チャネル11のCD66B、およびチャネル12のCD45を収集している活性化顆粒球のサブセットを同定するために、DHEとバイオ粒子のイベントを組み合わせて描写する2色のオーバーレイも生成することができる。画像ベースのフローサイトメトリーを使用すると、活性化された顆粒球の均質な集団を3つの異なる活性化サブセットに分離できます。この方法では、3つのサブセットを解決する最も効果的な方法は、食作用と酸化バーストの明るい詳細強度をプロットすることです。

さらに、IDEASソフトウェアの共局在化ウィザードを使用すると、顆粒球の食作用と酸化的バーストの同時存在を定量化することができ、これは高活性化の特徴です。さらに、この実験では、40分間のインキュベーション期間が、高活性顆粒球の割合が最も高かったことを示しました。したがって、プロトコルに少なくとも3つのインキュベーション期間を含めることで、所与の臨床治療が顆粒球の時間的活性化状態をどのように変化させるかの決定が容易になります。

この手順に続いて、ビーズベースのマルチプレックスアッセイなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。例えば、生体粒子への曝露後、仰臥位における顆粒球ケモカイン産生はどのように変化するのでしょうか?