Name: レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクションと免疫組織化学を組み合わせたドーパミンニューロンの単離法。PEN膜スライドを用いて高品質なRNAを抽出し、qPCRによる分子解析を可能にする神経科学研究手法です。

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この研究は、国立精神衛生研究所(1R15MH084209 - 01A1)、国立神経疾患・脳卒中研究所(R21NS058375-01A2)、国立科学財団(DBI0723080 07070646)によって資金提供されました。

<ol><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Schutze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).</li>
<li>Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+micromanipulation+systems+as+universal+tools+in+cellular+and+molecular+biology+and+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine.</a> Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).</li>
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<li>Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+gene+expression+is+dynamically+regulated+in+the+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+and+is+related+to+expression+of+dopamine+neurotransmission+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).</li>
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<li>Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+studies+of+psychostimulant-induced+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression.</a> Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).</li>
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<li>Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microscopy.</a> Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

LCMは、顕微鏡スライドおよびRNA、マイクロRNA、DNAおよびタンパク質のその後の単離上の細胞又は組織切片からの組織の領域の離散的な集団の解剖のための強力な技術である。これらの技術の感度が向上し、必要な出発物質の量が減少するようなマイクロアレイ、次世代のRNA配列決定、DNAおよびプロテオミクスのエピジェネティックな分析などのハイスループット技術を用いた分析と組み合わせたLCMの使用がますます一般的になってきている8-12。 LCMで、より良い解剖学的分解能はサンプルに対して達成され、これらのサンプルの下流策から理解が大幅に強化される。 LCMの一つの注意点は、それが目的の細胞必ずしも必要ではないが、細胞の純粋な集団の濃縮サンプルを提供することである。精度の限界は、隣接する組織からのいくつかの汚染があることを意味する。しかし、この技術は、対象の細胞を濃縮し周囲の組織および細胞に関連する影響を最小限にし、関心対象の細胞に対する実験的な効果を最大化する。 間接免疫組織化学対ダイレクト LCMは、現在RNAが無傷に保ち、分離およびRNAの測定のために主に利用されているので、非常に重要な基準である。 RNAの完全性を維持することは、RNA（ 図10）を低下させる可能性が直接組織を染色する必要性を除去し、組織の切開を案内するための間接的な免疫組織化学の使用の背後にある主な根拠である。実験的な問題は、しかしながら、そのようなドーパミンニューロンなどの細胞の特定の集団の単離を必要とする場合、直接蛍光免疫組織化学が必要とされる。迅速な免疫組織化学標識プロトコールを使用して、処置中にRNAの分解を最小限に抑えることができる。短いインキュベーション時間は、一次及び二次抗高濃度の使用によるものであるボディ、10-20約2時間のインキュベーションとの従来の免疫組織化学のために必要なものより倍高い濃度。しかしながら、より長いインキュベーション時間が必要な場合は、ブラウン·スミスは、RNA分解を阻害し、長いインキュベーション時間（20時間まで）13との良好な品質のRNAを得るために、高塩緩衝液を使用した。組織およびLCMシステムへのアクセスを得るための標識との間に必要なかなりの時間がある場合は、この方法を使用することもできる。 PEN膜、シランプレップとコーティングされていないガラススライド-スライドの選択 LCMのためにコーティングされていないスライドガラスの使用は、14の報 ​​告されている。このコーティングは十分に組織の損失なしに、免疫組織化学のためのスライドに組織を添付し、それでもスライドからLCMキャップに対する組織の着脱を可能にするので私たちの研究室では、シランプレップスライドは、最適な選択であることが判明している。コー​​ティングされていないガラススライドを持っている免疫組織化学手順をいくつかの組織の損失を示した。間接的な免疫組織化学を使用する場合、しかし、組織保持はそれほど問題となる。シランプレップスライドのオフ適切な脱水、捕獲細胞や組織の問題ではなかった。この論文に記載さニューロンまたは脳領域を単離するための様々なアプローチの各々は、長所と短所がある。個々のドーパミンニューロンの単離のために、シラン準備スライドの使用は、より良い光学系の利点を有し、PEN膜スライドよりも安価である。欠点は、不十分な脱水がある場合、時々捕獲細胞が困難であるということである（下記参照）、いくつかの組織は、スライド上に残してもよい。 PEN膜スライドの利点は、IRレーザー、UVレーザーの組み合わせを使用すると、ドーパミンニューロンが収集されることを保証することである。それは、スライドガラスよりも脱水にあまり依存しないようにPEN膜から細胞が回収されない場合、発生することはほとんどないスライドします。アン<html>追加の利点は、UVレーザは、より密接にIRレーザーをガラススライドから離れニューロンを捕捉するための円と比較して、関心のあるニューロンの形状を近似するために使用することができることである。組織領域の単離のために、PEN膜スライドははるかに優れていると追加コストを正当化する。膜上で切り出した全ての組織の完全な除去は、このアプローチの結果は、単独のIRレーザーを使用して、組織の大きな領域を捕捉し、より厚い組織切片を採取することができるよりもはるかに高速である。唯一のIRレーザーを使用して、LCMキャップ膜全体を完全組織領域にわたって溶融することを必要とする。さらに、組織の不完全なコレクションは、典型的であり、通常、複数の試行が必要です。このPEN膜スライドから組織を単離するよりも時間がかかりますが利用可能な組織をガラススライド上に既にあるか、UVレーザが利用できない場合、組織の大部分は（ 図8J）を収集することができるように、これは実行可能な選択肢である。 ove_content &quot;&gt; 重要なステップ 100％エタノールのインキュベーションは、最も重要な工程の一つである。シランプレップスライドから細胞を収集するために、組織の完全な脱水が必要である。そのため、100％エタノールのインキュベーションに主に関連している削除されていないすべての水は、スライドから細胞をピックアップする能力に影響を与えます。この問題に対処するために、しばしば脱水に影響を与えることができる前の洗浄段階からの空気または転送からの水の吸収として、100％のエタノール溶液を変更する。また、モレキュラーシーブは、任意の水の汚染を吸収するために使用される。 LCMシステムは、理想的には、低湿度条件を維持するための除湿機の小さな部屋に配置する必要があります。 グッドクライオスタットのセクションでは、適切なLCMのために重要である。切片は最小化された組織における襞に平らにしておく必要があります。 LCMキャップとの間の距離を増加させ、tと接触するのを防止する組織にひだ彼は組織。その後、十分に組織上に膜キャップを溶融することが困難になる。スライドガラスは、典型的には、セクションの厚さは6と12ミクロンの間である必要がある。厚い部分は、PEN膜、スライドを撮像することができる。 LCMは、顕微鏡スライドからの組織および細胞の非常に正確な解剖をする技術的能力を提供しています。これは劇的に組織片の肉眼解剖と比較して、さらなる分析の分解能を増加させる。 LCMは、時間と労力を要することができ、が、他のハイスループット技術と組み合わせると、離散細胞または解剖学的領域が使用される場合、非常に生物学的プロセスの理解を高めることができ、広範囲の訓練又は専門知識を必要としない。

<html>すべての組織は、細胞のヘテロ接合個体群で構成されています。これはグリア細胞（オリゴデンドロサイト、ミクログリアとアストロサイト）の様々なタイプに囲まれ、様々な形態学的および/または神経化学的に異なる神経細胞からなる、脳組織のために特に関連する。さらに、このような皮質または脳幹の核の領域のような脳内の別個の領域は、特定の機能を有する。したがって、分析技術と組み合わせた場合、細胞の特定の集団または微小解剖学的に別個の領域を分離する能力（ すなわち 、Q-PCR、マイクロアレイ、RNA配列決定、およびプロテオミクス）は、著しく多様な生物学的プロセスの理解を高めることができる。 LCMは、RNA、マイクロRNA、DNAおよびタンパク質などの様々な分子のさらなる分析のために、はるかに均一な供給源を提供する顕微鏡スライド上の組織から非常に離散的な解剖学的領域または特定の細胞を分離する能力を提供する技術である。 トン&quot;&gt; LCMが最初に導入されて以来、いくつかの異なるアプローチが組織1-3から細胞を顕微解剖するために使用されている。最古のアプローチは、赤外線（IR）レーザー及び熱可塑性フィルムと非を使用して、スライド上の組織の直接結合が含まれ接触方法チューブに細胞または組織とコレクションを切り離すためにレーザーを切断紫外線（UV）を用い、その後、LCMが正常組織および細胞型の様々な使用および下流の分析のための種々の分子の単離と互換性があることが示されているRNA、マイクロRNA、DNA、酵素活性1,4-7を含むタンパク質を含む。ここで、LCM切削UVレーザーを使用してLCMシステムおよび細胞または組織の周りに切断し、それを取り付けるためのキャプチャIRレーザーを用いて実証されているLCMキャップは、それぞれ、このLCMシステムは、プラスチックフィルムに細胞を付着し、tからそれを除去する目的の細胞または組織の上にキャップにプラスチックフィルムを溶融するIR捕捉レーザーの両方を使用してキャップを除去しながら、彼は組織（ 図1）。さらに、IRレーザーと組み合わせて、UVレーザーカットアウトするその後IRレーザー（ 図2）を使用してLCMキャップに組織を取り付けることによって単離した膜を有するスライド上に載せた組織から目的の組織または細胞を利用可能である。これらの技術の概要は、 図1および図2に見られる。 この手法にはいくつかのバリエーションを直接蛍光免疫組織化学および特異的タンパク質の発現に基づいて組織の領域を単離するために使用される間接的な免疫組織化学誘導技術を使用して特定の細胞を単離するためのいずれかに記載されている。具体的には、黒質および腹側被蓋領域および新鮮凍結脳組織からのRNAのその後の単離物の単離からドーパミン神経細胞の単離を示す。 RNAは、測定された分子の最も不安定であるため、目（DNAまたはタンパク質と比較して）RNAの完全性を維持するのに役立つ、EPSは含まれており、データが得られたRNAの量と質に表示されます。

<table><tbody><tr><td>Veritas Laser Capture Microdissection System</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>新しいモデルが販売</td><td></td>されました</tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>CapSure HS LCM Caps</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>LCM0213</td><td></td></tr><tr><td>PEN Membrane slides</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>s4651</td><td></td></tr><tr><td>シラン調製スライド</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol-RNase Free</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol-RNase Free</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Free Triton</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Sieve</td><td>EDM Millipore, Billerica, MA</td><td>MX1583D</td><td></td></tr><tr><td>抗チロシンヒドロキシアーゼ抗体</td><td>EDM Millipore, Billerica, MA</td><td>Ab152</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene MX 3005P</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>401513</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 3300 蛍光分光計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、顕微鏡スライド上の個々の細胞又は組織切片の組織の正確な解剖学的領域の濃縮集団を単離するために使用される。免疫組織化学と組み合わせた場合、LCMは、特定のタンパク質マーカーに基づく個々の細胞型を単離することができる。ここで、LCM技法は、直接、チロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学で及びLCMのために使用されるものに隣接する部分に間接的なチロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学を使用して、腹側被蓋領域の領域を含むドーパミンニューロンの単離のために標識されたドーパミンニューロンの特定の集団を収集するために記載されている。赤外線（IR）レーザーをキャプチャの両方に使用される個々のニューロン、ならびにガラススライドオフおよび分析のためのLCMキャップ上に腹側被蓋領域を解剖する。 100％エタノール及びキシレンと組織の完全な脱水が重要である。 IR捕捉レーザー、紫外線（UV）cuttiの組み合わせngのレーザはPEN膜、スライドを使用した場合、個々のドーパミンニューロン又は腹側被蓋領域を分離するために使用される。 PEN膜、スライドは、より速い組織の大部分を収集して細胞を捕捉し、収集する際に優れた一貫性を提供するように、スライドガラス上で重要な利点を有するスライドからの組織の完全な除去で脱水し、結果にあまり依存している。ガラススライドからの組織の大部分の除去が可能であるが、それはかなり時間がかかり、しばしば背後にあるいくつかの残存組織を残す。ここに示したデータは、十分な量および質のRNAを定量PCR測定のためのこれらの手順を使用して得ることができることを示している。 RNAとDNAがマイクロRNAのLCM、分離および測定を採取した組織や細胞からの最も一般的に単離された分子であるが、DNA中のタンパク質およびエピジェネティックな変化はまた、強化された解剖学的および細胞の解決方法を利用することができますLCMを使用して得られた。

図6及び図7における顕微鏡写真は、個々のドーパミンニューロンの単離のための能力を実証する。一貫してLCMに製造することができる最小のスポットサイズは​​、セルを分離するためにキャップ現在の解剖学的分解能は、約5〜10μmである。特定の細胞型の単離のための唯一の制限は、細胞を可視化する能力である。 LCMは、個々のドーパミンニューロンを単離することができるが、隣接する非標識細胞の部品の汚染が最も起こりやすい。そのため、最終サンプルはドーパミンニューロンの濃縮コレクションではなく、ドーパミンニューロンの純粋な集団である。この技術は、腹側被蓋領域の分離を示すような脳内の離散的な核または領域のような組織の小さな領域を分離することが可能である。以前の刊行物は、脳組織におけるこの使用を実証しているだけでなく、正常組織5,11からの病理組織を単離する。 <pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt; LCMを用いて単離された細胞および組織の最も一般的な使用は、RNA分析であるため、提示手順はRNAの完全性を維持するために最適化した。 LCM以下のままであったRNAの品質を決定するために、RNAは、いずれかのアセトン中で急速チロシン水酸化酵素、蛍光免疫組織化学手順又は固定後、LCMの後、スライド上の組織から、シリカベースのスピンカラムを用いて単離した。 RNAの品質を測定し、市販の全脳RNAからのRNAの値（ 図9）と比較した。 RNA品質は、全脳RNAと比較して、アセトン固定（RIN 2.6）、続いて免疫組織化学の後に低い整合性LCMのために使用される組織からのRNAサンプル（RIN利用できない）に減少したの相対的減少によってわかるように（RIN 8.2） S18のピークに比べrRNAのS28ピークの高さ。しかし、RNAは、18Sおよび28Sバンドを維持し、遺伝子発現をQ-PCRを用いて測定することができる。 <p class= &quot;jove_contentは&quot;&gt; LCMを介して取得したニューロン、ドーパミンニューロン（50、100および200ドーパミンニューロン）から得られたRNAの量を測定するために、シランプレップスライドから腹側被蓋領域から単離した。 RNAは、シリカベースのスピンカラムを用いて単離し、RNAの量を測定した。作成した標準曲線に基づいて、17.3の合計、24.8頁および50.9 pgの/μlの50,100および200ドーパミンニューロン、それぞれ（ 図10A）から単離した。 Q-PCR、逆転写されたドーパミンニューロンからの全脳RNAおよびRNAの濃度の範囲、以前5に記載のようにQ-PCRを用いて測定したβアクチン遺伝子をRNA量を測定した。これらの測定に基づいて、3.55、6.82および20.58頁/μlの濃度は、50、100及び200ドーパミンニューロン、それぞれ（ 図10B）から算出した。 ドーパミンニューロンの単離は全体Vの分離と比較する方法を実証するために、entral LCMと被蓋野、ドーパミンニューロン特異的遺伝子（Nurr1は、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン輸送体）は、サンプルのこれらの二つの異なる種類のQ-PCRで測定し、βアクチンの発現（ 図11）と比較した。低いC t値は、対象の遺伝子のより高い濃度で生成されるので、ΔCtの減少は、βアクチンのために相対的なドーパミンニューロン遺伝子の発現の増加を示している。これは、個々のドーパミンニューロンの単離はドーパミンニューロン特異的遺伝子の発現を集中方法を示しています。腹側被蓋領域サンプルにおいて、ドーパミンニューロン特異的遺伝子は、βアクチンを発現するが、ドーパミンニューロンの遺伝子を発現していないにも収集することができる他の細胞（非ドーパミン作動性ニューロン及びグリア細胞）のようにして希釈する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strongの&gt;赤外線（IR）捕捉レーザーを用いて、図1のレーザーキャプチャー。小さなプラスチックLCMキャップは、ガラススライド（ステップ1）に取り付けられた組織の上に配置される底部上の膜を有している。目的の組織または細胞が特定されると、IR捕捉レーザは、下にある組織/細胞（ステップ2）の上に、膜中の小さなくぼみを溶融するLCMキャップを介して発射される。 LCMキャップが除去されると、組織は、顕微鏡スライドから除去され、LCMキャップに付着したままである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> 赤外線（IR）捕捉レーザー、紫外線（UV）レーザーカッティングを用いて、図2のレーザー·キャプチャは、組織の大きな領域を取得またはUVレーザを用いた細胞の回収を容易にするために、組織は、膜とスライド上に搭載されている外側のコーナー（PEN膜スライド）に沿ってスライドに接続。 LCMキャップをt上に配置される彼組織及びIR捕捉レーザーキャップ膜を溶融し、LCMキャップに組織を取り付けるために使用される（ステップ1および2）。 UVカットレーザーは、次に（ステップ3および4）スライド膜および組織を切断するために使用されるキャップが取り外されたとき、そのような組織がスライドから除去し、LCMキャップ（ステップ5）上に残っている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムのロードマップ。図は。このレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムは、一度に3スライドのスペースがあります。スライドを顕微鏡にロードされるとき、各スライドの低倍率ロードマップ画像が生成される。ロードマップの画像上の領域を選択すると、その領域へのライブ画像ウィンドウに移動します。デモンストレーションの目的で、マウスの脳は3スライド上に10μmのセクションに区分した。最初のスライドは、チロシンヒドロキシラーゼのために標識したimmunoreactiviクロマゲン（A）としてジアミノベンジジンを用いて、TY。切片を、シラン-プレップスライド（B）またはPEN膜スライド（C） ​​のいずれかに取り付けた。これらのスライドの両方が急速蛍光チロシ​​ン水酸化免疫組織化学を使用して標識した。 （C）中の矢印は、スライドガラスにPEN膜の付着を示す。この境界の外ませ組織はLCMで採取することはできません。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> 図4. IR捕捉レーザーを使用した。IR捕捉レーザLCMキャップに組織に付着し、組織の残りの部分から取り外しLCMキャップ膜を溶融するために用いられる。 IR捕捉レーザは、下にある組織とスライドガラスに接触するように十分にLCMキャップ膜を溶融するために十分な強度でなければならない。レーザーが、膜を融解するには不十分であったときに上記画像が実証スライドに（2スポットを左）。溶融した膜は、スライドガラスに接触すると、太い黒い輪郭（右スポット）を観察することができる。レーザの強度は、電源（3-100 mW）と、パルス（100-1,000,000秒）及びレーザーの＃ヒット数を変えることによって調整することができる。さらに、同じスポットにおけるIRレーザーの繰り返し発射はさらに、膜を溶かすことができる。 IRレーザーの目的は、いつでもLCMキャップを移動させるか、目的が変更されたときに調整される必要がある。スケールバー=100μmである。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> 図5. UVカットレーザーを使用した。UVカットレーザPEN膜および組織を切断するために使用される。 UVレーザは、組織を損傷する可能性があるので、膜および組織を切断するのに必要な最小強度を使用する前に決定する必要がある。上記の、異なるUVレーザー強度の3つのスポット（矢印）がで示されている<html> 10μmの切片、厚い部分のための中間点と高すぎるUVレーザ強度​​を示す適切な場所に十分な左スポットサイズ。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> IRレーザーを使用して、チロシン水酸化酵素免疫反応性ニューロンの図6.直接単離。ドーパミンニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（A）のための迅速な蛍光標識後に示されている。 IRレーザがこれらのニューロン（D）上のLCMキャップ膜を溶融発生したときに、キャップの除去は、スライド（B、E）から離れ、これらの細胞を取り出す。 LCMキャップ（C、F）に取り付けられ、これらのニューロンは、その後可視化することができる。スケールバー=250μmの。= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> IRお ​​よびUVレーザーを使用して、PEN膜スライドからチロシン水酸化酵素免疫反応性ニューロンの図7.直接単離。チロシンヒドロキシラーゼラベルニューロンは（A）の上に示されている。これらのニューロンはIRレーザーを使用してLCMキャップに取り付けられており、UVレーザー（B）を用いたPEN膜のスライドから切断することができる。スケールバー=250μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> 図8.間接<html>チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性を用いて、腹側被蓋領域の単離。腹側被蓋領域におけるドーパミンニューロンの位置は、標準的な免疫組織化学的手法（A及びE）を使用してセクションで可視化した。この免疫組織化学標識部分は、染色されていない隣接部分（B及びF）で腹側被蓋領域を見つけるための鋳型として使用した。 UVレーザーを用いて、腹側被蓋領域は、IRレーザーでLCMキャップに取り付けられており、UVレーザー（CおよびD）でスライドから切断し、HS LCMキャップ（D）に取り付けられて示された。唯一のIRレーザーを用いたシランプレップスライドから単離された腹側被蓋領域はまた、マクロキャップ（FK）に取り付けられて示されている。複数の試みは、この領域（GおよびJの比較）からの組織の大部分を収集するために必要であることに注意してください。スケールバー=500μmの。PLOAD / 52336 / 52336fig8large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> 図9 RNA品質代表的電気泳動図であり、市販全脳RNA（A）およびRNAアセトン固定およびLCM（B）の後の節から単離されたまたは迅速な蛍光チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学およびLCM（C）の関連したゲル画像。 RNA品質は、全脳RNAと比較して、免疫組織化学のために処理セクションに減少したものの、電気泳動図は、rRNAのS18及びS28のピークの存在に基づいて、主に無傷のRNAを示す。全脳RNA濃度は、8.2のRINと6.487 PG /μlであった。アセトン固定組織RNA濃度は、2.6のRINと5.036 PG /μlであった。 RNAは、免疫組織化学の時間後に得られた<html>広告4.474 PG /μLとRINの濃度は使用できませんでした。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> 図10. RNA量は。LCMを用いて得られたニューロンにおけるRNAの量を決定するために、RNA濃度の標準曲線は、蛍光分光器およびQ-PCRを用いて製造した。蛍光分光測定（A）の場合は、大規模なグラフは、RNA量の高い範囲を示しており、小型のグラフは、10 PG /μlにダウンこのアッセイの感度を示している。 50、100及び200ドーパミンニューロンから得られたRNAの濃度は、それぞれ、17.3、24.8および50.9 pgの/μlであった。 RNA量（B）を測定するためにQ-PCRを用いて、RNAの濃度は、50、100及び200ドーパミンニューロンから得られた、それぞれ、3.55、6.82および20.58頁/μlであった。 ES / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; 個々のドーパミンニューロンの分離とドーパミンニューロン特異的な遺伝子の図11.集中。ドーパミンニューロンのサンプル中のドーパミンニューロン特異的な遺伝子（のNurr1、チロシンヒドロキシラーゼ、およびドーパミントランスポーター）及びβアクチンの間のC T（ΔCtの ）の違いLCMで単離し腹側被蓋領域に示されている全体の腹側被蓋領域の解剖における発現と比較した。低いC t値は、対象の遺伝子のより高い濃度で生成されるので、ΔCtの減少は、他の細胞（非ドーパミン作動性ニューロン及びグリア細胞）としてβアクチンする相対ドーパミンニューロン遺伝子の発現の増加を示すであろうβアクチンを発現するが、ドーパミンニューロンの遺伝子を発現しない腹側被蓋領域サンプルに収集することができる。

個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

この手順の全体的な目的は、スライド上の組織切片からドーパミン神経細胞を単離することです。まず、凍結させた中脳腹側組織を、定型スライドまたはペン膜スライドに薄切します。次に、迅速蛍光免疫組織化学染色を用いてドーパミン神経細胞を標識します。その後、組織を脱水し、レーザーキャプチャー顕微鏡にセットします。次に、赤外線レーザーを用いて、ラベル付けされたドーパミン作動性ニューロンをLCMキャップに回収し、RNAまたは目的の分子を単離します。その結果、レーザーキャプチャー顕微鏡を用いることで、定量PCR測定に十分な量と品質のRNAが得られることが示されました。この手法の既存の方法（肉眼的解剖やマイクロパンチなど）に対する主な利点は、個々の細胞集団や非常に限定的な脳領域を単離できることです。RNA抽出の準備として、セリン調製スライド、またはポリエチレンメチルメタクライト（PEM）膜ガラススライドを除染溶液に浸し、RNaseフリー水を用いて3回洗浄した後、段階希釈したRNaseフリーエタノールを用いてスライドを脱水し、真空乾燥で30分間乾燥させます。クライオスタットを用いて組織を10 µmの厚さで切片にし、調製したRNaseフリースライドに作製します。RNAの品質を維持するため、切片作成中はサンプルを凍結させたまま保持してください。次に、免疫組織化学染色を行います。疎水性ペンで組織を囲み、乾燥させます。その後、アセトンとメタノールの1:1混合溶液を用い、-20 °Cで10分間組織を固定します。フリーザーから組織を取り出した後、tyrosine hydroxylase抗体、NPBS、および1% Tritonを含む溶液100〜200 µLを切片に滴下し、10分間静置します。次に、1% Tritonを含むPBSでスライドを洗浄し、Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgGを100～200 µL滴下して切片を覆います。5分間インキュベートした後、PBSでスライドを2回洗浄します。続いて、このビデオの前半で示した通り、無水エタノールを用いてサンプルを段階的に脱水し、それぞれ30秒間処理します。キシレン中で1分間インキュベートし、さらに5分間洗浄します。LCMに使用する直前にスライドを取り出し、風乾させます。LCMキャップとスライドをセットし、テキストプロトコルに従ってLCMシステムをセットアップした後、IRレーザーキャプチャの強度を調整し、照準を合わせます。キャプチャレーザーツールバー上で、スライド上の組織がない領域にキャップを配置します。「enable」を選択し、レーザーのパワーパルスと照射回数を調整します。組織がないスライド上の部分にキャップを合わせ、IRレーザーを照射して、LCMキャップ膜が十分に溶解するかを確認してください。IRレーザーの強度を調整した後、右クリックして「capture laser is here」を選択し、クライン準備スライド上の個々のドーパミン作動性ニューロンに対してLCMを行うためのレーザー照準を合わせます。まず、組織切片の準備標本から個々の細胞を回収するため、目的の領域に移動します。マイクロダイセクションツールバーでLCMタブを選択し、シングルポイントアイコンを選択します。次に、顕微鏡ツールバーのシャッタータブを使用して、蛍光モードと明視野モードを切り替えます。蛍光フィルタータブで適切なフィルターを選択し、対物レンズタブを使用して倍率を変更してください。ライブビデオウィンドウに目的の細胞が表示されたら、細胞をマークするために使用するスポットサイズを、細胞の概算サイズに合わせて調整します。シングルポイントアイコンを選択し、細胞をクリックして目的の細胞をマークします。マイクロダイセクションツールバーで細胞がマークされたら、「go cut and capture」タブを選択します。これにより、選択されたすべてのマーク済み細胞に対してIRレーザーが自動的に照射されます。キャップを切片から離し、スライドの空いている領域に移動させて、細胞がLCMキャップに回収されているかを確認します。組織の回収が完了したら、テキストプロトコルに記載されている通り、キャップを右クリックして「move to」を選択し、「unload」して移動させます。免疫組織化学染色用に処理したスライドをガイドとして、ペンメンブレン上の組織から関心領域を選択します。マイクロダイセクションツールバーで「cut and capture」タブを選択し、次に「cut line」タブを選択して、免疫組織化学染色ラベル付きスライドをガイドにしながら、10 x 対物レンズ下で関心領域の輪郭を描きます。先に実演した通り、IRレーザーおよびUVレーザーのテスト、発光、および照準合わせを行います。このビデオでは、マイクロダイセクションツールバーの「go capture and cut」タブを選択します。その後、LCMキャップを組織から離し、組織が切片から除去され、キャップに付着しているかを確認します。組織の採取が完了しキャップを取り除く際は、キャップを右クリックして「move to」を選択し、アンロードします。これらの図における顕微鏡写真は、IRレーザー、またはIRおよびUVレーザーを使用することで、LCMによって個々のチロシン水酸化酵素免疫反応性ドーパミンニューロンを単離できることを示しています。LCMを用いて組織から単離された細胞の最も一般的な用途はRNA解析であるため、提示した手順はRNAの完全性を維持するように最適化されました。免疫組織化学およびそれに続くアセトン固定後、全脳RNAと比較して、18 Sピークに対するrRNA 28 Sピークの相対的な高さの減少により、LCMサンプルのRNA品質（完全性）が低下したことが確認されました。生理食塩水調製スライドの腹側被蓋野ドーパミンニューロンからL-C-M-R-N-Aを介して得られたニューロンのRNA量を測定しました。作成した標準曲線に基づき算出した結果、5個、100個、および200個のドーパミンニューロンから、それぞれ合計17.3、24.8、および50.9 picograms per microliterが単離されました。qPCRを用いてRNA品質を測定するために、全脳RNAおよびドーパミン作動性ニューロン由来RNAをさまざまな濃度で逆転写し、β-actin遺伝子を測定しました。これらの測定から、5個、100個、および200個のドーパミン作動性ニューロンからそれぞれ3.55、60.82、および20.58 pg/µLの濃度が算出されました。このビデオを視聴することで、レーザーキャプチャーマイクロスコープを使用して、個々のドーパミン作動性ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンの領域を単離する方法について十分に理解できるはずです。

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神経科学

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出典:Kummari, E., et.al., Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area., J. Vis. Exp.

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レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

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