内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

次の実験の全体的な目標は、定量的なリコンビナーゼポリメラーゼの単純化を使用して、未知のサンプルのDNA濃度を定量化することです。これは、まず標的DNA内部ポジティブコントロール、DNAプライマー、蛍光標識プローブを反応液に加えることで達成されます。第2のステップとして、反応をリアルタイムPCR装置に入れ、反応を加熱して酵素を活性化し、プローブの蛍光を監視して標的の生成を検出し、アンプリコンを制御します。

次に、蛍光データをスクリプトを使用して分析し、標準曲線を生成し、アッセイを検証します。その結果、HIVの1つの標的DNAを定量するために使用された検証実験に基づいて、DNAサンプルを正しい濃度の1桁以内で正確に定量できることが示されています。この手法がリアルタイム定量PCRなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、RPAが等温であるため、高価なサーマルサイクラーが不要であることです。

また、RPAは温度に対する増幅を低く抑える必要があり、汚れたサンプルに耐性があり、数分以内にターゲットを検出可能なレベルまで増幅し、lly酵素を利用して室温での輸送と保管を容易にします。まず、ベンチトップと機器の表面を50%漂白剤の溶液で洗浄し、クリーンなプレアンプワークスペースを作成するには、マイナス20°Cの冷凍庫から280ミリモルの酢酸マグネシウム溶液、再水和バッファー、反応ペレットを取り出し、室温で溶液を解凍します。次に、383.5マイクロリットルの再水和バッファーを新しいマイクロフージチューブに移し、41.6マイクロリットルのヌクレアーゼフリーウォーターをバッファーに移し、ボルテックスして35マイクロリットルの酢酸マグネシウムを別のチューブに混合することにより、マスターミックスを組み立てます。

酢酸マグネシウムを再水和緩衝液溶液に入れて冷凍庫に戻します。次に、摂氏4度の冷蔵庫からプライマーとプローブを入手します。それらをプレアンプワークスペースに配置し、ライトをオフにして、マスターミックスへの10マイクロモルのフォワードプライマーとリバースプライマーのそれぞれで27.3マイクロリットルの光曝露を最小限に抑えます。

次に、HIV 1D NAとラベル付けされた10マイクロモルの六角形の7.8マイクロリットルで。マスターミックスにプローブし、チューブをボルテックスします。次に、プライマーとプローブストック溶液を貯蔵試薬に戻し、テキストプロトコルに示されているようにここに追加してQRPA反応を組み立てることができます。まず、凍結乾燥酵素ペレットを2本の個々のチューブに入れ、低層8ウェルPCRチューブストリップピペット37.5マイクロリットルのマスターミックスをペレットを含むチューブに入れる。

チューブの内容物をピペットチップで優しく攪拌して、気泡を作らずにペレットを溶かします。ボリュームの損失を防ぐために、反応からチップを慎重に取り外し、各チューブ間でピペットチップを交換するようにしてください。チューブを冷やした96ウェルコールドブロックに少なくとも5分間移し、マスターミックスを冷却します。

それまでの間、サーマルサイクラーソフトウェアにプロトコルをロードすると、プレートのレイアウトがテキストプロトコルに示されます。次に、透明なプラスチックマイクロシール接着剤を2本カットして、PCRチューブよりもわずかに幅が広くなります。また、2つの平らなPCRチューブストリップの蓋を入手し、テキストプロトコルに示されているようにHIV 1プラスミドテンプレートを分注します。

次に、10マイクロリットルのテンプレートを適切なPCRチューブに追加します。再び、ピペットの先端でミックスを静かにかき混ぜます。次に、各チューブキャップに2.5マイクロリットルの酢酸マグネシウムを追加し、反応チューブの上にキャップをそっと置き、完全に密閉されないようにします。

酢酸マグネシウムは、キャップを通してはっきりと見えるはずです。PCRチューブストリップをマイクロ遠心分離機に入れ、チューブを10秒間遠心分離して、チューブの底にあるすべての液体を収集し、気泡を取り除きます。酢酸マグネシウム溶液とマスターミックスを組み合わせると、QRPA反応が開始されます。

PCRチューブをコールドブロックに素早く取り外して、反応を停止します。次に、反応物の混入を防ぐために蓋をゆっくりと取り外し、透明なマイクロシールフィルムでチューブをシールします。プレートレイアウトの位置に従って、チューブをサーマルサイクラーに移します。

サーマルサイクラーの蓋を閉じて、[実行の開始]をクリックします。実行が終了したら、実験のファイル名を必ず指定してください。生の蛍光データを表示し、スプレッドシートにエクスポートすると、Quantification Amplification resultsというファイルが作成されます。

標準曲線を作成します。まず、標準曲線スクリプトをダウンロードしてから、MATLABまたは同様のデータ解析プログラムを開きます。スクリプトを開き、実行を押してスクリプトを実行します。

プロンプトが表示されたら、分析するデータファイルの数を入力します。次に、各学習ファイルのサンプル数と反復数を入力します。コマンド ウィンドウで。

標準曲線の作成に使用した最低DNA濃度をlogベースの10コピーで入力し、Enterキーを押します。この例では、最も低い濃度は、1 ログベースの 10 コピーです。

次に、各DNA標準間の濃度の差をコマンドプロンプトに入力し、ここでEnterキーを押します。集中間隔は、1 対数ベースで 10 コピーです。次に、勾配しきい値の値をコマンド ウィンドウに入力し、Enter キーを押します。

この値は通常、3 から 5 の間です。正のしきい値 (Z とも呼ばれます) の背景より上の数値標準偏差を入力し、1 から 5 の範囲の一般的な Z 値を入力します。次に、この場合のデータ収集に使用された機器を指定します。

サーマルサイクラー用に 1 つ入力し、Enter キーを押します。内部ポジティブコントロールがある場合は、新しいしきい値が必要かどうかに応じて Y または N を入力して、しきい値のデフォルト値または新しい値を選択します。最後に、標準曲線の作成に使用するすべてのスプレッドシート ファイルを選択します。

その後、スクリプトはすべてのデータを自動的にインポートして分析します。HIV 1D NAの異なるコピー番号を含む重複サンプルに対して、リアルタイムQRPAを実行しました。蛍光の増加によって示される検出可能な増幅の開始は、DNAコピー数が多いサンプルの方がコピー数が少ないサンプルよりも早く発生します。生の蛍光データを使用して、既知の HIV 1D NA 濃度の増幅から標準曲線を生成しました。これらのデータは指数曲線に近似しており、R二乗値は高い適合度を示しています。

標準曲線を使用して、既知の濃度の追加のDNAサンプルの濃度を予測しました。Zの値を1に調整することで、低濃度のDNAを正確に予測することができます。対照的に、高濃度のDNAは、Z値が5の場合により正確に予測されます。

この手順を試みるときは、RPAにはDNA増幅の速度を制限するための真のサイクルがないことを覚えておくことが重要です。そのため、増幅率を正確に制御する必要があります。実験間の一貫性は非常に重要ですので、すべての実験で同じプライマーアリコートを使用してください。

反応成分を熱や光から保護します。データ収集が始まる直前に酢酸マグネシウムを添加し、反応を開始するまでコールドブロックで保持します。実験です。