Name: 内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法によるDNA濃度の定量プロトコル。内部陽性対照を用いてアッセイを検証し、蛍光データから標準曲線を作成する方法を解説します。

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この研究は、グローバル·ヘルス·イニシアティブにおけるグランド課題を通してビル·アンド·メリンダ·ゲイツ財団からの助成金によって賄われていた。

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
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<li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
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<li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li>
<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

プロンプトが表示されたら、MATLABアルゴリズムを使用して、意味のある定量データを得るためには、ユーザは、適切な入力値を選択しなければならない。セクション5および6の各スクリプトを開始した後、すべての入力変数は自動的にコマンドウィンドウに要請され、出力は自動的に生成される。 5.7節では、ユーザーは勾配閾値を選択するよう求めている。勾配閾値の値は、適合の相関係数（rは2）の2乗に影響を与える。サーマルサイクラーからエクスポートされた未加工の蛍光データを使用する場合、2.0と5.0の間の値が高いrは2係数を生成する傾向がある。第5.8節では、ユーザは、正の閾値を設定するためのバックグラウンドを超える標準偏差の数を指定する必要があります。正または負などのサンプルを獲得するために、スクリプトが自動的にTHERMAからエクスポート生の蛍光データを使用して、各サンプルの最大値と最小蛍光との差Δ サンプルを決定Lサイクラー。これは、すべての無ターゲット対照サンプルの平均差Δの背景と標準偏差σの背景を計算します。 Δ サンプルは<...

定量的核酸増幅は、環境、食品媒介性および水媒介性病原体の検出のためだけでなく、臨床診断のための重要な技術である。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）核酸の感度が高く、特異的かつ定量的検出のための金の標準的な方法で、 例えば、HIV-1ウイルス負荷試験、細菌性病原体の検出、および他の多くの生物の1のスクリーニングのための- 3。リアルタイム定量PCRの間に、プライマーは、サイクル中の病原体のDNAを増幅し、そして蛍光シグナルは各サイクルにおいて、サンプル中の増幅されたDNAの量に比例して生成される。病原体DNAの未知の濃度を含有する試料は、標準試料の初期DNA濃度と蛍光シグナルが特定の閾値（ すなわち、サイクル閾値、またはC T）に達した時点に関する標準曲線を用いて定量することができる。 、4開発されている。これらのプラットフォームは、一般に、より迅速な結果を提供し、より安価な、より簡単な装置を用いて達成され得るより低い、単一温度で核酸を増幅する。 、ポイントオブケア用途に特に魅力的である分でDNAを増幅するRPAは、低い増幅温度（37℃）を必要とし、不純物5,6の存在下で活性なままである。 12 - RPAアッセイbiothreat剤7の食品分析、病原体検出、癌の薬物スクリーニング、および検出を含む、広範囲の用途のために開発されている。しかし、核酸の定量化のためのRPAの使用が制限されてきた13,14。 前作では、翔だったwnは、リアルタイム定量的RPA（QRPA） を15可能である。ここで、より詳細なプロトコルは、標準曲線、定量PCRを用いて定量化に類似する方法を用いて未知のサンプルを定量するためにリアルタイム定量RPAを使用するために提供される。このプロトコルは、同様に、システムが適切に機能していることを確認するために内部陽性対照（IPC）を開発する方法のように、概念実証としてHIV-1 DNAを検出するために、サーマルサイクラーにRPA反応を実行する方法について説明します。トレーニングデータを使用して標準曲線を構築するためのサーマルサイクラーや顕微鏡とデータ解析を使用して、データ収集にも詳述されている。最後に、カスタムスクリプトを使用して標準曲線を使用して、未知のサンプルを定量するための方法が示されている。このQRPA技術は、未知の濃度のサンプルの定量を可能にし、伝統的なリアルタイム定量PCRに比べて多くの利点を有する。

<table><tbody><tr><td>qRPAアッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1フォワードプライマー</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>カスタムDNAオリゴ</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'&nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 リバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタム DNA オリゴ</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3'&nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1プローブ</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>カスタムDNAオリゴ</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'&nbsp;</td></tr><tr><td>IPCプローブ</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>カスタムDNAオリゴ</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA, ACA ATA, CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT, TTT, GTA, ATT, GGA A -3'</td></tr><tr><td>RPA exo試薬(ペレット、再水和バッファー、酢酸マグネシウム</td>、<td>TwistDx</td><td>、TwistAmp exo</td><td></td></tr>、<tr><td>PCRチューブストリップ、</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>、PCRフラットキャップチューブストリップ、</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>、マイクロシール接着剤</td><td>、BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1ターゲット(pHIV-IRES-eYFP&Delta;環境&デルタ;Vif&Delta;Vpr)</td><td></td><td></td><td>カスタムプラスミド、参照:Segall、H. I.、Yoo、E. &Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.(宿主範囲が変更された人工複製コンピテントレンチウイルスの特性評価と検出)。分子療法8、118&ndash;129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>人間の男性のゲノムDNA</td><td>はBiosystemsを応用</td><td></td>した 360486 <td></td></tr><tr><td>96の井戸の冷たいブロック</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>熱サイクラーBioRad</td><td></td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris緩衝液1.0 M、pH 8.0</td><td>EMDミリポア</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M、pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC 開発</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クリプトスポリジウム・パルバム IPCテンプレート</td><td>ウォーターボーン・インク</td><td>P102C</td><td>C.パルバム(BSL-2感染性病原体)を使用する準備ができていない場合、IDTに二本鎖合成ターゲットを注文することも可能です。C. parvumのPCRおよびRPAプライマーは、GenBankアクセッション番号AF115377.1</td></tr><tr><td>PCRロングフォワードプライマー</td>を使用して設計されました <td>Integrated DNA Technologies</td><td>、カスタムDNAオリゴ、</td><td>5'-TGG、CAG、TAT、TCA、TTC、ACA、ATT、TTA、AAA、GAA、AAG、G、ATC、TAA、GGA、AGG、CAG、CAG、GC-3'</td></tr><tr><td>PCRロングリバースプライマー</td><td>インテグレーテッドDNAテクノロジー</td><td>ズ カスタムDNAオリゴ</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelty DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X buffer</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agarose Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright 蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>ツァイスイメージャー.J1</td><td></td></tr><tr><td>ステージヒーター</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1チャンネル精密 高安定性温度コントローラー</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP フィルターキューブ</td><td>ツァイス</td><td>フィルターセット 38 (000000-1031-346)</td><td>励起 BP 470/40 nm、発光 BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>HEX フィルターキューブ</td><td>クロマ</td><td>49014</td><td>励起 BP 530/30 nm、エミッション BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>レーザーカッター</td><td>彫刻家のネットワーク</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" 黒色アクリル</td><td>マクマスターカー</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm 透明アクリル</td><td>マクマスターカー</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>オフィスデポ</td><td>デュロ 瞬間接着剤&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PCRグレードの鉱物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>データ分析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB スクリプト: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB スクリプトに含まれるもの: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB スクリプトに含まれるもの: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>SI</td><td></td><td></td>に収録</tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>SI</td><td></td><td></td>に収録</tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>に収録 AxioVisionソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td> SI<td>に収録</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

最近、病原体検出のための等温増幅プラットフォームであるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)が、標準曲線を使用してDNAサンプル濃度を定量化するために使用できることが実証されました。この原稿では、リアルタイムの定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイ(qRPAアッセイ)を開発および実装するための詳細なプロトコルが提供されています。HIV-1 DNA定量を例にとり、リアルタイムのRPA反応のアセンブル、内部ポジティブコントロール(IPC)配列の設計、IPCと対象ターゲットの共増幅についてすべて説明します。複数の実験からのデータを使用して標準曲線を作成するための指示とデータ処理スクリプトが提供されており、未知サンプルの濃度を予測したり、アッセイの性能を評価したりするために使用できます。最後に、ポイントオブケアqRPAアッセイの開発に向けたステップとして、顕微鏡とステージヒーターを使用してリアルタイムの蛍光データを収集する代替方法について説明します。提供されたプロトコルおよびスクリプトは、目的の任意のDNAターゲットに対するqRPAアッセイの開発に使用することができます。

ターゲットとQRPA実験でIPCとして機能する配列を選択する前に（HIV-1）DNA、内部陽性対照（IPC）の候補が生成され、HIV-1 DNAの存在なしQRPA反応において増幅するそれらの能力についてスクリーニングした。 IPC候補は、アウト競合HIV-1アンプリコンの形成からIPC形成を防止するために、ターゲット（HIV-1）DNAよりも長い。 図2Aは 、2℃の生成に示すようにパルバム IPC候補はゲル電気泳動を用いて415と435 bpのバンドの存在によって確認した。 10 4および10 5コピーの合計（ 図2C）が存在したとき、より長い候補が一貫して増幅しながらQRPA反応では、より短いIPC候補は、ほとんどの増幅（ 図2B）を示した。したがって、より長い候補がHIV-1 QRPA実験のIPCに選ばれた。 リアルタイムQRPAは、単独で目的の標的を使用して、または使用して実行することができるタ...

Provided は、サーマルサイクラーまたは顕微鏡とステージヒーターを使用して DNA サンプルの初期濃度を定量化するリアルタイムリコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイを開発するためのプロトコルです。また、内部ポジティブコントロールの開発についても説明します。生のリアルタイム蛍光データを処理するためのスクリプトが用意されています。

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

本実験の全体的な目的は、定量的リコンビナーゼポリメラーゼ簡略化法（quantitative recombinase polymerase simplification）を用いて、未知の試料中のDNA濃度を定量することです。まず、標的DNA内部陽性コントロール、DNAプライマー、および蛍光標識プローブを反応液に添加します。次に、反応液をリアルタイムPCR機にセットし、加熱して酵素を活性化させるとともに、プローブの蛍光をモニタリングすることで、標的およびコントロールのアンプリコンの生成を検出します。次に、スクリプトを用いて蛍光データを解析し、標準曲線を作成してアッセイをバリデートします。バリデーション実験でHIV 1標的DNAを定量した結果、DNAサンプルを正解濃度の1桁の範囲内で正確に定量できることが示されました。リアルタイム定量PCRなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、RPAが等温反応であるため、高価なサーマルサイクラーを必要としない点にあります。RPAは、より低い増幅温度で動作し、不純物を含むサンプルに対しても耐性があり、数分以内に標的を検出可能なレベルまで増幅させることができ、さらに耐熱性酵素を利用することで室温での輸送や保存が容易になります。まず、増幅前のクリーンな作業スペースを確保するため、50%次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いてベンチトップおよび器具の表面をすべて清掃します。次に、280 mM 酢酸マグネシウム溶液、再水和バッファー、および反応ペレットを-20 °Cのフリーザーから取り出し、室温で解凍します。その後、新しいマイクロチューブに383.5 µLの再水和バッファーを移し、そこに41.6 µLのヌクレアーゼフリー水を加えてボルテックスで混合してマスターミックスを調製し、別途、別のチューブに35 µLの酢酸マグネシウムを分注します。再水和バッファーストック溶液の酢酸マグネシウムを冷凍庫に戻します。次に、プライマーとプローブを4°Cの冷蔵庫から取り出します。これらを増幅前ワークスペースに置き、光への曝露を最小限に抑えるため、照明を消します。10 µMのフォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ27.3 µLずつマスターミックスに加えます。次に、10 µMのHEX標識HIV 1D NAプローブを7.8 µL、マスターミックスに加えてチューブをボルテックスします。その後、プライマーとプローブのストック溶液を保管場所に戻します。QRPA反応を組み立てる際、テキストプロトコルに記載されている通り、ここに内部陽性コントロールを追加することができます。まず、凍結乾燥された酵素ペレットを、2本の低底8ウェルPCRチューブストリップの各チューブに配置します。ペレットが入ったチューブにマスターミックスを37.5 µLピペッティングします。気泡が入らないように、ピペットチップでチューブの中身を静かに攪拌し、ペレットを溶解させます。液量の減少を防ぐため、反応液から慎重にチップを取り出してください。また、チューブごとに必ずピペットチップを交換してください。マスターミックスを冷却するため、チューブを冷却済みの96ウェルコールドブロックに移し、少なくとも5分間静置します。その間に、サーマルサイクラーのソフトウェアにプロトコルをロードし、プレートレイアウトをテキストプロトコルに従って設定します。次に、PCRチューブよりもわずかに幅が広くなるように、透明プラスチック製のマイクロシール用粘着テープを2ストリップ分カットします。また、フラット型のPCRチューブストリップ用蓋を2枚用意し、HIV oneプラスミドテンプレートをテキストプロトコルの指示通りに分注します。次に、テンプレートを10 µL、適切なPCRチューブに加えます。ここでも、ピペットチップを用いて混合液を軽く混ぜ合わせます。続いて、各チューブのキャップに酢酸マグネシウムを2.5 µL加え、反応チューブを完全に密封しないように、キャップを上にそっと置きます。酢酸マグネシウムがキャップ越しに明確に見えることを確認してください。PCRチューブストリップをマイクロ遠心機にセットし、10秒間遠心分離して、すべての液体をチューブの底部に集め、気泡を取り除きます。酢酸マグネシウム溶液をマスターミックスに加えることで、QRPA反応が開始されます。反応を停止させるため、PCRチューブを速やかにコールドブロックに移します。次に、反応液の汚染を防ぐため、ゆっくりと蓋を開け、クリアマイクロシールフィルムでチューブを密封します。プレートレイアウトに従って、チューブをサーマルサイクラーに配置します。サーマルサイクラーの蓋を閉め、「start run」をクリックします。ラン終了時に、実験のファイル名を必ず指定してください。生の蛍光データを確認し、それをスプレッドシートにエクスポートして、「quantification amplification results」というファイルを作成します。標準曲線を作成します。まず、標準曲線作成用のスクリプトをダウンロードし、MATLABまたは同様のデータ解析プログラムを開きます。スクリプトを開き、「実行」を押してスクリプトを走らせます。指示に従って、解析するデータファイルの数を入力してください。次に、各トレーニングファイル内のサンプル数と反復数をコマンドウィンドウに入力します。標準曲線を作成するために使用した、10進対数ベースの最低DNAコピー数を入力し、Enterキーを押してください。ここでの例では、最低濃度は10進対数ベースで1コピーとなります。次に、各DNA標準物質の濃度差をコマンドプロンプトに入力し、Enterキーを押します。濃度間隔は10倍の対数（1 log base 10 copies）です。続いて、傾きのしきい値の値をコマンドウィンドウに入力し、Enterキーを押してください。この値は通常3から5の間です。ポジティブしきい値（Zとしても知られる）として、バックグラウンドより上の標準偏差の数を入力し、Enterキーを押してください。一般的なZ値の範囲は1から5です。次に、今回のデータ収集に使用した装置を指定してください。サーマルサイクラーについて「1」を入力し、Enterキーを押します。内部ポジティブコントロールがある場合は、新しいしきい値が必要かどうかに応じてYまたはNを入力し、デフォルト値または新しいしきい値を選択します。最後に、標準曲線の作成に使用するすべてのスプレッドシートファイルを選択します。その後、スクリプトによってすべてのデータが自動的にインポートおよび解析されます。異なるコピー数のHIV 1D NAを含む重複サンプルを用いて、リアルタイムQRPAを実施しました。蛍光強度の増加によって示される増幅検出の開始は、DNAコピー数が少ないサンプルよりも、コピー数が多いサンプルの方が早くなります。既知濃度のHIV 1D NAの増幅から標準曲線を作成するために、生の蛍光データを使用しました。これらのデータを指数曲線にフィットさせ、R2値は高い適合度を示しています。標準曲線を用いて、既知の濃度を持つ追加のDNAサンプルの濃度を予測しました。Zの値を1に調整することで、低濃度のDNAを正確に予測することが可能になります。対照的に、高濃度のDNAはZの値を5に設定することでより適切に予測できます。この手順を行う際は、RPAにはDNA増幅速度を制限するための真のサイクルが存在しないことに留意することが重要です。したがって、増幅速度を精密に制御する必要があります。実験間の整合性が極めて重要であるため、すべての実験において同じプライマー分注液を使用してください。反応成分を熱および光から保護してください。データ収集の直前に酢酸マグネシウムを添加し、開始まで反応液を冷却ブロック内で保持します。本実験の内容は以下の通りです。

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Biology

生物学

43分子標的までの同時検出のための安価な、高スループットの方法が記載されている。 mPCR /...

マルチプレックスPCRおよび逆ラインブロットハイブリダイゼーションアッセイ（mPCR / RLB）

研究では、MSTのツールと​​して提案したヒト/ブタ/ウシDNAウイルス、アデノウイルスとpolyomaviruses、特定の定量化のために定量PCRを用いて水中の硝酸塩による尿/糞便汚染または汚染源の同定のための費用対効果の高い方法を説明します。...

特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

このビデオでは、デュプレックスデジタルPCR(ddPCR)技術を示しています。これは、従来のPCR技術の修正版で、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に検出するのに役立ちます。1つのPCR反応をナノリットルサイズの乳化液滴に分割し、それぞれに増幅し、液滴画分から異なる色の蛍光増幅シグナルを検出することで、標的配列の初期濃度を算出します。...

デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

ここでは、T細胞受容体切除サークル(TREC)とK-欠失組換え切除サークル(KRECs)の同時定量化の方法について説明します。TREC/KRECアッセイは、胸腺および骨髄出力のマーカーとして使用できます。...

リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

ここでは、馬の呼吸液中のEHV-2 DNAの検出と定量に使用される定量的PCR法の開発と検証のためのプロトコールを紹介します。EHV-2...

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。...

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

環境DNAアッセイでは、現場データの収集を開始する前に、厳格な設計、テスト、最適化、検証が必要です。ここでは、環境試料から標的種DNAの検出と定量を行うための、種特異的なプローブベースのqPCRアッセイを設計する各ステップを通じてユーザーを取るプロトコルを提示する。...

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

詳細な指示は、リアルタイムの定量的な等温核酸増幅を実行するために、多くの低コストヒーターと互換性のあるオープンソースのモジュラー蛍光計を構築するために提供されています。...

オープンソースのミニチュア蛍光計で、資源制限設定でリアルタイムの等温核酸増幅反応を監視

D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、...

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

アシネトバクター・バウマニーの迅速かつ正確な検出を容易にするために、A.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12aベースシステムを用いた Acinetobacter baumannii 感染症の迅速かつ特異的な検出

学ぶ定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法によるDNA濃度の定量プロトコル。内部陽性対照を用いてアッセイを検証し、蛍光データから標準曲線を作成する方法を解説します。

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

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