構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

次の実験の全体的な目標は、構造質量分析を使用して大きなタンパク質集合体を特徴付けることです。これは、ナノフローエレクトロスプレーイオン化用の金メッキキャピラリーを調製することによって達成されます。第2ステップとして、サンプルを調製し、質量分析計を高質量測定用に校正します。

次に、タンパク質複合体を気相で無傷に保つために、実験条件を最適化します。その後、MSとタンデムMs.Spectraを取得します。MS スペクトルは、インタクトな錯体に質量が対応する電荷状態を示し、タンデム MS 実験では、モノマーとストリップ錯体の会合パターンが得られました。

こんにちは、ホワイトマン科学研究所のミロン研究室のナーム・キバと申します。そして、アイザック・キーです。私もミシュロン研究所の出身です。今日は、構造分光法を適用して大きなタンパク質複合体を分析するための基本的な手順を示したいと思います、そして、私たちの研究室ではこの手順を使用してタンパク質複合体を特徴付け、ストックの形状、組成、および相互作用のネットワークを定義します。それでは始めましょう。

非電流結合タンパク質複合体の解析は、エメプラスまたはクアキャピラリーを用いたエアスプレー免疫法によって行われます。このキャピラリーCは、直径約1ミクロンの細い先端まで引っ張ってから、金などの導電性材料でコーティングすることができます。これらのキャピラリーは、こちらで見ることができるように市販されています。

ただし、使用する方がはるかに費用対効果が高くなります。このガラス毛細管は、eh、冷却した状態に冷却してすぐに使用できる状態にコーティングするよりも、このニードルプーリング装置でコーティングを行い、このehコーティング装置上でコーティングを行う。この手順を開始するには、両面接着パッドの2つのストリップをシャーレの底に取り付け、ストリップを2センチ離します。

パッドの中央にガラス棒を置きます。接着パッドはキャピラリーを所定の位置に保持し、ガラスロッドは準備されたキャピラリーを支え、キャピラリーの先端が壊れるのを防ぎます。外径1mm、直径0.78mmのボリスケイ酸ガラスキャピラリーを使用。

1つのキャピラリーを針に挿入し、キャピラリーを所定の位置にそっと凝集し、加熱フィラメントの中心にくるように位置を調整します。キャピラリーが両端でしっかりと固定されるまで、クランプを静かに締めます。ここに示す事前定義されたプログラムを使用してキャピラリーを引っ張ります。

ただし、プーラーをプログラミングするプロセスは試行錯誤の1つであることを忘れないでください。許容可能な先端形状が得られるまで、引っ張られるすべての毛細管は、2つの最終的な形状の毛細血管を生じさせます。引っ張ったキャピラリーを装置から取り外し、先端を点検し、変形または破損しているものはすべて捨てます。

鈍い位置決めピンセットを使用して、毛細管をペトリ皿に配置します。接着パッドと上部に取り付けられた毛細血管の基部は、先端が上を向いてガラス棒に寄りかかっています。ペトリ皿がいっぱいになるまでキャピラリーを引っ張り続けます。

直径10cmの皿に約80本の毛細血管が入ります。次に、毛細血管を金でコーティングします。プレートを金スパッタローターに挿入します。

ガス供給が製造元の指示に従って選択されていることを確認し、事前定義されたコーティングサイクルをアクティブにします。コーティングは、毛細血管が均一に金色になるまで3〜6回繰り返されます。キャピラリーの準備ができたら、質量分析計の校正に進みます。

MultiPro複合体で行われる実験のほとんどは、このようなal Electrosprayの4回飛行時間型質量分析計によって行われます。水からInupt、これは高い質量のために修正されます。タンパク質サンプルをロードする前に、ヨウ化セシウムを使用して質量分析計を校正します。

まず、精製水にセシウムの100ミリグラム/ミリリットルの溶液を調製し、セシウムは高質量校正に使用されます。単独で帯電した塩のクラスターは、393マストから10、000をはるかに超える充電比までの広い質量範囲に広がっています。鈍いピンセットを使用して、ペトリ皿からコーティングされたキャピラリーを取り出し、2マイクロリットルのセシウム溶液をキャピラリーにロードします。

アイノールゲルをロードしたチップを使用。溶液をキャピラリーの先端に向かってスライドさせます(手動で、またはスピンダウンアダプターを使用します)。キャピラリーをキャピラリーホルダーに挿入し、先端がホルダーの端から約10mm離れるようにキャピラリーを調整します。

キャピラリーを光学顕微鏡の下に置き、鋭利なAAタイプのピンセットを使用して先端をトリミングします。キャピラリー内に流れを妨げる可能性のある気泡がないこと、およびキャピラリーが詰まっていないことを確認することが重要です。さらに、金のコーティングがキャピラリーから剥がされていないことを確認してください。

その場合は、キャピラリーを交換するか、先端をトリミングしてコーティングされていない部分を取り外します。次に、キャピラリーホルダーをnano flow ESIインターフェースに接続します。XY、Zステージを後方に回転させて、キャピラリーの損傷を防ぎ、ステージを作動位置に押し込みます。

キャピラリーは、コーンオリフィスから1〜10ミリメートルの距離に配置する必要があります。スプレーが開始されるまで、キャピラリー電圧と低ナノフロー圧力を印加します。次に、ナノフロー圧力を最小値に下げてみてください。

XYZステージの位置、キャピラリー電圧、ナノフロー圧力、ディスソルベーションガスフローを調整して、信号強度を最適化します。シーズンピークシリーズの広い質量範囲を検出するには、加速電圧を最適化する必要があります。ここで使用されるパラメータは、キャピラリー1.3〜1.7キロボルトのサンプルコーン80〜150ボルト、抽出コーン、1〜3ボルトで、高質量イオンの伝送を最適化し、穏やかな淡水化条件を必要とします。

背圧は、ソースとアナライザーの間の初期真空段階で5〜6ミリバールに上昇します。背圧を上げるには、信号強度への影響を監視しながらアイソレーションバルブを部分的に閉じて、ソース真空ラインのスクロールポンプへのコンダクタンスを慎重に下げます。質量分析計を完全にセットアップするときは、1000〜15, 000のマスターチャージ比範囲で1秒あたり1スキャンで約30スキャンを収集し、適切なキャリブレーションテーブルを使用して飛行時間を校正します。

キャリブレーションが完了したので、タンパク質サンプルをロードできます。サンプルは、質量分析計を校正する前に調製されるため、低マイクロモル濃度が必要です。必要に応じて、遠心式限外ろ過装置を使用してサンプルを濃縮します。

使用前に、タンパク質複合体がデバイスのメンブレンに吸収されないことを確認してください。NESIには揮発性溶液のみを使用し、容量とUV吸光度を確認することで、バッファー交換が必要になることがよくあります。微量遠心分離機ゲルろ過カラムを使用して、微量の塩、緩衝分子、またはその他の不揮発性付加物をすべて除去できます。

代わりに、サンプルを一時停止します。酢酸アンモニウム水溶液。この重要なステップによって、スペクトルの品質が決まります。

バッファー交換を最小希釈で最大3回繰り返し、最大交換が達成されるまでデバイスあたり1.3倍未満で行います。濃縮とバッファー交換の両方が必要な場合は、このセクションの冒頭で示したように、遠心式限外ろ過を使用してこれらを一緒に行うことができます。次に、ヨウ化セシウムのキャリブレーションに示されているようにサンプルをロードし、スプレーを開始します。

信号が検出されるまで、スプレーの初期最適化から始めます。示されている平均電荷状態の方程式を使用します(Mは複合体の質量です)。ただし、ダルトンでは、電荷状態の正確な位置はタンパク質に依存します。

複雑な解離を防ぐために、鉄源を加熱しないでください。ヒーターのスイッチを切るか、温度を摂氏40度未満に保ちます。キャピラリーの位置、サンプルコーン、抽出器の電圧を変化させます。

鉄の伝達を最大化するために、可能な開始点はコーン電圧、100ボルトの抽出コーン、1ボルト、およびキャピラリー電圧1.5キロボルトです。スペクトルの結果の変化を確認します。これらのパラメータをナノフロー圧力と組み合わせて最適化し、神格化を改善し、残留水とバッファー成分を取り除きます。

衝突セルのガス圧のバイアス電圧を上げます。一般的なバイアス電圧は10〜100ボルトの範囲で、トラップガスの流れは1〜10ミリリットル/分です。これを慎重に実行して、複合体の関連付けを防ぎ、トラップを調整し、衝突エネルギーを伝達します。

多くの場合、高質量イオンの伝送には、通常は10〜30ボルトの範囲のより高い電圧が必要です。この時点で、ここに示すように、衝突による複合体の解離を避けることが重要です。安定した信号に達した後、安定したスプレーを維持しながら、ナノフロー圧力とキャピラリー電圧を最小値に下げることを推奨しています。

いくつかのスキャンを収集した後、タンデム質量分析による複合体の成分の同定に進みます。タンパク質複合体について最適で安定したシグナルが得られたら、分離幅に質量中心を設定するプリカーサーイオンを選択します。一般に、12の低質量分解能および13〜15の高質量分解能は、広い質量範囲を使用して高質量の低電荷解離生成物を検出し、次いでそれを所望の値に低減してMSを実行する。

MSは、衝突エネルギーを増加させることにより、CEと略され、衝突セルの圧力を増加させることにより、トラップまたは転送CEを10〜20ボルトのステップで徐々に増加させ、衝突ガス圧力を毎分5ミリリットルまでゼロに上昇させます。最適な活性化条件に達するまで、スペクトルの変化を監視します。高い活性化エネルギーは、無傷の複合体から1つ以上のサブユニットの解離を誘発し、異なるサブユニットの相互作用親和性を明らかにする可能性があります。

ms MS分析の料金を複数選択します。成分が重複している場合、タンデムMS Spectraのセットを取得すると、異なる集団の電荷系列の解決に役立ちます。さらに、高電荷状態は、MSとMSを重ね合わせる低電荷状態と比較して、より容易に解離します。

選択したプリカーサーイオンの単離を検証するためのMsスペクトル。MSおよびms.MSによる無傷の複合体の特性評価に加えて、MSは穏やかな変性条件下でより小さなサブ複合体と溶液を生成し、これらも特性評価します。

サブ複合体のMSおよびMS MS分析は、サブユニットサブユニット相互作用の部分的な破壊のための複合体のサブユニットアーキテクチャを定義するための基礎を形成し、有機溶媒を徐々に50%の濃度まで追加するか、アンモニアまたはギ酸を4%の濃度まで追加して溶液のpHを変更します最後に、 複合体を構成する個々のサブユニットの質量を決定するには、変性条件下でスペクトルを取得することが重要です。これは、25 〜 75の水アセトニトリル比と1%ギ酸をelucian溶媒として、収集されたすべてのデータを処理し、添付の書面によるプロトコルに詳述されているように結果を分析します。タンパク質複合体サンプルをロードする前に、質量分析計はヨウ化セシウムを使用して較正しました。

赤でマークされた等間隔のピークのシリーズは、マスターチャージ比393から10, 000をはるかに超えるまで、幅広い範囲に広がっています。それらは、セシウムと複合体の一般的な組成の塩クラスターを単独で帯電するように割り当てられています。黒でマークされた主要なピーク間の追加のシグナルは、セシウム2プラスコンプレックスおよびセシウム3プラスコンプレックスシリーズのダブルチャージおよびトリプルチャージ種によって引き起こされます。

初期真空段階で圧力を上げることは、高質量クラスターを検出するために不可欠です。ここでは、高質量のピークに対する圧力の影響が、1.2 ミリバールと 5.3 ミリバールの圧力リードバックで示されています。ここでは、高圧の質量スペクトルを拡大して示しています。

これは、3000 から 5, 000 のマスター電荷比の電荷状態分布を生じさせるレクチンバリアント複合体の質量分析の例です。ただし、イオンの適切な脱水により、ピークは広くなります。バイアス電圧を4ボルトから15ボルトに増やすと、加速条件が増加し、残留水とバッファ成分が剥がれて高分解能のスペクトルが得られ、測定された質量は五量体錯体に相当します。

次に、プラス15のチャージステートをタンデムMS分析用に選択しました。衝突エネルギーの増加により、1, 664 のマスター電荷比を中心とする高荷電モノマーと、5, 000 から 8, 000 の質量電荷比の範囲のストリップされた四量体錯体が放出されます。レクチンバリアント複合体も変性条件下で調べられ、複合体の関連が得られました。

このようにして、複合体を構成する個々のサブユニットの正確な質量を決定できます。今回は、高質量イオンのMSスペクトルとタンデムMSスペクトルを取得する方法を示しました。この手順を実行するときは、サンプルを適切に調製し、質量分析と互換性のある揮発性バッファーのみを使用することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。