でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発 C。エレガンス

遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。

この突然変異誘発プロトコルの全体的な目標は、単純なLEDセットアップを使用して、青色光依存性の活性酸素発生タンパク質を発現するC.elegansのゲノムDNAを変異誘発することです。この技術の2つの主な利点は、突然変異誘発プロトコルが非常に簡単で、有毒な化学物質を必要としないことです。そして2つ目は、突然変異発生装置が長い突然変異の後に証明されることです。

私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのですが、ROSを生成するタンパク質が遺伝性突然変異を誘発するために使用されたことがないことがわかりました。この実験では、LEDイルミネーターデバイスのコントローラーをBNCケーブルを使用してデジタルファンクションジェネレーターに接続します。カスタムホルダーを使用して、LEDライトをステージから10センチ上に固定します。

次に、セットアップを部分的に覆って、周囲へのブルーライトの露出を制限しますが、ステージに熱が蓄積するほどではありません。ここでは、上部と下部が開いたカスタムメイドの硬質プラスチックカバーが採用されています。LEDの動作中は、光が非常に明るいため、常にレーザー保護メガネまたはサングラスを着用してください。

次に、LEDコントローラーのレバーを内部に切り替え、最大電力の65%に設定します。光度計を使用して、必要に応じて光のパワーを調整し、ステージ上では連続照明中に1平方ミリメートルあたり2.0ミリワットになるようにします。このプロトコルでは、光感受性ひずみを標準的な条件下で暗闇に維持します。

不必要な光への曝露は避けるべきですが、ハロゲンランプを日常的に使用しても突然変異は発生しません。偶発的な突然変異が懸念されるため、株のアリコートが最初に取得されたときに凍結してください。突然変異誘発は、中央に約25mm四方の穴が空いた60mmプレートに合うように濾紙を用意し、未シードプレートの上に置きます。

次に、100マイクロリットルの100ミリモル塩化銅を濾紙に均等に分配して、ワームが四角い穴から出ないようにします。次に、L4ステージから約12時間後のワームのプレートから、妊娠した若い成体の雌雄同体を選び、プレートの中央の正方形に入れます。次に、LEDとファンクションジェネレーターを点灯させます。

次に、LEDコントローラーを外部に切り替えてファンクションジェネレーターで制御し、電源を適切に設定します。関数発生器から、4 ヘルツで正弦波を生成します。次に、プレートをステージに移し、ワームを青色光で30分間照らします。

治療の直後に、健康そうなすべてのワームを播種プレートに移します。これらのワームは、軽い治療後に協調していないように見えますが、回復します。光処理されたワームは暗闇に保管してください。

その後、成体のF2子孫の異常な形態や行動がないか確認します。120の変異誘発一倍体ゲノムに対応する60枚のF1プレートについて、記載された技術を用いて前方遺伝スクリーニングを行った。F2線虫を含む60枚のF1プレートのうち8枚は、だらしない体型、協調性のない動き、成虫の致死性など、目に見える表現型を示しました。

これらのF2線虫の子孫は、これらの観察可能な表現型を保持していました。この画面から見える突然変異体の数は、株とセットアップが光遺伝学的突然変異誘発に対して適切に機能していることを示唆しています。突然変異誘発の手順は1時間以内に行うことができます。

迅速かつ安全な突然変異導入法をお楽しみください。