骨馴化培地：調製およびバイオアッセイ
2015年7月8日
我々は、骨馴化培地（BCM）を調製し、インビトロでその活性をテストする方法をここで説明します。
このビデオの全体的な目標は、骨馴化培地の調製方法と、その活性をin vitroで試験する方法を説明することです。これは、最初に骨スクレーパーを使用して豚の下顎骨から骨片を採取することによって達成されます。2番目のステップは、骨チップを培養液で24時間インキュベートする前に、骨チップを加熱、処理、脱灰、または何もしないことです。
次に、骨チップから放出されるすべての因子を含む骨馴化培地が収集されます。最後のステップは、骨馴化培地で細胞を刺激するか、インキュベーション期間後に骨馴化培地とその上にシード細胞を載せた生体材料を事前にインキュベートすることです。最終的に、定量的リアルタイムPCRを使用して、治療後の細胞の遺伝子発現の変化を示します。
自家骨移植片を単独で、または他の生体材料と組み合わせて利用すると、インプラント周囲の骨欠損における骨再生が促進され、良好な長期結果が保証されます。このビデオでは、骨の状態にある生体分子に対する塊状細胞の遺伝的応答を決定するのに役立つin vitroバイオアッセイを紹介しています。ミディアム ボーンコンディションミディアムは、骨再生における標準的な移植片の目標が自家骨である理由など、外傷顎顔面および歯科分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。
熱処理された骨の自動移植片や化した骨マトリックスなど、処理された骨から条件培地を調製することは、標準化が難しい場合があります。したがって、正確であることが重要です。まず、地元の肉屋から新鮮な豚の下顎骨を入手し、固い表面に置きます。
次に、骨膜を使用して、骨に付着した軟部組織を残さないように特に注意しながら、骨膜の全層フラップを解放します。骨膜を取り外したら、骨スクレーパーをしっかりと握り、長い動きで下顎骨の頬側から骨片を採取します。長さが1ミリメートル未満の骨片は捨ててください。
骨片が乾燥するのを防ぐには、10cmのシャーレに骨チップを培地ですばやく覆います。十分な骨片が収集されたら、5グラムの骨片を低温殺菌して熱制御バッチを準備します。チップを摂氏80度で30分間加熱して低温殺菌するか、摂氏121度で20分間オートクレーブします。
次に、塩酸の1モル溶液に5グラムの骨片を加え、摂氏4度で4〜6時間シェーカーに置くことにより、脱灰コントロールを準備します。次に、中性のpHに達するまで、骨片を培地で繰り返し洗浄します。5グラムの新鮮な骨チップと各対照製剤の5グラムを別々の皿に入れ、各皿に10ミリリットルの新鮮な培地を追加します。
次に、サンプルを摂氏37度の加湿雰囲気で24時間インキュベートし、翌日にコンディショニング培地を作成します。各皿からメディアを取り出し、15ミリリットルの円錐管に入れます。骨馴染培地を重力200倍で10分間遠心分離し、破片を取り除きます。
次に、上清を取り除き、0.2ミクロンの滅菌フィルターに通し、アリクワッドをマイナス80°Cで凍結して必要になるまで保管します。骨細胞や歯肉および歯周靭帯線維芽細胞などのヒト間葉系細胞を、1平方センチメートルあたり30, 000細胞の濃度で12頭のクジラプレートに播種することから始めます。細胞を増殖培地で覆い、翌朝一晩細胞をプレートに付着させます。
培地を廃棄し、37°Cの予温PBSで細胞を洗浄します。次に、20%骨馴化培地の有無にかかわらず、温めた無血清培地を追加して細胞を刺激します。生体材料の吸収能力も試験する場合は、目的の生体材料を含むチューブに、任意のコントロールを含む骨馴染培地を追加し、チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。
次に、生体材料を予温PBSで激しくすすぎ、材料に1平方センチメートルあたり30、000細胞の濃度でヒト間葉系細胞を播種します。細胞を単独でインキュベートするか、または生体材料に播種した細胞を37°Cの加湿雰囲気で24時間インキュベートします。その後、培地を廃棄します。
プレウォームPBSで細胞をすすぎ、標準的なRNA単離プロトコルを使用して細胞RNAを抽出します。RNAが単離されたら、抽出したRNAの等濃度から始めて、各サンプルで逆転写酵素反応を実行することにより、各処理グループのCD NAサンプルを調製します。次に、サンプルに対して定量的リアルタイムPCRを実施し、添付のテキストプロトコルに記載されているプライマーと条件を使用して、選択した遺伝子のレベルを探します。
最後に、デルタデルタCT法を使用して、遺伝子のサイクル閾値レベルをハウスキーピング遺伝子Gabb dhに正規化することにより、相対的な遺伝子発現レベルに基づいて骨馴染培地の品質を計算します。ここでは、骨馴化培地に24時間曝露した口腔線維芽細胞の遺伝子発現の変化を示す典型的な結果をいくつか紹介します。アドレナリンとペントトラックスの2つの遺伝子と3つの遺伝子は、どちらも元のレベルの40%に大幅にダウンレギュレーションされましたが、インターロイキン11と33、N-A-D-P-Hオキシダーゼ4、プロテグリカン4はすべて200倍もアップレギュレーションされました。
興味深いことに、骨チップを周囲の軟組織から遮蔽するために使用されるコラーゲンバリア膜は、遺伝子発現の変化に関与する骨馴染培地の多くを吸収します。しかし、コラーゲン膜はインターロイキン33の発現を制御する因子を吸収することができませんでした。したがって、インターロイキン33の発現はこの設定では規制されていません。
ここで説明するプロトコルは、骨再生に関与する異なるタイプの細胞の応答を研究するために適合させることができます。さらに、このプロトコルは、プロセス骨および他の骨充填剤から条件培地を調製するために使用することができる。このバイオアッセイの臨床的関連性は不明のままです。
in vivoでのBCMに対する細胞応答は、より複雑である可能性が高く、ここに示した遺伝子の広いスペクトルとさまざまな標的細胞が含まれています。それにもかかわらず、私たちのバイオアッセイは、骨RAF分子のおそらく複雑な組成とin vitro細胞応答に関する最初の洞察を提供します。
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概要
このビデオは、骨条件培養液（BCM）の調製とそのin vitro でのテストについて説明しています。このプロセスには、骨チップの収穫、処理、培養液で24時間インキュベーションしてBCMを収集することが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 骨生物学
- 細胞培養技術
- 遺伝子発現分析
背景
- 骨条件培養液は、骨由来因子が細胞に与える影響を研究するために使用されます。
- これらの因子を理解することで、骨生物学と組織工学に関する洞察が得られます。
- この方法により、骨由来シグナルに対する細胞反応の検討が可能になります。
- 定量的リアルタイムPCRが遺伝子発現の変化を分析するために使用されます。
研究の目的
- ブタの下顎骨チップからBCMを調製すること。
- 培養細胞に対するBCMの生物学的活性をテストすること。
- BCM処理後の遺伝子発現の変化を評価すること。
使用された方法
- 骨スクレーパーを使用して骨チップを収穫すること。
- 骨チップを熱処理または脱灰処理すること。
- 骨チップを培養液で24時間インキュベートすること。
- 細胞刺激または生体材料の事前インキュベーションのためにBCMを収集すること。
主要な結果
- 骨チップから放出された因子を含むBCMの成功的な調製。
- BCM処理に対する細胞反応の実証。
- BCM処理後の遺伝子発現の変化を示す定量的リアルタイムPCRの結果。
- 骨由来因子の生物学的活性に関する洞察。
結論
- BCMを効果的に調製し、細胞反応を研究するために使用できます。
- この方法は骨生物学を調査するための貴重なツールを提供します。
- 将来の研究では、組織工学におけるBCMの治療潜在性を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the paracrine signaling of bone grafts is critical for optimizing regenerative therapies in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and trauma reconstruction. This protocol enables mechanistic de-risking by isolating bone-derived molecular effects on mesenchymal cells, supporting target validation in bone regeneration pathways. The in vitro bioassay provides predictive confidence in evaluating biomaterial performance and biological activity before preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring gene expression changes in mesenchymal cells exposed to bone-derived factors.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative assessment of TGF-β regulated gene modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying bioactive bone preparations that drive desired molecular responses in regeneration-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized biological systems for downstream screening by generating consistent bone-conditioned medium from native, heat-treated, or demineralized bone.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through controlled incubation, debris removal via centrifugation, and sterile filtration of conditioned medium.
- Scalability Value: Enables platform reuse by allowing biomaterial pre-conditioning (e.g., collagen membranes) to assess absorption and retention of bioactive factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery to preclinical by modeling human mesenchymal cell responses to bone graft-derived signals relevant to bone regeneration.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway activity by demonstrating differential gene regulation (e.g., downregulation of adrenalin and pentraxin, upregulation of IL-11, IL-33, NOX4, and proteoglycan 4).
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by linking specific molecular outputs (e.g., IL-33) to functional biomaterial interactions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a reusable assay for assessing bone graft bioactivity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating the paracrine effects of bone grafts on mesenchymal cells.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via qPCR measurement of gene expression changes following BCM exposure.
- Analytics: Generates comparative data through delta-delta CT normalization to housekeeping genes, enabling condition-to-condition response analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling cellular responses in systems relevant to bone regeneration and reconstructive surgery.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular capability across bone sources (native, processed, demineralized) and biomaterial combinations, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in bone graft-mediated regeneration.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined steps for bone chip harvesting, treatment, incubation, and medium processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of biological activity, reducing late-stage failure risk in regenerative programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying bone preparations with strong molecular activity in relevant cell systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bone tissue handling, cell culture, and molecular biology techniques including RNA isolation and qPCR.
- Dependent on access to sterile tissue culture equipment, centrifuges, and real-time PCR instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of bone chip size (>1 mm), incubation time (24 hrs), and BCM concentration (20%) for reproducible results.
- Requires adaptation when applying to different cell types or biomaterials beyond collagen membranes and human mesenchymal cells.
- Limited by the current lack of established in vivo correlation for the observed gene expression changes, as noted in the source material.
