床板リリースされた信号の機能的特性を評価するために馴化培地離さ床板組織と生産の文化

この手順の全体的な目標は、フロアプレートに順応した媒体の生産に基づいて、さまざまな発生状況でフロアプレート由来の信号の特性を調査することです。これは、最初にE 12.5でマウス胚から脊髄を分離し、床板を解剖することによって達成されます。2番目のステップは、プラズマトロンビンマトリックスでフロアプレートを培養して、フロアプレートに調整された培地を生成することです。

次に、E 12.5のマウス胚からの脊髄を単離し、コミュニケーション、絨毛ニューロンを含む背側組織を解剖します。最後のステップは、解剖された通信組織を床板馴染培地のサンプルにtationおよび曝露することです。最終的に、組織はウェスタンブロットなどの生化学的分析のために処理され、交連マーカーの発現を示します。

この方法は、発生生物学の分野でのズキの質問に役立ちます。フロアプレートから放出されるシグナルは、細胞脂肪、分化、増殖、軸索誘導組織やさまざまな起源の細胞を調節する重要な役割を果たします。ZAを床板条件媒体にさらし、手順を実証することは、研究室のA技術者に親切になります。

この手順は、安楽死させた妊娠可能なE12.5妊娠中のマウスの腹側を上にして置くことから始めます。腹部を70%エタノールに浸します。次に、鉗子で腹部の皮膚をつまみ、手術用ハサミで皮膚と腹膜層を切り抜きます。

腹腔を露出させるために切開を行います。マウスの両側に胚のストリングが存在します。2つの胚の間の組織で子宮の1つの角をつかみ、外側の部分から始めて解剖します。

次に、無傷の子宮を氷の上の冷たいPBSを入れた100ミリメートルのペトリ皿に移します。次に、余分な胚組織から胚を抽出します。2対の鉗子で暗赤色の胎盤組織をつかみ、柔らかく引っ張って組織を引き裂き、子宮嚢から胚を取り出します。

解剖フードに、冷たいHBSSグルコースの滴に1つの胚を入れます。胚の首を切った後、胚の腹側を下にして置き、前部を実験者に向けて置きます。一方の鉗子で胚の皮膚をつまみ、もう一方のペアで皮膚を引き離します。

胚の前部から皮膚が完全に除去されるまで、この手順を繰り返します。次に、1つの鉗子で胚の前面を左に向けます。胚を前部に固定します。

他の鉗子が皮膚をつかみ、吻側に向かって引っ張って脊髄を露出させます。次に、鉗子の片側を使用して、まだ脊髄を包んでいる髄膜を切断します。脊髄が開いています。

次に、胚をあなたの側の前方に向けます。鉗子を脊髄の下にスライドさせ、周囲の組織と後根神経節を小さな回転運動で切り離すことにより、胚の子宮頸部側から始めて、組織を脊髄から切り離します。次に、分離された脊髄を冷たいHBSSの新鮮な滴に、上部に髄膜があり、実験者から離れた前面を平らに置きます。

その後、1つの鉗子で残りの後脳を介して脊髄を固定し、2番目の鉗子で髄膜をつかみます。次に、脊髄の吻側から始めて髄膜を剥がし、ゆっくりと一定の動きで床板を解剖します。鉗子1本で後脳をつまみ、メスで床板を切り出します。

次に、解剖した床板を神経基礎培地に保存します。室温を追加します。この手順では、100ミリメートルのペトリ皿にいくつかの滅菌カバースリップを置きます。

次に、各カバースリップの中央に20マイクロリットルの血漿をピペットで入れます。次に、2〜4枚のフロアプレートを各プラズマドロップに移します。血漿滴に20マイクロリットルのHBSSトロンビンを追加します ピペットチップで慎重に混合し、床板の外植片との接触を避け、カバースリップを室温で最低10分間保持して、血漿の凝固を可能にします。

血漿血栓は凝固の兆候として数ミクロン収縮し、血漿血栓の剥離を避けるために凝固を早期に停止してはなりません。その後、各カバースリップを4ウェルプレートに移し、500マイクロリットルの神経基礎とB 27を追加します。摂氏37度で48時間インキュベートします。

組織培養フードで48時間後、それぞれから培地を回収します。まあ慎重に。重合した血漿トロンビン混合物やフロアプレートの破片をピペットで動かさないように注意してください。.

次に、100マイクロリットルのアリコートを摂氏マイナス80度で保管します。交連ニューロンは、脊髄の最も外側の部分に位置しています。交連ニューロンを解剖するには、1つの鉗子で後脳をつまみ、細かいメスで外側部分を切り取ります。

次に、解剖した組織を氷上の神経基礎媒体に保存します。コミュニケーションコーラルニューロンを治療するためにすぐに使用するには、小さなハサミでコーラス組織を裂傷します。組織をできるだけ小さく切って、細胞のアクセシビリティを高めます。

次に、組織を異なる実験条件間で均等に分配します。制御処理と床板調整媒体治療。続いて、組織片をGの800倍で摂氏4度で1分間遠心分離します。

次に、必要に応じてチューブ間の再パーティションを確認します。フラグメントが均等に分布するまで、再分配し、再度遠心分離します。その後、上清を取り除くか、温かい床板、コンディショニングされた培地、または組織に制御処理を追加します。

次に、組織を摂氏37度で30分間インキュベートし、10〜15分ごとに穏やかに振ってください。その後、Gの800倍で1分間遠心分離し、最後に処理液を取り出します。溶解バッファーを追加します。

この実験では、背側脊髄組織を採取し、広げて、床板調整培地または対照培地で刺激しました。サンプルを溶解し、ウェスタンブロット用に処理しました。次に、タンパク質を抗体、プレックス、ワンアクチン、ベータアクチンでプローブしました。

ここで、ウェスタンブロットは、プレックスの増加と、フロアプレート調整培地で刺激されたサンプルの1レベルを示しています。ドットブロットは、フロアプレートコンディショニング培地におけるGDNFの発現を、そのコントロール培地と比較して示しています。この手順に従うか、または西洋の血液に対して刺激されて処理される代わりに方法を実行することができます。

目的の細胞を含む組織を解離し、単離された細胞をカバースリップに播種することができます。フロアプレートコンディショニング培地を培養細胞に適用し、細胞の挙動やタンパク質発現の改変を、例えば免疫化学によって評価することができます。このビデオを見た後、生化学に進む前に、脊髄のさまざまな部分を好きになる方法と、急性の新鮮な組織を刺激する方法をよく理解できます。