簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

この手順の全体的な目標は、定性的および定量的分析と特定のリンパ球亜集団の単離のための酵素消化なしで、ヒト組織断片を単一の細胞懸濁液に迅速に均質化することです。これは、最初に滅菌メスを使用して組織片を細かく刻むことによって達成されます。次に、組織スラリーを機械的解離チューブに移し、そこでフラグメントをさらに均質化して単一細胞懸濁液にします。

その後、細胞を遠心分離により回収し、下流の分析を行います。最終的に、フローサイトメトリーは、浸潤リンパ球、亜集団を分析するために使用できます アジア人。私の研究室でこの技術を開発したのは、腫瘍浸潤リンパ球の本来の状態に劇的な影響を与えることなく画像化する方法を探していたからです。

私たちは、細胞を迅速に分離し、手術中の細胞を解析できるものを求めていました。当研究室では300以上の乳房腫瘍と正常組織にこの技術を使用しており、使いやすく、日常的に使用することができます。予後マーカー、治療への反応、および長期的な臨床転帰を調べるために使用できます。

今日、このテクニックを実演するのは、ジョン・ニコラ・ロイックです。私の研究室の技術者 まず、組織サンプルの重量を量り、次に組織の長さ、幅、高さを測定します。次に、組織断片を、1ミリリットルの適切な化学的に定義された無血清造血細胞培地を含む小さなペトリ皿に移し、滅菌メスを使用してサンプルを1〜2平方ミリメートルの小さな断片にさいの目に切ります。

次に、皿の内容物を機械的解離Cチューブに移し、皿とメスを2ミリリットルの培地ですすいでください。洗浄液をCチューブに加え、0.01機械的解離プログラムを2回連続して実行して、組織断片を1つの細胞懸濁液に穏やかに均質化します。2回目のサイクルの後、ホモジネートを40マイクロメートルのセルストレーナーを介して50ミリリットルの円錐管にデカントします。

次に、ピペットでペトリ皿を洗ったのと同じ害虫を使用して、Cチューブに残っている液体をセルストレーナーに移します。次に、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、ろ過した液体を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、さらに3ミリリットルの培地でCチューブをすすぎます。この洗浄液をセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに移します。

次に、均質化されていない組織をストレーナーの周りで1ミリリットルのきれいな先端でゆっくりと動かし、組織に閉じ込められた残留液体を最大量50ミリリットルのチューブに絞ります。次に、セルストレーナーを逆さまにして元のCチューブの上に置き、さらに3ミリリットルの培地でストレーナーをすすぎます。これにより、均質化されていない組織がCチューブに戻ります。今示したように、さらに2サイクルにわたって組織を再ホモジナイズし、次にこの第2のホモジネートをセルストレーナーに注ぎます。

再度、Cチューブをさらに3ミリリットルのメディウムですすいでください。次に、上清をストレーナーでろ過し、示したように組織から残留液体を絞り出します。この時点で、約2.5ミリリットルの単一細胞懸濁液が15ミリリットルのチューブに存在し、約9ミリリットルの単一細胞懸濁液が50ミリリットルのチューブに観察されます。

組織上清を細胞から分離するために、まず遠心分離を行い、ホモジネートの両方のチューブを600Gおよび室温で15分間遠心分離し、15ミリリットルのチューブから上清を1.5ミリリットルのチューブにデカントし、摂氏4度に置き、50ミリリットルのチューブから上清を捨てます。次に、各チューブを硬い表面にそっとたたいて、各細胞ペレットを分解します。緩い細胞ペレットを500マイクロリットルの培地で50ミリリットルのチューブに再懸濁し、細胞を15ミリリットルのチューブに移して2番目のペレットを再懸濁します。

次に、50ミリリットルのチューブを別の500マイクロリットルの培地ですすぎ、洗浄液を15ミリリットルのチューブに移して、細胞の回復を最大化します。トライアンブルー排除ペレットにより生細胞の数を数えた後、細胞懸濁液をペレット化する。最後に、予約した組織の上清をスピンダウンします。

次に、ペレットに触れたり邪魔したりすることなく、上清を少なくとも1つのきれいなチューブに慎重に移し、将来の下流分析のために摂氏マイナス80度で保存します。これらのグラフでは、解離した腫瘍細胞のホモジネートの代表的なフローサイトメトリードットプロットと、続いて白血球に対する特異的抗体と上皮細胞マーカーによる標識が示されています。このプロトコルは、CD 45陽性細胞の生存率を有意に変化させません。

しかし、生存可能なEPAM陽性細胞はかなり失われています。この生存可能なEPAM陽性およびCD 45陽性サブセットは、それらのサイズおよび構造に基づいて、大きな上皮性腫瘍細胞、小さな上皮細胞、または大小のCD 45陽性細胞に分離することができる。主要な腫瘍浸潤サブセットの代表的なフローサイトメトリードットプロットを、CD 45陽性細胞の生存率にゲートしたリンパ球とともにここに示しています。

最後に、乳がん上清中に存在するサイトカイン発現または全免疫グロブリンは、この代表的な実験で実証されたように、正常な乳房組織からの上清と比較することができ、腫瘍組織に関連するタンパク質の両方のタイプの増加が進行する一方、迅速かつ洗浄し、十分な数の細胞を得るために、処置の各ステップで最大量の材料を回復することを覚えておくことが重要です。エンドポイント分析。