開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのIgE
November 1st, 2014
現在の研究は、ウマのFcεRIα遺伝子を持つラット好塩基性白血病細胞のトランスフェクションに基づく遺伝子操作アッセイシステムの開発と応用を説明しています。トランスフェクションされた細胞は、アレルギー反応のメディエーターの放出がIgEと抗原によって活性化される機能的な受容体を発現します。
次の実験の全体的な目標は、RAD 好塩基球白血病細胞からの IgE 依存性メディエーター放出の量を測定することです。アレルギー症状は、ヒスタミンなどのメディエーターの放出によって引き起こされます。さて、ヒスタミンは好塩基球によって放出される唯一のメディエーターではなく、肥満細胞です。
これらの細胞によって放出されるすべてのメディエーターの合計は、即時および遅延型の過敏症の徴候と症状をもたらします。現在、アレルギーに苦しんでいる生物は人間だけでなく、犬や馬も同様に苦しんでいます。研究をさらに発展させ、ワクチンなどのアレルギーに対する治療法を見つけるためには、研究治療から放出されるメディエーターの量(存在する場合)を定量化するための放出アッセイが必要です。
これが、このリリースアッセイの理由です。RBLメディエーターリリースのヒトシステム用アッセイは、1986年にIanとHookによって初めて開発され、発表されました。その後、DOCシステム用に開発され、現在は馬用システム用に開発されました。
修飾は、目的のタンパク質を変更するのと同じくらい簡単です。細胞株のニュースは、ラット・バソ白血病またはRBLの2つのH 3.1細胞株で、ウマの高FNT ffcセリンR1受容体のアルファ鎖を500, 000細胞/ミリリットルの細胞密度に発現していました。目的のIgE抗体を、1ミリリットルあたり1ナノグラムの最終濃度まで添加します。
100マイクロリットルの混合物を96ソイルプレートに加え、37度で16時間インキュベートします。これにより、細胞がウェル表面に接着し、抗体がその受容体洗浄に結合します。残りの未結合抗体と死細胞を含む培地の2倍に、100マイクロリットルの温かい37度の放出バッファーを加えます。
最後の洗浄から緩衝液を廃棄し、目的の濃度で目的の抗原100マイクロリットルと交換します。37°Cで20分間インキュベートした後、放出メディエーターを含む50マイクロリットルのSUPナチンを新しいウェルに移し、残りの上清を50マイクロリットルのTriton Xバッファーに交換して細胞を結合し、残りのメディエーターを細胞内に放出します。200万モルベータhxの50マイクロリットルで。
基質をクエン酸緩衝液に溶解する日が数日。37度で2時間のインキュベーション後、各ウェルに150マイクロリットルのトリスバッファーを加え、ウェルを黄色に変えます。16時間後に405ナノメートルで色吸光度を測定します。
放出アッセイバッファー(別名Ian Buffer)を37°Cで温めます。また、放出バッファー中の抗原の濃度勾配を濃度で調製します。ゼロ0.1 1 10、100、1000および10、000ナノグラム/ミリリットル。
その後、37度で温まります。皿をすばやくフリックしてメディアを取り出し、ウェルの壁に向かって100マイクロリットルの温かい放出バッファーをそっと追加して、ウェルを洗います。これは、温度差による細胞ストレスを軽減し、メディエーターを早期に放出させるためです。
皿は二度洗う必要があります。最終放出バッファーを廃棄し、100マイクロリットルの抗原を洗浄して追加し、ネガティブコントロールのA列の抗原濃度ゼロから始めて、B列からG列への濃度勾配を下り、最後にTriton Xスライス、H列のバッファーH.That.That's for positive control.プレートを37度で20分間インキュベートします。
これは、インキュベーション期間後に細胞がメディエーターを放出するポイントです。各ウェル内の液体50マイクロリットルをそれぞれのウェルに移します。カラム 7 から 12 で、1 から 6 の位置に残った液体を完全に排出して廃棄し、50 マイクロリットルの Triton X 溶解バッファーと交換します。
準備した基質の50マイクロリットルを皿の96ウェルすべてに加えます。37度で2時間インキュベートします。ベータHは、何日も基質を4つのニトロフェノールに逆転します。
インキュベーション期間後、150マイクロリットルのトリスバッファーを追加して反応を停止し、4つのニトロフェノールを黄色に変えます。405ナノメートルのプレート分光光度計を使用してプレートを読み取ります。吸光度データを測定した後、ウェル位置Aの細胞内のメディエーターの総量を1つ掛けて計算します。
位置 a a に 7 x 2 で対応するウェルがあり、結果を a a 1 の値に加算します。これは、実験中に、放出メディエーターの対抗Aを含むスーピネートがあり、それを新しい井戸対抗に移したためです。7です。
残りのウェルについても計算を繰り返します。坑井対抗体における放出メディエーターの割合を算出し、算出した細胞内のメディエーター総数からA7の位置値に2を乗じて算出する。繰り返しになりますが、実験中には、リースメディエーターを含むスーパーナートがあります。
それを新しいものに移すと、その製品に100を掛け、その製品をその位置の細胞内のメディエーターの対応する合計値で割ります。これにより、うねりのリリースメディエーターの割合がわかります。各列の6つの膨潤は、同じ濃度の抗原平均によって挑戦されるため、残りのウェルについても計算を繰り返します。
これらの値と標準偏差の計算は、次のようにこれらの値をグラフにプロットします。グラフは、抗原濃度が増加すると、1ミリリットルあたり100ナノグラムでピークに達するまでより多くのメディエーターが放出され、その後、抗原濃度の増加とともにメディエーターの放出が減少することを示しています。最終的な実験結果は、グラフB.The control release assay in light blueはIgE抗体を含んでいないため、抗原濃度の増加によるメディエーター放出の変化を示さない。
これを、IgE抗体が含まれている可能性のある濃い青色の実験結果と比較してください。これは、抗IgEワクチンの安全性が試験されている例です。この赤のグラフから、抗IgE血清が細胞表面の受容体を架橋し、紫色のポジティブコントロールと灰色のネガティブコントロールが灰色で見られるように、RBL細胞を脱顆粒させることが明らかになり、このワクチンは安全でないことがわかります。
このアッセイは、メディエーターの放出を測定することができるので、またはその遅延を測定することができるので、潜在的な抗アレルギー薬またはワクチンも人間の犬または馬のシステムに適応させることができる、アッセイが示されているように、抗アレルギー抗体を試験するときにメディエーターの放出の成功したブロッキングまたは失敗したブロッキングを決定することができる。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究は、馬のFc蔚RI伪遺伝子を転染したラット好塩基性白血病細胞を利用した遺伝子工学的アッセイシステムに焦点を当てています。このシステムはIgEと抗原に対するメディエーター放出の測定を可能にし、アレルギー反応の理解に不可欠です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- アレルギー研究
- 細胞生物学
背景
- アレルギー反応はヒスタミンのような物質の放出によって媒介されます。
- 人間や犬や馬などの動物もアレルギーに苦しむ可能性があります。
- メディエーター放出の理解はアレルギー治療法の開発に不可欠です。
- 放出アッセイは研究においてメディエーターを定量化するために必要です。
研究の目的
- IgE依存性メディエーター放出を測定するための信頼性の高いアッセイを開発すること。
- 様々な生物におけるアレルギー反応の理解を深めること。
- ワクチンを含む潜在的な治療法の開発を促進すること。
使用された方法
- ラット好塩基性白血病細胞への馬のFc蔚RI伪遺伝子転染。
- IgEと抗原による受容体の活性化でメディエーター放出を誘発すること。
- アレルギー反応を評価するために放出されたメディエーターを定量化すること。
- 実験的アッセイに遺伝子工学細胞株の利用。
主要な結果
- 転染された細胞は機能的なFc蔚RI伪受容体を成功裏に発現させます。
- IgEと抗原の活性化は測定可能なメディエーター放出につながります。
- このアッセイはアレルギー反応を研究するためのプラットフォームを提供します。
- 結果はアレルギーメカニズムの理解に貢献します。
結論
- 遺伝子工学アッセイはIgE媒介反応の研究に効果的です。
- この調査結果は将来のアレルギー治療法開発に情報を提供できます。
- このアプローチは様々な種におけるアレルギー反応の研究を強化する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This assay system enables quantitative assessment of IgE-dependent mediator release in an equine model, supporting target validation and mechanistic de-risking in allergy therapeutic development. By providing a reproducible platform to evaluate IgE-FcεRI interactions, it aids in preclinical screening of biologics such as anti-IgE vaccines or monoclonal antibodies. The model offers translational continuity across species, facilitating cross-species extrapolation of pharmacological profiles and safety assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of equine IgE-FcεRI binding affinity and receptor functionality.
- Operational Value: Provides a standardized cell-based system for evaluating target engagement in allergic pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming receptor-mediated signaling before in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Utilizes β-hexosaminidase release as a quantitative, scalable readout for mediator secretion.
- Reproducibility: Demonstrates consistent dose-dependent responses across antigen concentrations, supporting assay robustness.
- Platform Adaptability: Can be modified for human, canine, or equine systems, enabling cross-species assay reuse.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological allergic responses observed in horses, which mirror human and canine hypersensitivity.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical evaluation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go decisions based on mediator release profiles and safety signals.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for allergy-focused biologics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of IgE receptor interactions and pathway clarification in mast cell/basophil activation.
- Screening: Enables evaluation of therapeutic candidates (e.g., anti-IgE antibodies) for their ability to block or induce mediator release.
- Analytics: Generates quantitative mediator release data (e.g., peak at 36.68% ± 4.88% at 100 ng/mL antigen) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanism to preclinical safety and efficacy evaluation in animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for allergic disease model development across multiple species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming functional receptor expression and signaling.
- Operational Value: Delivers a standardized, quantitative assay with defined controls and measurable outputs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of biological activity or safety concerns.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of allergy therapeutics based on mechanistic de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and immunological assay techniques.
- Dependent on fluorescence or colorimetric detection infrastructure (e.g., plate reader at 405 nm).
- Necessitates standardization of cell density, IgE sensitization, and antigen titration across laboratories.
- Requires adaptation of antigen concentrations and incubation times when applied to different species or models.
- Limited to in vitro mediator release and may not reflect full in vivo pathophysiological complexity.
