簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

本手順の目的は、定量的・定性的解析および特定のリンパ球サブポピュレーションの単離を行うため、酵素消化を用いることなく、ヒト組織片を迅速に単一細胞懸濁液へとホモジナイズすることです。まず、滅菌メスを使用して組織片を細かく刻みます。次に、組織のスラリーを機械的解離チューブに移し、組織片をさらにホモジナイズして単一細胞懸濁液を作成します。

その後、細胞を遠心分離で回収し、ダウンストリーム解析に用います。最終的に、フローサイトメトリーを用いて浸潤リンパ球やそのサブポピュレーションを解析することが可能です。当研究室がこの手法を開発したのは、腫瘍浸潤リンパ球の自然な状態に大きな影響を与えることなく、イメージングする方法を模索していたためです。

私たちは、手術時の状態のまま細胞を迅速に単離し、分析できる手法を求めていました。この手法は当研究室で300例以上の乳癌腫瘍および正常組織に使用されており、簡便で日常的に運用可能です。また、予後マーカー、治療反応性、および長期的な臨床転帰の検討に利用できます。

本手法の実演を行うのは、私の研究室の技術者であるJohn Nicola Loicです。まず、組織サンプルの重量を量り、次に組織の長さ、幅、高さを測定します。その後、組織片を1 mLの適切な化学的に定義された無血清造血細胞培地を含む小型ペトリ皿に移し、滅菌メスを用いてサンプルを1～2 mm²の小さな断片に細切します。

次に、ディッシュの内容物を機械的解離用Cチューブに移し、2 mLの培地でディッシュとメスを洗浄します。洗浄液をCチューブに加え、0.01の機械的解離プログラムを2回連続で実行し、組織片を穏やかに均質化して単一細胞懸濁液にします。2回目のサイクル後、均質化物を40 µmのセルストレーナーを通して50 mLコニカルチューブにデカンテーションします。

次に、ペトリ皿の洗浄に使用したピペットと同じものを用いて、Cチューブに残っている液体をセルストレーナーに移します。続いて、1 mLマイクロピペットを使用して、ろ過された液体を15 mLコニカルチューブに移し、さらに3 mLの培地でCチューブを洗浄します。この洗浄液をセルストレーナー経由で50 mLチューブに移します。

次に、ホモジナイズされていない組織を1 mLチップでストレーナー上で優しく動かし、組織に閉じ込められた残留液体を最大限に50 mLチューブへ絞り出します。続いて、セルストレーナーを元のCチューブの上に逆さまに置き、さらに3 mLの培地でストレーナーを洗浄して、ホモジナイズされていない組織をCチューブに戻します。先ほど示した手順で組織をさらに2サイクル再ホモジナイズし、この2回目のホモジネートをセルストレーナーに通します。

再度、Cチューブをさらに3 mLの培地で洗浄します。次に、上清をストレーナーでろ過し、先ほど示したように組織から残液を絞り出します。この時点で、15 mLチューブに約2.5 mLの単一細胞懸濁液があり、50 mLチューブに約9 mLがあるはずです。

組織上清と細胞を分離させるため、まず2本のホモジネートが入ったチューブを、室温で600 Gsで15分間遠心分離します。15 mLチューブから上清を1.5 mLチューブに移して4 °Cで保存し、50 mLチューブの上清は廃棄します。次に、各チューブを硬い表面で軽く叩き、細胞ペレットをそれぞれバラバラにします。50 mLチューブ内のバラバラになった細胞ペレットを500 µLの培地で再懸濁し、その細胞を15 mLチューブに移して2つ目のペレットを再懸濁します。

次に、50 mLチューブをさらに500 µLの培地で洗浄し、細胞回収率を最大にするため、その洗浄液を15 mLチューブに移します。トリパンブルー排除法で生存細胞数をカウントした後、細胞懸濁液をペレット化します。最後に、保存しておいた組織上清を遠心分離して回収します。

次に、ペレットに触れたり乱したりしないように注意しながら、上清を少なくとも1本の清潔なチューブに移し、後のダウンストリーム解析のために-80°Cで保存します。これらのグラフには、解離させた腫瘍細胞ホモジネートの代表的なフローサイトメトリードットプロットが、白血球および上皮細胞マーカーに対する特異的抗体で標識した後の状態で示されています。このプロトコルは、CD 45陽性細胞の生存率を著しく変化させることはありません。

しかしながら、生存しているEPAM陽性細胞の相当量に損失が生じます。それにもかかわらず、生存しているEPAM陽性およびCD 45陽性のサブセットは、そのサイズと構造に基づいて、大型の上皮腫瘍細胞、小型の上皮細胞、または大型および小型のCD 45陽性細胞に分離することが可能です。主要な腫瘍浸潤サブセットの代表的なフローサイトメトリー・ドットプロットをここに示します。なお、リンパ球はCD 45陽性細胞の生存性に基づいてゲートされています。

最後に、乳癌上清中に存在するサイトカイン発現量または総免疫グロブリン量を、正常乳腺組織からの上清と比較することができます。この代表的な実験で示されたように、腫瘍組織に関連して両方のタンパク質が増加していることが明らかになります。この手順を行う際は、迅速かつ清潔に作業し、エンドポイント解析に十分な細胞数を確保するために、手順の各ステップで最大限に材料を回収することが重要です。