Name: でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発 C。エレガンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 学ぶ光遺伝学突然変異誘発法。C. elegansのゲノムDNAに青色光依存性ROS生成タンパク質を用いて、簡便かつ無毒な遺伝子スクリーニングを実現する革新的プロトコルです。

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作業はHHMIによってサポートされています。私たちは、プロトコールのテストと原稿の改訂に協力してくれたラボメンバーに感謝します。

LEDイルミの1建設注：必要なLED装置は、材料のリストにまとめられています。全体LEDセットアップは小さく、我々はそれがワーム4の露光量を制御するために、暗い部屋に置くことをお勧めしますが、ラボのどこにでも配置することができます。 <ol><li>ケーブル（ 図1A、D）でコントローラにLEDを接続します。 </li><li> BNCケーブルでデジタルファンクションジェネレータ/アンプ（ 図1A、C、D）にコントローラを接続します。 </li><li>カスタムホルダー（ 図1A）を使用して、ステージ上のLEDライト10センチ修正。 注：我々は、金属部品とホルダーを作りました。 </li><li>部分的にLED照明のセットアップをカバーしますが、ワームが病気になり、熱の蓄積（ 図1B）を 、避けます。 注：私たちは、オープントップとボトム（ 図1A）とのカスタムメイドのハードプラスチック製のカバーを使用します。カバーは、突然変異誘発、それ自体のために必要とされていませんが、トン使用されていますO周囲に青色光の不要な露出を制限。私たちは、ワームの過熱を防止するために、LEDセットアップ完全に（ 図1B）を覆わないように助言します。 </li><li>レーザー保護メガネを着用してください。 注：光は非常に明るいですので、私たちは、レーザー保護メガネを着用してください。サングラスも同様に動作する可能性があります。 </li><li> LEDコントローラのレバースイッチ」のIntを。」連続照明（ 図1D）および最大電力（ 図1C）の65％に設定します。 </li><li>ワームは、製造業者のプロトコルを使用して配置され、ステージ上の青色光の強度を測定するための光度計を使用してください。セットアップは、連続的な照明の下で2.0ミリワット/ mm 2とを与えます。 </li></ol> 2.ブルーライト治療注：[miniSOG-3&#39;UTR（TBB-2）:: Pmex-5-HIS-72 + CB-UNC-119（+）]株CZ20310 juSi164を使用して、UNC-119（ED3）III 4株が利用可能です。線虫遺伝学センター（CGCでは、http：//www.cgc.cbs.umn.edu/）。 <ol><li> E.と標準線虫の増殖培地（NGM）プレート上に暗闇の中のHis-mSOG株を維持標準プロトコル10,11以下の大腸菌 OP50。 注：周辺光の下では、juSi164含有株は自然発生率4以上の突然変異率を表示しません。ハロゲンランプと解剖スコープを使用してルーチン歪み通路は、一般的に、同様の突然変異を引き起こすことはありません。それにもかかわらず、注意が標準暗い内部のインキュベーター中で株を維持、またはホイルで株をカバーし、例えば 、光への不要な暴露を避けるために注意すべきです。不必要な変異は時間をかけて蓄積する場合には、それを受信した後、株のアリコートを凍結することをお勧めします。 </li><li>ワームに妊娠若年成人（約12時間後にL4）の動物を選んで11を選択します。 注：古い動物は低いひなサイズを有することができる若い動物は、より少ない変異原効果4を示します。 </li><li>フィルタpをカットAPERは25ミリメートル×25 mm角の穴が60ミリメートルプレートに適合し、播種していないプレート（ 図1E）上に配置します。 注：正方形のパンチを使用することができるが、パンチの大きさが正確である必要はありません。 </li><li>プレート上の四角い穴の中にワームを制限するために均等にろ紙上の100mMのCuCl 2の100μLをドロップします。 </li><li>妊娠若年成人雌雄同体の所望の数を選択してください（例えばステップ3を参照）とのCuCl 2板の中央に移します。 </li><li>レーザー保護メガネを着用してください。 </li><li> LEDとファンクション・ジェネレータをオンにします。 </li><li> LEDコントローラのレバースイッチの内線を。」関数発生器（ 図1D）によってそれを制御します。 </li><li>最大電力の65％で、コントローラおよび正弦波、4ヘルツ（ 図1C）などのファンクション・ジェネレータを設定します。 </li><li> &lt;LEDの下にステージ上で蓋をせずにステップ2.5からのCuCl 2プレートを置きます （ 図1A/強いです&gt;）。 </li><li> 30分間の青色光で動物を照らします。 </li><li> P 0としてシードのプレートに健康探してワームを転送します。 注：P 0の所望の数が画面の種類によって異なります。例えば、ステップ3を参照してください。 P 0のワームは、光処理後すぐに調整されていないように見えることがあり、時間の経過とともに回復します。 </li><li>インキュベーター内または暗闇の中で箔を使用して覆われたワームをキープ。そしてそれらの子孫2,10の間で希望の表現型をスクリーニングを開始するための標準的な手順に従ってください。 </li></ol>前方遺伝画面の3例注：これはLEDや歪みが機能しているかどうかを確認するために120半数体ゲノムを有するクローン画面の例である図2は、手順の概略を示しています。 <ol><li> 【1日目】青色光処理後、P 0としてOP50とNGMプレート上に5人の健常探してワームを選ぶ20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを1産卵しましょうD（「1日目」板）。 </li><li> [2日目]新しいシードされたプレート上に転送P 0（ &#39;2日目」板）。 </li><li> [3日目]、それらを燃焼させることによって「2日目」板にP 0を選択し、殺します。 </li><li> 【Day4] &#39;1日目」のプレートから30産卵期の若い成人F 1を選択し、個々のプレート（&#39; 1日目」の30 F 1プレート）上に転送します。 </li><li> 「2日目」板用【Day5]を繰り返し、ステップ3.4（「2日目」の30 F 1のプレート）。 </li><li> 【Day7-9]彼らが大人になる、標準的な実体顕微鏡下でのWT株（ 図3A）と比較して、異常な形態および/またはF 2ワームの動作を確認してください。 注：それは高い浸透と劣性であるF 2間で同じ表現型を持つワームの約四分の一遺伝変異が表示されます。しかし、いくつかの変異体は、ゆっくりと成長および/または部分的な浸透度を示すことができます。したがって、変異体未満の四半期に見つけることができる可能性がありますプレート。 </li><li>個別に見える表現型とワームを選択し、次の世代の表現型の遺伝を確認してください。 </li></ol>体外導入遺伝子の統合の4例<ol><li> [72 Pmex-5-HIS-:: miniSOG-3&#39;UTR（TBB-2）+ CB-UNC-119（+）] CZ20310 juSi164への関心のDNAを注入し、UNC-119（ED3）とを有するトランスジェニックワームを準備標準的な注入プロトコル12,13以下の低透過率（10〜30％）。 注：別の方法として、確立された染色体外アレイはjuSi164株に交差することができます。 juSi164ための遺伝子型決定を回避するために、juSi164ヘテロ接合体は、効率が低下する可能性があるが、P 0として使用することができます。 juSi164ための遺伝子型決定方法は、第5章で説明されています。 </li><li> [1日目]ステップ2で説明したように青色光とP 0として〜20トランスジェニック動物を扱います。 注：詳細P 0のワームは、TRに応じて必要とされます<html> ansmission率。導入遺伝子は、表現型または共射出マーカー12,13によって同定することができます。 </li><li> 、個々のプレート上に10 P 0探して健康を選んで20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを（P 0プレート）数日間卵を産むしましょう</li><li> 【Day4]シングルアウト20トランスジェニックF 1個々のプレート上に各P 0のプレートからワーム、彼らは卵を産むしましょう。 （20 F 1×10 P 0プレート=合計で200 F 1プレート。） </li><li> 【Day7] Fを&gt; 75％のF 2を有する導入遺伝子を持つ1プレートを検索します。 </li><li> &gt; 75％の透過率F 1プレート（F 2板）から5トランスジェニック動物を選択してください。 </li><li> 【Day10]潜在的な統合されたラインとして100％の透過率とF 2のプレートを保管してください。 </li><li>メンデル分離を確認し、潜在的なバックグラウンドの変異を削除するには、標準的な手順10を使用して、潜在的な統合された行を異種交配。 </li></ol>ル &quot;&gt; 5。ジェノタイピング<ol><li>溶解20は、標準的なプロトコル14を使用して、溶解緩衝液中F 2ワームを外部交配しました。 </li><li>標準プロトコル14以下の58℃のアニーリング温度でMosSCI挿入9、juSi164、（ 表1）のためのプライマーを用いてPCRを行います。 注：UNC-119（ED3）は、次のステップ5.4および5.5に救出導入遺伝子（juSi164）を除去した後、非協調行動によって検出することができるので、UNC-119（ED3）の遺伝子型が不要です。 </li><li>アガロースゲル電気泳動15を実行し、juSi164ためのWTを見つけるために、バンドのサイズ（ 表1）を調べます。 </li><li> F 2子孫は、UNC-119（ED3）の存在にワームを麻痺しているかどうかを調べます。 </li><li>非協調ワームはステップ5.4で発見された場合は、1つのいくつかのnonuncoordinatedワームは、次の世代内のすべてのnonuncoordinatedワームを取得します。 </li></ol>

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<li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> J Vis Exp. (82), (2013).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで、我々は彼の-mSOGを使用して、光遺伝学の突然変異誘発の詳細な手順を説明する生殖細胞系列で発現し、小規模前方遺伝画面の例を提供します。標準的な化学的突然変異誘発と比較して、この光遺伝学突然変異誘発方法は、いくつかの利点を有します。第一に、それによって離れて、このようなEMS、ENUなどの有害化学変異誘発物質からラボの人材を維持し、紫外線（TMP / UV）とトリメチルソラレン、非毒性です。第二に、突然変異誘発の実験手順は、P 0動物の数が少ないために使用することができる、1時間以内に終了することができます。第三に、光遺伝学的変異誘発は、ヌクレオチド置換、および染色体欠失を含む変異の広いスペクトルを生成します。最後に、光遺伝学的変異誘発は、染色体外導入遺伝子の統合のために使用することができます。 この変異誘発プロトコルにおける重要なステップは、LEDセットアップが元で彼-mSOG含む株に動作することを保証することですpected効率。約100半数体ゲノムで、議定書3章で説明したように我々は、パイロットクローンスクリーニングを行うことをお勧めします。突然変...

フォワード遺伝子スクリーニングは、広くそのような線虫（C.エレガンス）1などのモデル生物において様々な生物学的プロセスを破壊する遺伝子変異体を生成するために使用されてきました。このような変異体の分析は、機能的に重要な遺伝子およびそれらのシグナル伝達経路1,2の発見につながります。 C.で伝統的に、突然変異誘発エレガンスは、変異原性化学物質、放射線、またはトランスポゾン2を用いて達成されます。このようなメタンスルホン酸エチル（EMS）とN -エチル- Nの -nitrosourea（ENU）などの化学物質がヒトに対して毒性があります。ガンマ線または紫外線（UV）放射線変異誘発特別な装置を必要とします。そして、このような突然変異誘発株3、などのトランスポゾン活性株は、保守時に不必要な突然変異を引き起こす可能性があります。我々は遺伝的にコード光増感剤4を用いて、遺伝的変異を誘発するための簡単なアプローチを開発しました。 活性酸素種（ROS）DNA 5に損傷を与えることができます。ミニ一重項酸素発生器（miniSOG）がLOV（光、酸素、及び電圧）2 6フォトトロピンシロイヌナズナのドメインから設計された106個のアミノ酸の緑色蛍光タンパク質である。青色光（〜450 nm）のに曝されると、miniSOG ROSは、すべての細胞に存在する補因子6-8としてFL AVINモノ、と一重項酸素を含む生成されます。我々は、ヒストン-72、CのC末端にminiSOGをタグ付けすることによって彼の-mSOG融合タンパク質を構築しましたヒストン3のエレガンス変異体は、私たちはCの生殖細胞系列に彼-mSOGを表現するために単一コピーの導入遺伝子9を生成しましたエレガンス。暗闇の中で、通常の培養条件の下では、彼の-mSOGトランスジェニックワームは、通常のひなのサイズと寿命4を持っています。青色LEDの光に曝されると、彼の-mSOGワームは、それらの子孫4間の遺伝的変異を生成します。誘導された突然変異のスペクトルは、Gなどのヌクレオチド変化を含む：TからC：AとG：CからC：G、および小chromoso私は4を欠失。この突然変異誘発手順は実行が簡単で、かつ最小限のラボの安全設定が必要です。ここでは、LED照明のセットアップと光遺伝学突然変異誘発のための手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>超高出力LED光源</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-mic-LED-460</td><td>460 &plusmn; 5nm</td></tr><tr><td>LEDコントローラー</td><td>Prizmatix</td><td>UHPLCC-01</td><td></td></tr><tr><td>デジタルファンクションジェネレーター/アンプ</td><td>PASCO</td><td>PI-9587C</td><td>PI-9587Cは販売終了しました。代替品はPI-8127です。</td></tr><tr><td>BNCケーブル オス/オス</td><td>THORLABS</td><td>CA3136</td><td></td></tr><tr><td>USB-TTLインターフェース</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>オプションの</td></tr><tr><td>光度計</td><td>THORLABS</td><td>PM50およびモデルD10MM</td><td></td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>NGMプレート</td><td></td><td></td><td>NaCl 5 g、ペプトン 2.5 g、寒天 20 g、10 &micro を溶解します。1 L H2O中のg/mLコレステロール。オートクレーブ後、1 mM CaCl2、1 mM MgSO4、25 mM KH2PO4(pH 6.0)を追加します。</td></tr><tr><td>溶解液</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris(pH 8.8)、50 mM KCl、0.1% Triton X-100、2.5 mM MgCl2、100 & micro;g/mL プロテイナーゼK</td></tr></tbody></table>

でヒストンminisogを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; c。エレガンス</em

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

モデル生物における前方遺伝子スクリーニングは、多くの生物学的プロセスにおいて機能的に重要な遺伝子と経路を発見するための主力製品です。ほとんどの突然変異誘発ベースのスクリーニングでは、研究者は有毒化学物質、発がん性物質、または放射線の使用に依存しており、これには指定された機器、安全設定、および/または危険物の廃棄が必要です。私たちは、光誘導性の活性酸素種の強力な生成物である生殖細胞系発現ヒストン-miniSOGを使用して、C.エレガンスに遺伝性変異を誘導する簡単な方法を開発しました。この突然変異導入法は、有毒な化学物質を含まず、実験室の安全性と廃棄物管理を最小限に抑えます。誘導されたDNA修飾には、一塩基の変化と小さな欠失が含まれ、古典的な化学突然変異誘発によって引き起こされるものを補完します。この方法論は、染色体外導入遺伝子の統合を誘導するためにも使用できます。ここでは、標準的な突然変異誘発および導入遺伝子の統合のためのLEDセットアップとプロトコルの詳細を提供します。

私たちは8 F 1のプレートを見つけ、120変異誘発半数体ゲノムに対応する60 F 1のプレートのうち、第2条及び3に記載されている標準的なプロトコルに従って、30分間の露光を用いて、（ED3）CZ20310 juSi164 UNC-119とフォワード遺伝学的スクリーニングを行いましたこのようなボディサイズの欠陥（ 図3B）、非協調運動（ 図3C）、および成人の致死率（ 図3D）などの目に見える表現型を表示するF 2ワーム。私たちは、「1日目」と「2日目」のプレート間の変異体の数の違いに気付きませんでした。選抜小さなF 2ワーム、まとまりのないF 2ワームのすべての子孫は、彼らが遺伝変異体であることを示唆し、対応する表現型を示しました。完全な観察は、表2にまとめられている。平均して、120半数体ゲノムを有するクロ...

遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

この突然変異導入プロトコルの全体的な目的は、シンプルなLEDセットアップを用いて、青色光依存的な活性酸素生成タンパク質を発現するC.elegansのゲノムDNAに突然変異を導入することです。本手法の主な利点は、第一に、突然変異導入プロトコルが非常にシンプルであり、毒性化学物質を必要としないこと、第二に、長期間の変異導入後も突然変異生成装置が有効に機能することの2点です。私はまずこの手法を考案し、ROS生成タンパク質が遺伝性変異の誘導に使用されたことはないことに気づきました。この実験では、LED照明装置のコントローラーをBNCケーブルでデジタル関数発生器に接続します。カスタムホルダーを使用して、LEDライトをステージの上10 centimetersの位置に固定します。次に、青色光が周囲に漏れるのを抑えるため、装置の一部を覆います。ただし、ステージ上に熱が蓄積しない程度にしてください。ここでは、上下が開いたカスタムメイドの硬質プラスチック製カバーを使用しています。LEDの動作中は、光が非常に強いため、必ずレーザー保護メガネまたはサングラスを着用してください。次に、LEDコントローラーのレバーをinternalに切り替え、最大出力の65%に設定します。フォトメーターを使用して、連続照射時のステージ上の光強度が2.0 milliwatts per square millimeterになるよう、必要に応じて光出力を調整してください。本プロトコルでは、光感受性株を標準条件下で暗所で維持します。不要な光への曝露は避けるべきですが、継代のための日常的なハロゲンランプの使用では変異は起こりません。偶発的な変異が懸念されるため、菌株を最初に取得した際に分注して凍結保存してください。変異導入に向けて、中心に約25 mm四方の穴を開け、60 mmプレートに適合するようにカットしたフィルターペーパーを用意し、菌を播種していないプレートの上に配置します。次に、100 mMの塩化銅を100 µL、フィルターペーパー上に均等に分配し、線虫が四角い穴から脱出するのを防ぎます。ここで、L4ステージから約12時間経過した線虫のプレートから、卵を抱えた若年成体の雌雄同体を選択し、プレート中央の正方形の領域に配置します。続いて、LEDと関数発生器の電源を入れます。次に、LEDコントローラーを外部制御（external）に切り替えてファンクションジェネレーターで制御し、出力を適切に設定します。ファンクションジェネレーターを用いて、4 hertzの正弦波を発生させます。ここで、プレートをステージに移動させ、線虫に青色光を30分間照射します。処理直後に、健康そうに見えるすべての虫を播種済みのプレートに移します。これらの虫は光照射後に協調運動が乱れた状態になりますが、その後回復します。光照射した虫は暗所に保管してください。その後、成体となったF2子孫に形態異常や行動異常がないかを確認します。記載した手法を用いて、120個の変異導入ハプロイドゲノムに相当する60枚のF1プレートでフォワード遺伝学的スクリーニングを実施しました。F2ワームを含む60枚のF1プレートのうち、8枚において、dumpy（短身）な体型、不協調な運動、または成体致死などの顕著な表現型が認められました。これらのF2世代の虫の子孫は、これらの観察可能な表現型を保持していました。このスクリーニングから得られた可視変異体の数は、系統およびセットアップが光遺伝学的変異導入に適切に機能していることを示唆しています。この変異導入手順は1時間以内に完了させることができます。迅速かつ安全な変異導入法をご活用ください。

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Research

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学ぶ光遺伝学突然変異誘発法。C. elegansのゲノムDNAに青色光依存性ROS生成タンパク質を用いて、簡便かつ無毒な遺伝子スクリーニングを実現する革新的プロトコルです。

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発

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