抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

標的および非標的の翻訳後修飾またはPTMを持つヒストンペプチドを含むマイクロアレイスライドを取ります。

ペプチドは、ストレプトアビジン官能化スライドガラス上の特定のスポットに共役ビオチンを介して固定化されます。

スポットには固定化されたビオチン結合緑色蛍光色素も含まれており、スポットの識別を容易にします。

ブロッキングバッファーを導入し、非特異的抗体相互作用を防ぎます。

バッファーを取り除き、遠心分離してスライドを乾燥させます。

ワックスインプリンターの内側で、アレイをワックスで縁取りします。

ハイブリダイゼーションバッファーでアレイを平衡化します。

標的PTMに特異的な一次抗体とインキュベートします。

一次抗体に結合する赤色蛍光色素結合二次抗体を導入します。

結合していない抗体を除去し、遠心分離してスライドを乾燥させます。

マイクロアレイスキャナーを使用してスライドを画像化します。緑色の蛍光はスポットの識別に役立ち、赤色の蛍光は PTM と抗体の相互作用を示し、抗体特異性を示します。

標的PTMの認識は抗体特異性を示し、非標的PTMの認識は抗体の交差反応性を示します。

ソースプレートマップに基づいて、各ペプチドフィーチャーの1〜2マイクロリットルを、1つまたは複数の384ウェル小容量プレートの指定されたウェルにロードします。各特徴を1xタンパク質マイクロアレイ印刷バッファーで10倍に希釈し、1%ウシ血清アルブミンと1マイクロリットルあたり5マイクログラムのフルオレセイン標識ビオチンを添加します。次に、プレートを室温で500回gで2分間遠心分離します。次に、マイクロアレイプリンターの廃棄物容器を空にします。加湿器容器に洗浄液を滅菌蒸留水で満たします。マイクロアレイプリンターソフトウェアにアレイスライドパラメータを入力します。

洗浄手順を1回の浸漬で1秒間の洗浄、後洗浄でピンを5回交換し、湿度を60%に設定します。次に、ストレプトアビジンでコーティングされたスライドガラスを基板プラテンに挿入します。プラテンをプラテンエレベーターにセットします。ソースプレートをプレートホルダーに挿入し、ホルダーをソースプレートエレベーターにロードします。印刷プロセスを実行します。

次に、基板プラテンを装置から取り外します。振とうしながら、1x プロテインマイクロアレイブロッキングバッファーで印刷されたスライドを30分間ブロックします。次に、スライドを室温のpH 7.6リン酸緩衝生理食塩水で10分間洗浄します。PBSの新しいバッチで洗浄を繰り返します。スライドを室温で30秒間遠心分離して乾燥させます。

次に、マイクロアレイワックスインプリンターを摂氏85度で30分間、またはワックスが溶けるまで予熱します。次に、印刷面を下にしてスライドをホルダーに挿入し、ホルダーをインプリンター金型に合わせます。型をスライドに接触させ、2秒間保持します。次に、スライドをホルダーからすばやく取り外し、ワックスの境界を検査して、アレイが適切に囲まれていることを確認します。分割されたスライドは摂氏4度で乾燥した暗い場所に保管してください。

ハイブリダイゼーション手順を開始するには、分割されたアレイスライドをプラスチック皿に入れ、スライドをハイブリダイゼーションバッファーで覆います。低速で振とうしながら、摂氏4度で30分間スライドを平衡化します。室温でマイクロアレイスライド遠心分離機で回転させてスライドを乾燥させます。次に、各ヒストンPTM抗体溶液5マイクロリットルをアレイの少なくとも2つのウェルに加え、摂氏4度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、抗体溶液を取り出し、アレイを冷たいPBSで摂氏4度でそれぞれ5分間3回洗浄します。次に、アレイを蛍光色素結合二次抗体溶液中で、光のない状態で摂氏4度で30分間インキュベートします。スライドを以前と同様に冷たいPBSで3回洗浄します。

アレイを室温の0.1x PBSに浸して余分な塩を除去し、室温で短時間遠心分離してスライドを乾燥させます。マイクロアレイスキャナーでスライドを少なくとも25ミクロンの解像度で画像化します。