原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

本手順の全体的な目的は、マウスにおける乳がん腫瘍の発生を研究することです。まず、マウス乳がん腫瘍からの一次細胞の調製について説明します。次に、肺転移を可視化するためのマウス肺の摘出方法を提示します。

最後に、マウス胚由来線維芽細胞の調製法について説明します。これらの手法により、マウス乳癌ウイルスポリオーマmiddle T抗原のトランスジェニックマウスが、乳癌の腫瘍形成の研究に利用できることが示されます。この手法は乳癌への洞察を得るだけでなく、他の固形癌の研究にも適用可能です。腫瘍の摘出ステップにおいて、他の組織を含まずに腫瘍のみを単離することが重要であるため、本手法の視覚的な実演が不可欠となります。まず、ハサミを用いて、マウス乳癌ウイルスポリオーマmiddle T抗原トランスジェニックマウスの尿道口から頸部まで皮膚を切開することから始めてください。

次に、皮膚を固定して乳癌腫瘍を単離します。腫瘍をin situで冷PBSを用いて洗浄し、滅菌済みの10 cm組織培養プレートに移します。続いて、プレートを滅菌済みのラミナーフローフードに移し、滅菌済みのカミソリの刃とハサミを使用して、腫瘍を1 mm³の大きさに細切します。

切断した組織をコラゲナーゼと共に、ロッカースタンドを用いて37 °Cでインキュベートします。2時間後、得られた腫瘍組織懸濁液を遠心分離します。ペレットをPBS Resusでさらに3回洗浄し、最後の洗浄後、2 mLのtrypsin EDTAにペレットを懸濁させ、37 °Cで5分間、撹拌しながら処理します。

その後、細胞をさらに3回洗浄し、通常の増殖培地で再懸濁します。最後に、細胞を10 cmの組織培養ディッシュで培養し、目的の細胞数に達するまで3日間、毎日培地を交換します。肺を摘出する前に、肝臓と横隔膜を取り除き、肋骨を外してください。

次に、頸静脈に近い気管の上部を開き、カテーテルを用いて適切な薬剤を気管から注入して肺を満たします。肺を取り出した後、Z-fixを使用する場合は組織をパラフィンに埋没させます。インク（India ink）を使用する場合は、組織をinec溶液に5分間浸します。正常な肺組織は黒色になりますが、腫瘍結節は白色に現れます。二次部位で視認された直径0.5 mm以上のすべての腫瘍結節を転移として分類し、マウス胚性線維芽細胞を生成します。

まず、実演したように、胚を傷つけないよう注意しながら、妊娠マウスの皮膚を尿道口から首まで切開します。次に、子宮角を取り出し、滅菌PBSで洗浄します。その後、胚を胎盤から慎重に、一つずつ分離します。

各胚を、氷冷したPBSを含む10 cmの培養皿に入れます。頭部、肝臓、および腸を除去した後、PBSを含む12ウェル組織培養プレートの1つのウェルで胚の残りの部分を洗浄し、体を1 mm³の大きさに細切します。トリプシンEDTA 5 mLを含む別のウェルに転移し、組織を37 °Cでインキュベートします。

5分後、1 mLのFBSを加えて消化を停止させます。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを再懸濁します。温めた1 mLのDMEMを用い、最終的に細胞を抗生物質を添加した10 mLのDMEMを含む10 cm培養ディッシュに移し、目的の細胞数に達するまで培養します。

動物を安楽死させる腫瘍進行段階は、個別の研究内容およびI-A-C-U-Cのガイドラインによって異なります。例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルスポリオーマmiddle T抗原を導入したこの100日齢のFVBマウスは、前述したようにマウス乳腺から腫瘍を単離した後、3ヶ月で安楽死させました。これにより、原発腫瘍細胞が得られました。

多くの遺伝子が肺への乳がん転移に関与しているため、転移プロセスの研究を目的として、先ほど示した方法と同様に肺も摘出した。その後、肺をZ fixで膨らませ、インドインクで染色して腫瘍結節を可視化した。ここでは、FVB系統のマウス胚から分離したマウス胚性線維芽細胞を示す。

このビデオを視聴することで、マウスの原発腫瘍細胞およびマウス胚性線維芽細胞の分離方法、およびマウス肺の摘出方法について十分に理解できるはずです。イソフルラン（Isoflurane）の使用は極めて危険であるため、この手順を行う際は、常に化学薬品用ドラフトチャンバー内で作業するなど、適切な予防策を講じることを忘れないでください。