レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

この手順の全体的な目標は、スライド上の組織切片からドーパミンニューロンを分離することです。これは、最初に凍結腹側中脳組織を様式化されたスライドまたはペン膜スライドのいずれかに切片化することによって達成されます。次に、ドーパミンニューロンを迅速な蛍光免疫組織化学で標識します。

次に、組織を脱水し、レーザーキャプチャー顕微鏡にロードします。次に、標識されたドーパミンニューロンを赤外線レーザーを使用してLCMキャップに結合し、目的のRNAまたは分子を単離します。その結果、レーザーキャプチャー顕微鏡を用いた定量的PCR測定には、十分な量と質のRNAが得られることが実証されました。

肉眼的解剖やマイクロパンチなどの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、個々の細胞集団を分離したり、非常に離散的な脳領域にしたりできることです。RNA単離ディップの準備をするには、セリーヌ調製スライドまたはポリエチレンメチル化ガラススライドまたはペン膜ガラススライドを除染溶液に入れ、RNAフリー水を使用してそれらを3回洗浄し、段階的な一連のRNAフリーエタノールを使用してスライドを脱水し、スライドを脱水し、クライオスタットで30分間真空乾燥し、10ミクロンの厚さで組織切片を切断し、調製したRNAにマウントします。フリースライドは、RNAの品質を維持するために、切片化中にサンプルを凍結します。

次に免疫組織化学を実施します。疎水性ペンを使用して組織の輪郭を描き、1対1のアセトンメタノール溶液で乾燥させます。組織をマイナス20°Cで10分間固定します 組織を冷凍庫から取り出した後、切片を100〜200マイクロリットルのチロシンヒドロキシラーゼ抗体NPBSと1%トリットンで10分間覆います。

次に、Alexa Fluor 4 88で標識された100〜200マイクロリットルのヤギ抗ウサギIgGで切片を覆う前に、1%ttrittonを含むPBSを使用してスライドをすすぎ、5分間インキュベートした後、PBSを使用してスライドを2回すすぎます。次に、このビデオで前述したように、サンプルを統合した一連のRNAフリーエタノールをそれぞれ30秒間脱水します。キシレンで1分間と2秒間インキュベートし、5分間洗浄します。

LCMに使用する直前にスライドを取り外し、風乾させます。LCMキャップとスライドをロードし、テキストプロトコルに従ってLCMシステムを設定した後、IRレーザーキャプチャを調整して強度を向けます。キャプチャレーザーツールバーの組織から離れたスライドの領域にキャップを置きます。

[有効]を選択し、レーザーのパワーパルスとヒット数を調整します。キャップがスライドの組織のない部分にかぶさっているときにIRレーザーを発射し、レーザーがLCMキャップメンブレンを十分に溶かすかどうかを確認します。IRレーザー強度を調整した後、右クリックしてキャプチャレーザーを選択し、クラインプレップスライドから個々のドーパミンニューロンにLCMを実行するようにレーザーを向けます。

まず、関心領域に移動して細胞を捕捉し、クライン調製側から個々の細胞を捕捉します。microdissectionツールバーで、LCMタブを選択し、次にシングルポイントアイコンを選択します。次に、顕微鏡ツールバーで、シャッタータブを使用して蛍光と明視野を切り替え、蛍光フィルタータブを使用して適切なフィルターを選択し、対物レンズタブを使用して倍率を変更します。

対象のセルがライブビデオウィンドウに表示されたら、対象のセルをマークするために使用されるスポットサイズをセルのおおよそのサイズに調整します。目的のセルをマークするには、シングルポイントアイコンを選択し、セルをクリックします。Microdissectionツールバーで細胞にマークが付けられたら、「Go Cut and capture」タブを選択すると、選択したマークされたすべての細胞にIRレーザーが自動的に発射されます。

キャップを切片から離し、スライドの開いた領域に移動して、細胞がLCMキャップに捕捉されているかどうかを確認します。組織の収集が終了したら、キャップを右クリックしてキャップを移動し、テキストプロトコルに概説されているように移動してからアンロードを選択し、免疫組織化学用に処理されたスライドをガイドとして使用して、ペン膜上の組織から関心領域を選択します。マイクロ解剖ツールバーで、[カットとキャプチャ]タブを選択し、次に[カットライン]タブを選択し、免疫組織化学ラベルスライドをガイドとして使用して、10 x対物レンズの下で関心領域の輪郭を描きます。

前に示したように、IRレーザーとUVレーザーをテスト、発射、および照準します。このビデオでは、microdissectionツールバーで、Go Capture and Cutタブを選択します。次に、LCMキャップを組織から外して、組織が切片から取り除かれ、キャップに取り付けられているかどうかを確認します。

キャップを取り外すために組織の収集が終了したら、キャップを右クリックして移動を選択し、これらの図の顕微鏡写真をアンロードすると、LCMを使用して細胞の最も一般的な用途がRNA分析であるため、LCMはIRレーザーまたはIRおよびUVレーザーを使用して個々のチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ドーパミンニューロンを単離できることを示しています。提示された手順は、18 S ピークと比較して RRNA 28 S ピークの高さが相対的に減少したことからわかるように、RNA の完全性を保持するように最適化されました。免疫組織化学後の LCM サンプルでは RNA の品質が低下し、その後、全脳 RNA と比較してアセトン固定が行われました。生理食塩水調製の腹側ティール領域からドーパミンニューロンからL-C-M-M-R-N-Aを介して獲得されたニューロンから得られるRNAの量を測定するために、スライドは、マイクロリットルあたり合計17.3、24.8、および50.9ピコグラムが生成され、それぞれ5、100および200のドーパミンニューロンから単離された標準曲線に基づいて単離された。

Eは、QPCRを使用してRNAの品質を測定し、ドーパミンニューロンからの全脳RNAおよびRNAの濃度の範囲を逆転写し、ベータアクチン遺伝子を測定しましたこれらの測定値から、マイクロリットルあたり3ポイント55、6、0.82、および20ポイント58ピコグラムの濃度が、それぞれ5、100、および200のドーパミンニューロンから計算されました。このビデオを見れば、レーザーキャプチャー顕微鏡を使用して個々のドーパミンニューロンを分離する方法、またはドーパミンニューロンの領域を分離する方法を十分に理解できるはずです。