Name: 開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのIgE (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶ、IgE依存性メディエーター遊離を測定するアッセイ法。ラット好塩基球性白血病細胞に馬FcεRIα遺伝子を導入し、アレルギー反応のメカニズム解明と治療法開発に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者は、アドバイスと実験施設を提供してくださったリンダ・パートリッジ博士に感謝します。

細胞株の1）準備： <ol><li>馬のFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞株の開発： <ol><li>単層細胞株についての基本的な組織培養技術を用いて、pEE6プラスミドを使用して、親RBL-2H3.1細胞をトランスフェクト、ウマFcεRIα遺伝子（GenBank：Y18204.1）を有する28。 1.2×10 7細胞ml -1の濃度で細胞の0.8ミリリットルにプラスミドDNA2μgのμlの-1を追加します。その後すぐに氷上で10分間インキュベート0.4cmのelectrocuvetteを使用して、250V、960μFで細胞をエレクトロポ。 </li><li>その後、蛍光IgE抗体とそれらをタグ付けすることによって、FACSを通して残りの生きた細胞をソートし、ジェネティシンG418硫酸0.4グラムを含む培地を使用して形質転換細胞を選択します。捜査2、3のための馬FcεRIα細胞株を発現している結果としてRBL-2H3.1を使用してください。 </li></ol></li><li>プレ検定抗体感作性： <ol><li>5細胞mlの細胞密度に培養培地中に再懸濁細胞を、その後洗浄する-1。 </li><li> 1 ngのml -1の最終的な濃度に懸濁した細胞への関心のIgEを追加した列1-6で96ウェルプレートに100μlの細胞をプレートし、37℃+ 5％CO 2 + 90％でインキュベート16時間、相対湿度。インキュベーション時間の後、および放出アッセイを行う前に、ウェルの集密度及び細胞接着のために顕微鏡下で、ウェルをチェックしてください。 </li></ol></li></ol> 2）放出アッセイ： <ol><li>細胞を洗浄する。 <ol><li>穏やかな細胞洗浄を可能にするために、37℃の温放出緩衝液（25mMのPIPES、120mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カリウム、0.04 mMの塩化マグネシウム、および1mM塩化カルシウム）。 </li><li> 、細胞培地を除去するためにプレートをフリックと暖かい100μlを加えることにより、細胞を洗浄37℃で、放出緩衝液。二回繰り返します。 </li></ol></li><li>抗原チャレンジ： <ol><li> 0.1、0 ngのmlと-1の抗原の段階希釈（NIP-HSAまたはDNP-HSA）を調製NGミリリットル-1、1 ngのmlで-1、10 ngのmlを-1、100 ngのmlで-1、千ngのミリリットル-1 10,000 ngのリリース·バッファ内ミリリットル-1および37℃で温めて。 </li><li>第二の細胞の洗浄後、メディアを破棄し、抗原溶液100μlで置き換え。同じ行のウェル（例えばA1-6）が同じ抗原濃度がそれらに追加されていることを確認してください。 </li><li> 0 ngのml -1の抗原を添加することにより、行Aにおける負の制御を設定します。陽性対照として使用する細胞を溶解するために、行H細胞におけるトリトン緩衝液（5％トリトンX-100）に続く行（BG）ダウン増大抗原濃度を追加する。細胞がそのメディエーターを放出できるように20分間37℃でインキュベートする。 </li></ol></li><li>個々のウェルコントロールの設定： <ol><li>インキュベーション後、プレートのもう半分（井戸A1-6井戸A7-12へ、等）への細胞上清50μlを移す。上清の残りを50μlを破棄して、列1-6のセル内の全メディエーターの割合として列7-12に各ウェルにリリースメディエーターの量の測定を可能にするためにトリトン-X緩衝液50μlと交換。 </li></ol></li><li>酵素基質： </li><li> 50（クエン酸緩衝液に添加することにより2mMのにまで希釈されたDMSO中で調製した50 mMの4-ニトロフェニルN-アセチルβ-Dグルコサミニド0.2 Mクエン酸、0.2 M酢酸ナトリウム、pH 4.5）βヘキソサミニダーゼ基質のμlを添加するすべてのウェルにβヘキソサミニダーゼ酵素による4-ニトロフェノールへの基質の変換を容易にします。 2時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li></ol><img alt="図2.4.1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig241.jpg" widt><ol start="5"><li>反応を停止する。 <ol><li>各追加150μlのトリス緩衝液（1 Mトリス-HCl、pHを9）により反応を停止ならびに緩衝液の高いpHは、反応を停止させ、黄色に4-ニトロフェノールをオン。 </li></ol></li><li>結果を読み込むと分析する： <ol><li>黄色の吸光度を測定するために405nmでプレート分光光度計を用いてプレートをお読みください。以下の式を用いて放出βヘキソサミニダーゼの割合を算出した。 </li></ol></li></ol><img alt="図2.6.1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig261.jpg" width="100"><ol start="2"><li>平均値を行ごとに取得された後、各ウェルにこの数式を適用します。 A1およびA7が96ウェルプレートのウェルの位置を表す。 agai（総メディエーター放出に相当）βヘキソサミニダーゼ放出の割合のグラフをプロットします抗原濃度2,3 NST。 </li></ol>

<ol><li>Taudou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Alpha+Chain+of+Human+Fc%CE%B5RI+in+Transfected+Rat+Basophilic+Leukemia+Cells%3A+Functional+Activation+after+Sensitization+with+Human+Mite-Specific+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE.</a> Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).</li>
<li>Sabban, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+an+in+Vitro+Model+System+for+Studying+the+Interaction+of+EquuscaballusIgE+with+Its+High-Affinity+Fc%CE%B5RI+Receptor%22">Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor</a>. , The University of Sheffield. Sheffield. (2011).</li>
<li>Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+Vitro+Model+System+for+Studying+the+Interaction+of+EquuscaballusIgE+with+Its+High-Affinity+Receptor+Fc%CE%B5RI%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).</li>
<li>Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE+mediates+stimulus+secretion+coupling+in+rat+basophilic+leukemia+cells+transfected+with+the+a+chain+of+the+human+high-affinity+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor.</a> Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).</li>
<li>Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+canine-human+Fc+IgE+chimeric+antibodies+for+the+determination+of+the+canine+IgE+domain+of+interaction+with+Fc%CE%B5RI%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22MolImmunol%22%5BJournal%5D)">Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα.</a> MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).</li>
<li>Rashid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Diagnostic+and+therapeutic+applications+of+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MolImmunol%22%5BJournal%5D)">Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells.</a> MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).</li>
<li>Cohen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+in+antiquity%3A+the+Ebers+Papyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Proc%22%5BJournal%5D)">Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus.</a> Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).</li>
<li>Dudler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+catalytic+activity%2C+IgE-independent+mast+cell+activation%2C+and+allergenicity+of+bee+venom+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2.</a> J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).</li>
<li>Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+allergens+stimulate+the+release+of+mediators+of+the+allergic+response+from+cells+of+mast+cell+lineage+in+the+absence+of+sensitization+with+antigen-specific+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE.</a> Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).</li>
<li>Smyth, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+molecular+basis+of+pro-allergenic+effects+of+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke.</a> Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).</li>
<li>Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27hygiene+hypothesis%27+for+autoimmune+and+allergic+diseases%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22ClinExpImmunol%22%5BJournal%5D)">The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update.</a> ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Eder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+and+genetic+factors+on+allergen-specific+immunoglobulin-E+levels+in+sera+from+Lipizzan+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses.</a> Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).</li>
<li>Cook, W. R., Rossdale, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syndrome+of+%27Broken+Wind%27+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The syndrome of 'Broken Wind' in the horse.</a> Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).</li>
<li>Eyre, P., Lewis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+systemic+anaphylaxis+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acute systemic anaphylaxis in the horse.</a> Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).</li>
<li>Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. , International Federation of Horseracing Authorities. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664">http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664</a> (2009).</li>
<li>Wagner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+horses%3A+occurrence+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">IgE in horses: occurrence in health and disease.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hellberg, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+insect+bite+hypersensitivity%3A+immunoblot+analysis+of+IgE+and+IgG+subclass+responses+to+Culicoidesnubeculosus+salivary+gland+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).</li>
<li>Schaffartzik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+insect+bite+hypersensitivity%3A+what+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Equine insect bite hypersensitivity: what do we know.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).</li>
<li>Künzle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-bearing+cells+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+and+allergen-specific+IgE+levels+in+sera+from+RAO-affected+horses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+A+PhysiolPatholClin+Med%22%5BJournal%5D)">IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses.</a> J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).</li>
<li>Tahon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+allergy+tests+compared+to+intradermal+testing+in+horses+with+recurrent+airway+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction.</a> Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).</li>
<li>Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+anti-equine+IgE+antibodies+with+specificity+for+different+epitopes+on+the+immunoglobulin+heavy+chain+of+native+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).</li>
<li>Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibodies+specific+for+native+equine+IgE+and+their+application+to+monitor+total+serum+IgE+responses+in+Icelandic+and+non-Icelandic+horses+with+insect+bite+dermal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).</li>
<li>McAleese, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+extra-cellular+part+of+the+alpha+chain+of+the+equine+high-affinity+IgE+receptor+and+its+use+in+the+detection+of+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).</li>
<li>Ledin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+therapeutic+antibody+responses+against+IgE+in+dogs%2C+an+animal+species+with+exceptionally+high+plasma+IgE+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels.</a> Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).</li>
<li>Siraganian, R. P., Hook, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+release+and+assay+methods+for+the+study+of+human+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Manual+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Histamine release and assay methods for the study of human allergy.</a> Manual of Clinical Immunology. , American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).</li>
<li>Neuberger, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hapten-specific+chimaericIgE+antibody+with+human+physiological+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function.</a> Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).</li>
<li>Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Protein+Phosphorylation+and+Ca2%2B+Mobilization+in+a+low+secreting+variant+of+the+rat+basophilic+leukemia+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).</li>
<li>McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+horse+and+sheep+high-affinity+IgE+receptor+alpha+chain+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA.</a> Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).</li>
<li>Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , The University of Sheffield. (2010).</li>
<li>Sabban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+pan-anti-allergy+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22JIBTVA%22%5BJournal%5D)">Towards a pan-anti-allergy vaccine.</a> JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).</li>
<li>Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bioassay+to+detect+reaginic+antibodies+from+the+serum+of+horses+affected+with+recurrent+airway+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction.</a> Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).</li>
</ol>

著者らは、この論文に競合する金銭的利益はないことを宣言します。

要約すると、この調査の結果は、馬FcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞は馬のIgEで感作し、抗原によって挑戦されたとき、彼らは内部のメディエーターの合計量の4.88パーセント±36.68パーセントのピークメディエーター放出を与えることを示した馬FcεRIαを発現していないRBL-2H3.1親細胞に比べて細胞、。 したがって、このアッセイは、in vitroでの馬のアレルギー反応を調査し、研究するための有用なツールを提供します。そのことができ、従って、肥満細胞/好塩基球系統の細胞によって放出さメディエーターの量の測定は、アレルギーを引き起こす物質を評価すること、またはIgE /受容体遮断薬を研究するかどうか、馬アレルギーの研究を進めることが期待できる。 このアッセイは、同じ目的のためにヒトおよびイヌのアレルギー4529を研究するためにそれを使用して、以前の出版物からの馬のアレルギーを研究するために変更されました。操作された細胞株人間と犬のFcεRIαを表現sがこのようなIgE /受容...

アレルギーは、数千年前から知られている。喘息治療はエーベルス·パピルス（〜1550 BCE）として知られている古代エジプトの医学のテキストで説明して7を治療するための薬草療法を検討した。 今日アレルギーはTヘルパー細胞2型（TH 2）免疫系のアームはアレルゲンと呼ばれる、環境抗原に応答して、免疫グロブリンE（IgE）抗体の産生を操縦するI型過敏性反応、に分類される。 IgEの合成を高めるタバコの煙やディーゼル排気微粒子中の粒子がそうであるように、これらは9、インターロイキン-4およびインターロイキン13 8を含む一般的に免疫系の細胞と相互作用し、炎症誘発性サイトカインの合成および分泌を刺激する多様な物質である10。 過去50年間で先進国におけるアレルギー症状の上昇はの効果の組み合わせに起因している「衛生仮説」11によって提案されたように、TH 2サイトカインによって支配プロファイルに対する免疫応答をシフトするために組み合わせる環境汚染物質、より衛生的な環境へのトレンド、。 上述したように、人間がアレルギーに悩まさ唯一の哺乳類ではありません。注目すべき馬と犬はまた、古典的なアレルギー反応を開発することができますし、12の調査によると、人間のように、馬アレルギーは遺伝的要因と環境的要因に起因する、ことを示している。結果として、これらの動物は、一度臨床症状がで設定したアレルギーの遺伝的および環境的な原因、病気への感作からの進行、および可能な介入戦略との間の相互作用を研究するための優れたモデルを提示 1887年に、Stömmerは、馬の心血管系に対するヒスタミンの効果がある、人間と馬の喘息13の間の類似性を記述した最初の人だった人間14のものと非常に類似している。馬はまた、年間15米1150億ドルの賭け売上高は720億ドル、米国の価値がある競馬産業の礎である。 ほとんどの現代的な競走馬以降1878からレディアン·ブラントによって繁殖アラビア馬の数が少ないの子孫である。現代の競走馬は、一般的にパフォーマンス能力を選択するために近交系されている。彼らは、アレルギー反応をマウントするそれらの感受性であるそのうちの一つ、遺伝性疾患になりやすいです。彼らはまたも、最も深刻なアレルギー人間16よりも1000倍高い血清IgEレベルを持っている。馬アレルギー反応は、通常、虫刺され過敏症（IBH）17、18として明示されている。IBH結果は皮膚炎に起因刺されに属ヌカカで昆虫を形成する。ウマのアレルギー性​​疾患の別の形態は、これは肺と気道で明らかにされて、再発性気道閉塞（RAO）である。それは、喘鳴やラボによって特徴づけられるOR演算呼吸。 RAOは、一般的に胞子を成形することに応答して発生し、別の調査がこの20を確認していないが、高アレルゲン特異的IgEレベルは、一つの研究19にRAOに罹患している馬に記録された。 ウマアレルギーに関する研究の試みモニタリングにおける、および抗ウマのIgEモノクローナル抗体（mAb）21,22を開発することによって、馬のIgEを中和することを中心に展開し、さらに23による研究では、馬の高親和性Fc受容体のαの細胞外ドメインの生産を議論ウマ血清IgEを検出し、定量する試みで、チェーン（FcεRIα）受容体。 Ledin 24による関連研究では、自己/非自己免疫原を使用して免疫系をプライミングすることにより、血清IgEを中和することを目的とした新しいアプローチについて説明します。すべてのこれらの研究は、しかし、それらのプロトコルの安全性と有効性を試験するための効果的なアッセイを欠いていた。この記事では、我々は今そのようなアッセイsysを提示βヘキソサミニダーゼ放出馬システム、関連する診断および治療戦略の研究に適用可能なTEMは、細胞メディエーターの脱顆粒の指標として、ウマFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞で評価した。このプロトコルは、異なる種由来のIgEに対する高親和性受容体のIgE結合ドメインをコードする遺伝子でトランスフェクトしたRBL細胞の工学を記述する先の刊行物25、4、5、2、3に基づいている。プロトコルは、結果は、三連の実験の平均値±標準偏差として提示されているβヘキソサミニダーゼ放出アッセイを実行する方法について説明します。 放出アッセイは、最初Siraganianによって開発され、人間のアレルギーを研究するために25をフックした。博士ルーベンSiraganian率いる研究室グループは、RBL細胞株を開発した。これらのRBL細胞は、ヒトFcεRIαを表現するために開発され、プロトコルが4によって出版された。最後のピースアッセイのハプテン4-ヒドロキシ-3-を標的IgEの可変領域をマウス遺伝子の下流に、その重鎖遺伝子をクローニングすることにより、IgE抗体の産生を記載しノイバーガー26の論文でのpSVプラスミドの開発に付属 - ニトロフェナセチル（NP）、得られたキメラ抗体は、完全に機能した。また、RBL細胞の表面上のその受容体をクローニングしながら、同じハプテンを対象とした全てのIgEを開発する能力は、好塩基球細胞の脱顆粒を測定するための有用なプロトコル作るアッセイの標準化をもたらした。 アッセイは、長所と短所を持っています。このアッセイの利点は、任意の哺乳動物系で使用される適応性である、我々の研究室は、ヒト、イヌおよびウマのシステムにおいて脱顆粒をテストするためにそれをこのように使用されており、これは、生物のIgEの合成およびその受容体をクローニングすることによって、単純に達成可能であるRBL細胞の表面上に。 一方、アッセイの短所は、RBL細胞は、それらを同じアッセイ内の脱顆粒のレベルの変化を与えること、熱的、機械とPH変化に非常に敏感であるということです。それは、このように強くアッセイは常に三重に繰り返された後、平均がそれらから取られることをお勧めします。また、RBL細胞は、彼らのメンテナンスが煩雑になっ、延長時間（&gt; 10週間）27組織培養で残っている場合、非放出表現型へシフトする傾向がある。彼らはまた、光学顕微鏡からは見えませんし、細胞の形態を変化させないマイコプラズマ細菌による感染症になりやすいですが、劇的に彼らの脱顆粒レベルを変更します。このように定期的なマイコプラズマ試験が必要とされている。

<table><tbody><tr><td>RBL-2H3.1馬Fc&epsilonを発現する;RI&alpha;</td><td>-</td><td>-</td><td>実験室で生産</td></tr>された<tr><td>馬IgEの反NIP-HSA</td><td>-</td><td>-</td><td>実験室で作り出</td></tr>された<tr><td>96の井戸の版</td><td>のΣ</td><td>CLS3595</td><td>-</td></tr><tr><td>多チャンネルのピペット</td><td>Anachem</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーギャラクシーR</td> <td>-</td><td></td></tr><tr><td>-4Hydroxy-5-ヨード-3-ニトロフェニル酢酸</td><td>ケンブリッジの研究の生化学</td>品<td>N-1070-1</td><td>NIP-OHは、実験室でNIP-HSAを作るためにヒト血清アルブミンと結合された</td></tr><tr><td>ジニトロフェニル ヒト血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>A6661</td><td>略称DNP-HSA</td></tr><tr><td>プレート分光光度計</td><td>Anthos Labtec HT2</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>パイプ</td><td>シグマ</td><td>P1851</td><td>-</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>シ<td>グマ</td><td>S7653</td><td>-</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td>P9333</td><td>-</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M2670</td><td>-</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C1016</td><td>-</td></tr><tr><td>トリトン x100</td><td>シグマ</td><td>X100-4</td><td></td></tr><tr><td>-ニトロフェニル N-アセチル -&β;-D-グルコサミニド</td><td>シグマ</td><td>N9376</td><td>「ヘキソサミニダーゼ」というストック溶液は、DMSO</td></tr><tr><td>ジメチル スルホキシ</td>ド <td>シグマで調製された 50mM でした</td><td>D2650</td><td>-</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグ</td><td>マ251275</td><td>-</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S7670</td><td>-</td></tr><tr><td>トリス</td><td>シグマ</td><td>T5941</td><td>-</td></tr></tbody></table>

開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのige

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

IgEとその高親和性Fc受容体（FcεRI）との相互作用とそれに続く抗原性チャレンジは、IgE媒介性アレルギー反応の主要な経路です。IgEとFcεRIの間の高い親和性結合とB細胞によるIgEの連続的な産生の結果として、アレルギーは通常生涯を通じて持続し、現在のところ恒久的な治療法はありません。馬、特に競走馬は一般的に近親交配されており、哺乳類の一種であり、過敏反応を発症する傾向が非常に強く、パフォーマンスに深刻な影響を与える可能性があります。馬のアレルギー感作に対する生理学的反応は、人間と犬で観察されたものを反映しています。この論文では、ウマ系に関連するアレルギー反応のメディエーターの放出を定量的に評価するためのin situアッセイシステムの開発について説明します。この目的のために、ウマFcεRIαをコードする遺伝子を親ラット好塩基球白血病(RBL-2H3.1)細胞にトランスフェクションし、表面上に発現させました。トランスフェクションされたウマα鎖の遺伝子産物は、内因性ラットβ鎖およびγ鎖1と機能的な受容体複合体を形成した。得られたアッセイシステムは、ウマIgEによる感作および抗原チャレンジ後のウマFcεRIαトランスフェクトRBL-2H3.1細胞から分泌されるメディエーターの量の評価を容易にしましたβ-ヘキソサミニダーゼ放出を読み取り値として使用します2、3。メディエーターの放出は、抗原の100 ng ml-1で36.68%±4.88%でピークに達しました。このアッセイは、ヒトおよびイヌのアレルギー反応の研究に使用された以前のアッセイから改変されたものである4, 5。また、このタイプのアッセイシステムは、診断ツールの開発やアレルギー疾患における潜在的な治療介入戦略の安全性評価に複数の用途があることも示しました6、2、3。

親RBL-2H3.1細胞およびウマFcεRIα受容体遺伝子でトランスフェクトされたものが最初にマウスIgE抗DNP-HSAで感作し、DNP-HSA抗原でチャレンジした。マウスIgEは、両方の細胞株における内因性ラット受容体に結合し、したがってメディエーター（ 図1 A）を放出するために、両方の細胞株の放出生存度を試験するための対照として働く。これは重要な検査であり、細胞培養における延長（&gt; 10週間）経過時に、RBL-2H3.1細胞を非分泌表現型27に向かってドリフトするので、日常的に行われるべきである。馬FcεRIα受容体を発現する細胞は、5.76パーセント±45.99パーセントのピークメディエーターの放出を有していた親細胞が、4.79パーセント±51.54パーセントのピークメディエーターの放出を支持した。その後馬のIgE抗NIP-HSAで感作し、NIP-HSA抗原（ 図1B）でチャレンジし、これらの同じ細胞株。親細胞があるので、メディエーター遊離を受けなかった馬IgEは、内因性ラット受容体に結合しない。馬のIgE抗NIP-HSAで感作し、...

現在の研究は、ウマのFcεRIα遺伝子を持つラット好塩基性白血病細胞のトランスフェクションに基づく遺伝子操作アッセイシステムの開発と応用を説明しています。トランスフェクションされた細胞は、アレルギー反応のメディエーターの放出がIgEと抗原によって活性化される機能的な受容体を発現します。

開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのIgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

次の実験の全体的な目標は、RAD 好塩基球白血病細胞からの IgE 依存性メディエーター放出の量を測定することです。アレルギー症状は、ヒスタミンなどのメディエーターの放出によって引き起こされます。さて、ヒスタミンは好塩基球によって放出される唯一のメディエーターではなく、肥満細胞です。これらの細胞によって放出されるすべてのメディエーターの合計は、即時および遅延型の過敏症の徴候と症状をもたらします。現在、アレルギーに苦しんでいる生物は人間だけでなく、犬や馬も同様に苦しんでいます。研究をさらに発展させ、ワクチンなどのアレルギーに対する治療法を見つけるためには、研究治療から放出されるメディエーターの量(存在する場合)を定量化するための放出アッセイが必要です。これが、このリリースアッセイの理由です。RBLメディエーターリリースのヒトシステム用アッセイは、1986年にIanとHookによって初めて開発され、発表されました。その後、DOCシステム用に開発され、現在は馬用システム用に開発されました。修飾は、目的のタンパク質を変更するのと同じくらい簡単です。細胞株のニュースは、ラット・バソ白血病またはRBLの2つのH 3.1細胞株で、ウマの高FNT ffcセリンR1受容体のアルファ鎖を500, 000細胞/ミリリットルの細胞密度に発現していました。目的のIgE抗体を、1ミリリットルあたり1ナノグラムの最終濃度まで添加します。100マイクロリットルの混合物を96ソイルプレートに加え、37度で16時間インキュベートします。これにより、細胞がウェル表面に接着し、抗体がその受容体洗浄に結合します。残りの未結合抗体と死細胞を含む培地の2倍に、100マイクロリットルの温かい37度の放出バッファーを加えます。最後の洗浄から緩衝液を廃棄し、目的の濃度で目的の抗原100マイクロリットルと交換します。37°Cで20分間インキュベートした後、放出メディエーターを含む50マイクロリットルのSUPナチンを新しいウェルに移し、残りの上清を50マイクロリットルのTriton Xバッファーに交換して細胞を結合し、残りのメディエーターを細胞内に放出します。200万モルベータhxの50マイクロリットルで。基質をクエン酸緩衝液に溶解する日が数日。37度で2時間のインキュベーション後、各ウェルに150マイクロリットルのトリスバッファーを加え、ウェルを黄色に変えます。16時間後に405ナノメートルで色吸光度を測定します。放出アッセイバッファー(別名Ian Buffer)を37°Cで温めます。また、放出バッファー中の抗原の濃度勾配を濃度で調製します。ゼロ0.1 1 10、100、1000および10、000ナノグラム/ミリリットル。その後、37度で温まります。皿をすばやくフリックしてメディアを取り出し、ウェルの壁に向かっ

development-an-vitro-model-system-for-studying-interaction-equus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ヒトナチュラルキラー細胞の治療用抗体によって開始されるFcγRIIIa駆動型イベントを示しています。この人工刺激プラットフォームは、細胞骨格の再構成、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路を含む、下流のエフェクター機能の探索を容易にします。...

抗体によるFc受容体活性化を研究するためのIn vitro人工活性化アッセイ

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

ここでは、馬の呼吸液中のEHV-2 DNAの検出と定量に使用される定量的PCR法の開発と検証のためのプロトコールを紹介します。EHV-2...

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。...

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

このレポートでは、研究者がマウスモデルを生成できるようにするプロトコルを提示します 眼内ブドウ膜炎の。より一般的には実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)と呼ばれるこの確立されたモデルは、人間の病気の多くの側面を捉えています。ここでは、いくつかの読み出しを用いて疾患進行を誘導およびモニタリングする方法について説明します。...

実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

エンテロイドは、組織生理学や病態生理学、医薬品開発、再生医療を研究するための新しいモデルとして浮上しています。ここでは、関連する組織細胞タイプとの共培養を可能にするウシ初代細胞2Dエンテロイド由来培養システムについて説明します。このモデルは、消化器研究のモデリングにトランスレーショナルな利点をもたらします。...

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

このプロトコルでは、網膜のシナプス回路とタンパク質の局在の探索に焦点を当てて、免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みの詳細な手順を概説しています。...

免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みによる網膜回路と分子局在の研究

腸内グリアは、腸の恒常性や術後合併症を含む疾患プロセスにおける役割についてますます認識されるようになっています。緊急の探索的開腹術から回復した馬の患者は、炎症性術後疾患のリスクが高いことに苦しんでおり、研究のために再現性のある馬の腸内グリア初代細胞培養を確立することの重要性が強調されています。...

馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用

この研究は、皮外(EC)免疫を通じてマウスの免疫応答を調節する皮膚の役割を示しています。タンパク質抗原によるEC免疫は、接触過敏症の免疫応答を抑制したり、病原体に関連する分子パターンと組み合わせることで皮膚誘発性の抑制を逆転させることができます。EC免疫は、針を使わない効果的な免疫療法として有望視されています。...

上皮誘導免疫調節のマウスモデル

学ぶ、IgE依存性メディエーター遊離を測定するアッセイ法。ラット好塩基球性白血病細胞に馬FcεRIα遺伝子を導入し、アレルギー反応のメカニズム解明と治療法開発に貢献する。

開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのIgE

さらに動画を探す