Name: 大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぼう、大コイルドコイルタンパク質の結晶化手法。ウェットとドライラボ技術を組み合わせ、計算予測と実験的検証を統合して結晶化成功率を向上させる革新的なフレームワークです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、助成金NIH R01 GM097204(APVおよびJDH)によって支援されました。JHMの資金は、HHMI学部研究サマーフェローシップによって提供されました。

注：概念フレームワークまたはワークフローの図を参考のため、図1に記載されています。計算または配列に基づく予測、タンパク質の発現および精製、生化学的特徴、および結晶化：プロトコルは、4つの段階に分けることができます。図示の実施例は、マッシュルームSD2ドメインおよび/またはマッシュルーム・ロック複合体を分析するが、任意のタンパク質と共に使用することができます。 1.コイルドコイル領域の境界の計算予測を生成するために、Webベースのツールを設立<ol><li>シーケンス同族体の進化的に多様なセットを収集します。 <ol><li> www.uniprot.orgに移動し、上部の検索バーにマッシュルームを入力します。 </li><li>次の自分のアクセッション番号のボックスをチェックして、ダウンロードするシーケンスを選択します。スターを有する配列はUNIPROTによってレビューシーケンスを示します。一般的に、より信頼性があります。すべての配列が完全かつ正確であることを保証するために注意してください。 </li><li>選択されたのを保存[ダウンロード]ボタンをクリックしてequences。 </li><li>クラスタル-オメガ21（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を使用して、マッシュルーム配列の集合を合わせます。マッシュルーム配列とファイルを選択し、「参照」ボタンをクリックし、Submitを押してください。 </li><li>アライメントが完了したら、「位置調整のファイルをダウンロード」ボタンをクリックします。 </li><li> （ファイルから| |入力アライメントファイル）Jalviewを使用して、1.1.5で生成された複数の配列アラインメントを開きます。新しい整列ウィンドウ、アイデンティティ（|パーセントアイデンティティカラー）による色の中で。 </li></ol></li><li>二次構造の予測、柔軟なまたは無秩序な配列の予測を計算し、目的のタンパク質（複数可）内のコイルドコイル領域を予測しました。 <ol><li>コイルドコイルの予測を計算するために、http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgiに移動します。コピーとシーケンスボックスに列を貼り付けて、[送信]をクリックします。 注：この分析は、コンプに数時間かかる場合がありますLETE。マッシュルーム配列は非常に大きいので、配列は、ウェブサーバのサイズ制限内に収まるように1,000未満のアミノ酸のブロックに分割される必要があり得ます。 Shrm2を分析する場合には、このセクションでは、コイルドコイル領域を含むことが知られているSHRM SD2ドメインを含むよう千C末端アミノ酸が使用されることが推奨されます。他のタンパク質とのこの分析を繰り返す場合は、可能な場合は、完全長タンパク質配列を使用することをお勧めします。それができない場合は、公知の生化学的または機能的データに基づいてシーケンスを可能な最大の断片を使用するか、または切開。 </li><li>コイルドコイルの予測を計算するために、http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgiに移動します。コピーとシーケンスボックスに列を貼り付けて、[送信]をクリックします。 </li></ol></li><li>マッシュルーム・シーケンスの単一の包括的な注釈に1.2.2へのステップ1.1の結果を結合します。 注：非常また、任意およびすべての関連する私を含めることが奨励されていますこの段階でのタンパク質の機能または精製についての文献や他のソースから収集することができますnformation。 </li><li>この総合的な注釈付き配列を使用して、保護を最大化しようとすると、タンパク質のドメイン境界（または可能な境界のシリーズ）を予測し、無秩序または可撓性配列の量を最小限に抑えながら、構造的特徴を予測しました。既知の場合、得られたタンパク質は、目的の機能特性を保持すべきです。 </li></ol>第1節で同定されたドメインの境界2. ExpressとPurifyのタンパク質注：このセクションの目的は、第1節で生成された架空のドメイン境界をスクリーニングするために迅速かつ簡単に定量化可能な一連のアッセイを使用することです。 <ol><li>標準的な分子生物学技術を使用して、彼の10 -mRuby2-XH2プラスミド内のフレームにおける所望のコード配列を有する発現プラスミドを生成し（ベクターマップAについては、 図3を参照してくださいND詳細）。 </li><li> 18-24時間室温で自己誘導培地1にBL21（DE3） 大腸菌または他の適当な発現株を用いて、各発現プラスミドのためのテスト発現レベル。 <ol><li>このような、ここ（https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial 1などの細胞に付属または堅牢な形質転換プロトコルを使用して説明書には、次のBL21（DE3）に発現プラスミドと同様に、空のプラスミド対照を変換-変換/）。 </li><li>たての形質転換プレートから、単一コロニーを選択し、/ mlカナマイシン34μgので溶原性ブロス（LB）培地中で一晩、37℃で5ミリリットルをスターター文化を育てます。 </li><li>次の日、文化をペレット化し、新鮮なLBのでペレットを洗浄</li><li> 34 / mlのカナマイシンを自動誘導培地50mlにスターター培養物を追加します。文化は、室温または37℃のいずれかで飽和状態に成長することを可能にします。一般的に、18から24時間〜のために成長します。 </li><li>ペレット細胞sおよび無期限精製前に-80℃で得られた細胞ペレットを凍結します。 </li><li>最も効率的に所望の融合タンパク質を産生する株を決定するために、各発現株及びSDS-PAGEによる空ベクター対照からの全細胞抽出物の比較。彼10 -mRuby2-マッシュルームSD2融合タンパク質を、約50分間、又は染料前線がゲル22の底部に達するまで、180 Vで10％SDS-PAGEゲルを実行します。 </li><li>各株23内の総細胞タンパク質を可視化するクマシーブルー染色ゲル。 </li></ol></li><li>成功しmRuby2融合タンパク質を発現し、各株に初期アフィニティークロマトグラフィー工程を実行します。一般的に、タンパク質は、4℃で精製などの改変された条件の恩恵を受けるない限り、精製は、室温で2.3.2-2.3.7手順を実行します。 <ol><li>ステップ2.2.5からの細胞ペレットを解凍します。 </li><li>溶解緩衝液（10％グリセロール、500mMのNaCl、40 1.5mlの各細胞ペレットを再懸濁mMイミダゾール、20 mMトリスpH8.0の、1mMのβ-メルカプトエタノール）。適切なプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーを補います。 </li><li> 10mg / mlのリゾチームの30μlを添加して、室温で20分間インキュベートします。楽器のための指示に従って超音波処理は、使用されています。 </li><li>不溶性物質または非溶解細胞をペレットに14,000×gで30分間テーブルトップ遠心機で1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に移します。 SDS-PAGEを経由して、その後の分析のために上清とペレットの両方を保存します。 </li><li> Ni-NTAビーズを100μlで可溶性画分をインキュベート、ニッケルアフィニティー精製を行います。ビーズを混合するために、数回転倒、5〜10分間可溶性溶解液でビーズをインキュベートします。 </li><li>ビーズをペレット化し、卓上遠心機で30秒間800×gで遠心分離します。非特異的な汚染物質をオフにきれいにする溶解緩衝液でペレット3-5回洗浄することにより、これを従ってください。 </li><li> 1を補充した溶解緩衝液でビーズからルビー融合タンパク質を溶出Mイミダゾール。 </li><li>上記の「間に合わせ」精製に彼-mRuby2-マッシュルームタンパク質の挙動を比較するためにSDS-PAGEを使用してください。 </li></ol></li></ol> 3.有利な特性を持つものを同定するためにタンパク質サンプルを特徴づけます<ol><li>ルビー融合タンパク質の濃度を測定し、その後、ネイティブPAGEゲル24上に融合タンパク質の1-5μgのをロードすることによって試料の均一性を評価するために、280nmで分光光度計セットを使用します。 175 Vで140分間、4℃で10％ネイティブPAGEゲルを実行します。 <ol><li>画像mRubyタグ化融合は、このアッセイで移行どこ観察、蛍光を可視化するために装備イメージャーを使用して、ネイティブPAGE。 注：このタンパク質はおそらく集約されるよう十分でスタックしている融合タンパク質を観察するように注意してください。蛍光イメージャーが利用できない場合、1は、多くの場合、視覚化することができますとRubyの画像に濃縮サンプルはブラックライトの下またはUVライトボックスを有するタンパク質をタグ付けされています。 </li></ol></li><li>安定的に折り畳まれたドメインを同定するための限定分解を実行します。 0.025％ズブチリシンAの5μlを持つミリリットル〜1ミリグラム/でのRuby-SHRM SD2融合の95μLをインキュベート<ol><li>各時点での反応からの10μLを除去し、0、0.5、2、5、15、60、及び120分の時点で反応をサンプリングし、15％アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを介して反応の進行を視覚化します。 </li><li>ステップ2.2.7のようにクマシーブルーで染色し、プロテアーゼ耐性種を識別することができるかどうかを評価します。 </li></ol></li><li>溶液中のこれらのタンパク質の全体的な動作を総合的に評価の中に部分的に精製されたmRuby2-マッシュルーム融合タンパク質の精製効率、ネイティブPAGEでの動作、および限られたタンパク質分解からのデータを統合します。 <ol><li>適切な機能的アッセイが利用可能である場合（オプション）、この時点での活動をチェックします。 </li></ol></li></ol> 4.コイルドコイルSD2の高品質結晶を生成マッシュルームからドメイン注：タンパク質は異なる温度、通常は4℃で精製恩恵を受けるない限り、セクション4.1内のすべてのステップは室温で実施されています。 <ol><li>発現および精製能力の目安として50ミリリットルの増殖を使用して、完全に精製されたサンプルの5-20 mgの達成を目標にmRuby2-マッシュルームSD2の大規模な表現を行います。典型的には、培養2 Lは、適切な出発材料を提供します。 10分間、8000×gでの遠心分離による成長細胞をペレット化した後。 <ol><li>溶解のためにリゾチームを用いた場合、凍結細胞ペレットのグラム当たりの溶解〜2 mlで使用し、前のように、溶解緩衝液中の2 Lの成長からペレットを再懸濁します。代わりに、ホモジナイザーやフレンチプレスを使用している場合、ペレットの〜8ミリリットル/ gで再懸濁します。 30分30,000×gで遠心分離によって細胞破片をペレット化。 </li><li>バッチは、Ni-NTA樹脂10mlのを使用して4.1.1からの可溶性画分に結合します。適切な重力カラムに注ぎます未結合タンパク質は切ることができます。 </li><li>洗浄は、1 MのNaClを補充した溶解緩衝液で洗浄した溶解緩衝液40mlで3~5回樹脂。 </li><li> 80 mMイミダゾールを補充した溶解緩衝液40mlで洗浄樹脂。 </li><li> 1 Mイミダゾールに補充溶解緩衝液40mlでのRuby-マッシュルーム融合タンパク質を溶出します。手動で4〜10ミリリットル画分に溶出したタンパク質を分画。 </li><li> 10％SDS-PAGEを用いてのRuby-マッシュルーム融合タンパク質を含む画分を確認してください。 </li><li>適切な画分を透析6-8 kDaのMWCO透析チューブを用いて、15mMのイミダゾール、20mMトリスpH8.0の、1mMのβ-ME、8％グリセロール、250mMの塩化ナトリウム、に（典型的には2-4分画）。融合タンパク質のあらゆる25-50 mgのためのTEVプロテアーゼ1mgを追加します。ゆっくりと攪拌しながら室温で一晩透析。 </li><li>反復ニッケルアフィニティー精製は、4.1.2ステップ。 4.1.6へ。彼の10 -mRuby2がバインドされたままになりますしながら、マッシュルームSD2ドメインは現在、非結合画分に残るべきです樹脂および溶出画分に記載されています。クマシーブルーでこの使用して、12％SDS-PAGE染色を確認してください。 </li><li> 8％グリセロール、100mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール緩衝液を一晩20 mMトリスpHを8.0にマッシュルームSD2ドメインを含有する画分を透析します。 </li><li> FPLCを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー25を実行し、0.1〜1.0 MのNaClからのNaCl勾配で溶出します。 12％SDS-PAGEを用いて分画を分析します。 </li><li>スピンコンセントレーター（研究されているタンパク質に応じて、10キロダルトン以上のMWCO）を使用して、ミリリットル/〜0 mgまでのピーク画分を濃縮し、次いでサイズ排除クロマトグラフィー26を実行し 、12％SDS-PAGEを介してピーク画分を分析します。 </li><li>プールのピーク画分および20 mMトリスpH8.0の、50mMのNaCl、2％グリセロール、1mMのβ-ME、および結晶化する前に10mg / mlに濃縮するに透析します。 オプション：このステップの間の濃度で5μlのサンプルを除去する1、2、5、および10mg / mlのサンプルを濃縮する過程。このステップの間にサンプルの振る舞いを見て、各サンプルのネイティブPAGEローディング2-5μLを実行します。 </li></ol></li><li>結晶化試験のための最適なタンパク質濃度を同定するために12の条件の小さな配列をスクリーニング。これらの状態の組成は、 図7に記載されています。 <ol><li>蒸気拡散法、ピペッティングを使用して結晶化試験を行い、24ウェルシッティングドロップ結晶化トレイを使用して、最初はうまく溶液1μlとカバースリップ上のタンパク質試料の1μLを含ん滴が続く別々のウェルへの12の条件のそれぞれの500μlの。この技術の詳細については27を参照してください。 </li><li>迅速に明確なテープでトレイを密封し、振動の自由で適当な温度制御された環境にトレイを移動します。使用温度は変えることができるが、4°C、16°C、および20°Cは非常に一般的です。 </li><li>次の3日間にわたりトレイの低下を調べ100X倍率までの顕微鏡を使用してAYS。 3日間の期間の終了時に、降水（クリア）、光沈殿、豪雨（茶色）、または結晶を含有しないように、各ドロップをスコア。適切なタンパク質濃度はせいぜい6重い沈殿が含まれている必要があります。 </li><li> 4.2で同定されたタンパク質濃度を用いて、市販の結晶化スクリーンの広い範囲をスクリーニング。また、液滴の誤差を最小限に抑えながら液体処理または結晶化ロボットの使用が大幅にこのプロセスをスピードアップします。これは、ユーザーが単一のサンプルでより多くの条件をスクリーニングすることができ、同様にはるかに少ないタンパク質を必要とします。 </li><li>系統的に以前のように24ウェルスクリーニングトレイを用いた結晶化ドロップ内の各変数を変化させることにより、広い画面から特定の初期条件を改善します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification%3A+pure+but+not+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein purification: pure but not simple.</a> Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+coiled+coils+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Predicting coiled coils from protein sequences.</a> Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).</li>
<li>Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+Crick+equations+for+modeling+noncanonical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils.</a> J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).</li>
<li>Lupas, A. N., Gruber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+alpha-helical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The structure of alpha-helical coiled coils.</a> Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).</li>
<li>Hernandez Alvarez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+protein+structure+determination--lessons+from+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics.</a> Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XtalPred%3A+a+web+server+for+prediction+of+protein+crystallizability%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability.</a> Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).</li>
<li>Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+induces+apical+constriction+and+is+required+for+hingepoint+formation+during+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure.</a> Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).</li>
<li>Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+regulates+epithelial+cell+shape+via+the+apical+positioning+of+an+actomyosin+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).</li>
<li>Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+actin-dependent+localization+modulates+the+evolutionarily+conserved+activity+of+Shroom+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins.</a> J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).</li>
<li>Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+isoforms+of+drosophila+shroom+define+spatial+requirements+for+the+induction+of+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction.</a> Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).</li>
<li>Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom2+regulates+contractility+to+control+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Shroom3+and+Rho-kinase+is+required+for+neural+tube+morphogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice.</a> Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).</li>
<li>Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+interaction+of+ROCKI+with+the+switch+regions+of+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA.</a> J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+highly+conserved+domain+of+Rock1+required+for+Shroom-mediated+regulation+of+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology.</a> PLoS One. 8 (12), e81075(2013).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Shroom+domain+2+reveals+a+three-segmented+coiled-coil+required+for+dimerization%2C+Rock+binding%2C+and+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction.</a> Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).</li>
<li>Tu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+coiled-coil+domain+from+human+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I.</a> PLoS One. 6 (3), e18080(2011).</li>
<li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539(2011).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+protein+staining+in+polyacrylamide+gels+with+a+new+type+of+Coomassie+Brilliant+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue.</a> Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Jungbauer, A., Hahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).</li>
<li>Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+the+effects+of+reversible+dimerization+in+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography.</a> J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).</li>
<li>Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+historical+perspective+on+protein+crystallization+from+1840+to+the+present+day%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day.</a> FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).</li>
<li>Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGenTHREADER+and+pDomTHREADER%3A+new+methods+for+improved+protein+fold+recognition+and+superfamily+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).</li>
<li>Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+protein+domain+assignment+from+amino+acid+sequence+using+predicted+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure.</a> Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Elsliger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCSG+high-throughput+structural+biology+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">The JCSG high-throughput structural biology pipeline.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).</li>
<li>Bach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+as+a+molecular+chaperone+for+recombinant+intracellular+cytoplasmic+single-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.</a> J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).</li>
<li>Strong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+structural+genomics+of+complexes%3A+crystal+structure+of+a+PE%2FPPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li>
<li>Heras, B., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-crystallization+treatments+for+improving+diffraction+quality+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するプロトコルは、ユーザーが自分の結晶化を促進するために大規模なコイルドコイルタンパク質内ドメインの境界を識別するのに役立つように設計されています。プロトコルは、潜在的なドメイン境界の系列を生成する計算予測と他のソースからのデータの様々な全体的な組み込みに依存しています。これらは、迅速かつ安価であり、さらにこれらの初期の仮説を絞り込むために使用されている生化学的実験のセットが続いています。このアプローチを使用して、ユーザーはすぐに望ましくない潜在的なタンパク質断片を排除し、より良い候補者にもっと注意を集中することにより、結晶を得るの見通しを向上させることができました。 多くの重要なステップは、架空のドメイン境界の初期セットの開発など結晶の製造のためのような重要などれもが、しかし、この技術の中にはありません。このステップでは、情報OBとしてだけでなく、計算の様々なアプローチを取り入れときに利用可能な文献や機能データからtained。ケアは、予測のいずれかに定量化可能な信頼値を取り付ける場所には方法が現在存在しないように、単一の「最良の」ソリューションに至るまで、すぐに磨くた...

X線結晶学を介した構造の決意は、現代生物学のあらゆる分野への根本的な貢献をしてきました。生活とどのように彼らは様々な状況下で互いに対話をサポートする巨大分子の原子ビューを提供します。私たちは、病気を引き起こすメカニズムを理解することを可能にし、合理的疾患を治療するための薬を設計する機会を提供します。結晶学は長い高分子構造を決定するための支配的な実験的手法となっており、現在の構造データベース（www.rcsb.org）の89.3パーセントを占めています。この技術は、非常に高解像度のための潜在的な、サイズの広い範囲、比較的容易なデータ収集、および高分子は、溶媒だけでなく、リガンドと相互作用する方法を視覚化する機会を巨大分子を可視化する機能など、多くの利点があります。 組換えタンパク質発現1,2における数多くの技術の向上にもかかわらず、PURification 3、及びこれらのシステム4、結晶過程における単一の最大の障害物を生成するために使用される分子生物学、回折品質結晶を成長させる能力が残ります。これは、大規模なコイルドコイルドメインを含むタンパク質のために特に当てはまるてきました。すべてのアミノ酸の5％ほどが、この非常に共通の構造的特徴7作り、コイルドコイル内で5,6を発見し 、まだこれらのタンパク質は、多くの場合、より多くの困難を精製し、結晶化さ球状タンパク質よりも8-10されていると推定されています。これはさらに、コイルドコイルドメインは、多くの場合、したがって、正しく多くの場合、結晶化のために有害である非構造化またはフレキシブル配列の包含を回避することが重要であり、これらのドメインの境界を予測する、より大きなタンパク質のコンテキスト内で見出されるという事実によって悪化します。 ここでは、Webベースの計算を組み合わせた概念フレームワークは、エクスペリと分析を提示構造研究、そしてどのように準備し、結晶化の試行の前に、タンパク質サンプルを特徴づけるためのタンパク質断片（複数可）を選択する方法：ベンチからリットルのデータは、結晶学的プロセスの初期段階を含むを通じてガイドのユーザーを支援します。私たちは、大規模なコイルドコイルドメインを含む二つのタンパク質に我々の分析に焦点を当てる、マッシュルーム（SHRM）とRhoキナーゼ（ロック）。両者がコイルドコイルドメインを含み、生物学的に関連する複合体11-16を形成することが知られているように、これらのタンパク質を選択しました。マッシュルームとRhoキナーゼ（ロック）は、それぞれ構造的に17-20特徴づけられているそのうちの多くの部分をコイルドコイルの〜200および680残基を含むことが予想されています。ここに記載された方法は、迅速に結晶化やすいであろうコイルドコイル含有タンパク質のフラグメントを同定するための合理化されたワークフローを提供し、しかし、記載された技術は、簡単にほとんどのタンパク質またはタンパク質複合体のために適合さまたは高スループットapproaを組み込むように修正することができますCHESとして利用できます。最後に、これらの方法は、一般的に安価であり、ほぼすべての経験レベルでユーザが実行することができます。

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) ロゼッタ</td><td>エムドミリポア</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) スター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) コドンプラス</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズ 230245</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>スペクトラムケミカル Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA樹脂</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td>Hampton research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp;96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>オーバーナイトエクスプレス自動誘導システム1</td><td>EMD Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Lysogenyブロス</td><td>パウダーThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

構造決定のための結晶を得ることは、どのタンパク質にとっても困難で時間のかかる提案です。コイルドコイルタンパク質とドメインは自然界のいたるところに見られますが、その物理的特性と凝集傾向のために、伝統的に結晶化が特に難しいと考えられてきました。ここでは、特定のコイルコイルタンパク質の一連の可能なドメイン境界を特定し、溶液中のこれらのタンパク質の挙動を迅速に特徴付けるように設計された、さまざまな迅速で簡単な手法を利用します。強蛍光タグ(mRuby2)を追加することで、タンパク質の特性評価が簡単かつ簡単になります。標的タンパク質は、通常の照明下で容易に視覚化でき、適切なイメージャーを使用して定量できます。目標は、成功する可能性が低いために結晶化パイプラインから削除できる候補を迅速に特定し、最良の候補により多くの時間を確保し、結晶を生成しないタンパク質に費やす資金を減らすことです。このプロセスは、初期のスクリーニング作業から得られた情報を組み込むために反復することができ、ハイスループットの発現および精製手順に適合させることができ、結晶化のためのロボットスクリーニングによって強化されます。

本システムで利用するワークフローを示す図で、図1に示されており、三つの主要な段階を含みます。配列のコンピューター分析は、関心のコイルドコイルタンパク質のドメイン境界についての仮説を開発するために利用されます。 Shrm2 SD2ドメインの注釈付きの分析の例を図2に示されています。この図では、目標はマッシュルームがSD2と呼ばれる細胞骨格レギュレータのC末端に保存されたドメインのための可能なドメインの境界を同定することでした。この分析から架空のドメイン境界の三つの異なるセットは、結晶化のための最良の候補として終わったC末端付近全体の保存SD2または最小限のフラグメントにまたがるコイルドコイル断片を含む生成されたました。配列解析から同定候補者は、その後すぐにmRuby2でタンパク質融合を使用して、小規模でテストされている（ 図3）FO効率的な解析をrの。代表小規模（培養の50ミリリットル）2彼の10 -mRuby2タグ付きタンパク質の精製は<strong...

私たちは、大規模なコイルドコイルドメインの特性評価と結晶化を導くための簡単な生化学的および計算的分析を組み込んだフレームワークを記述します。このフレームワークは、球状タンパク質に適合させることも、さまざまなハイスループット技術を組み込むために拡張することもできます。

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

この手順の全体的な目標は、大きなコイルコイルタンパク質内の可能なドメイン境界を迅速に特定してテストし、結晶化する内因性フラグメントを見つける可能性を向上させることです。この方法は、研究者が結晶化が難しいことで有名な大きなコイルドコイルタンパク質の結晶化プロセスを効率化するのに役立ちます。この手法の利点は、実験方法と計算方法の両方を統合して、結晶化の可能性のある候補を迅速に特定してスクリーニングし、成功の可能性を高めることです。この手法を実証するのは、私の研究室の大学院生であるJenna Zalewskiと、私の研究室の学部生研究者であるKeith O'Conorです。まず、確立されたWebベースのツールからの出力を組み合わせて、テキストプロトコルで説明されているように、可能なコイルコイルドメイン境界の予測を生成します。発現プラスミドを作製し、本文に詳述されているように発現レベルをテストした後、Rubyタグ付きタンパク質の発現に成功した各株の精製を開始します。細胞を溶解するには、まず、解凍した各細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を添加した1.5ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。1ミリグラム/ミリリットルの濃度で30マイクロリットルのリゾチームを添加し、室温で20分間インキュベートした後、使用する機器の指示に従って超音波処理します。テーブルトップ遠心分離機でサンプルを14, 000倍Gで30分間遠心分離し、不溶性物質または未溶解細胞をペレット化します。上清とペレットの両方を保存して、SDS-PAGEによるその後の分析に役立ててください。ニッケルアフィニティー精製を行うには、まず100マイクロリットルのニッケルNTAビーズをインキュベートし、溶解性溶解物を含む溶解緩衝液で5〜10分間予洗浄します。懸濁液を数回反転させてビーズを混合します。サンプルをGの800倍で30秒間遠心分離し、卓上遠心分離機でビーズをペレット化します。これに続いて、ペレットを溶解バッファーで3〜5回洗浄し、非特異的な汚染物質を洗い流します。最後に、1モルのイミダゾールを添加した溶解バッファーでビーズからRuby融合タンパク質を溶出します。280ナノメートルに設定された分光光度計を使用してRuby融合タンパク質の濃度を測定し、1〜5マイクログラムの融合タンパク質をネイティブPAGEゲルにロードしてサンプルの均一性を評価します。10%ネイティブのPAGEゲルを摂氏4度で175ボルトで140分間泳がせます。蛍光を可視化する装置を備えたイメージャーを使用してネイティブPAGEをイメージングし、このアッセイでRubyタグ付き融合が移動する場所を観察します。最初に95マイクロリットルのRuby-Shroom SD2融合と5マイクロリットルの0.025 Subtilisin A.Sampleの時間点で反応をサンプリングし、0.5、2、5、15、60、および120分の時点で反応をサンプリングし、各時間点の反応から10マイクロリットルを除去し、15%アクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGEを介して反応の進行を視覚化することにより、安定して折り畳まれたドメインを特定するための限定的なタンパク質分解を実行します。ゲルをクマシーブルーで染色し、プロテアーゼ耐性種を同定できるかどうかを評価します。精製効率、ネイティブPAGEでの挙動、および部分的に精製されたmRuby2-Shroom融合タンパク質の限定的なタンパク質分解からのデータを統合して、溶液中のこれらのタンパク質の全体的な挙動を包括的に評価します。mRuby2-Shroom SD2の2リットル培養で大規模な発現を行い、5〜20ミリグラムの完全精製サンプルを達成することを目標としています。細胞増殖後、Gの8,000倍で10分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。得られた細胞ペレットは、必要になるまで摂氏マイナス80度で保存することができます。次に、凍結細胞ペレット1グラムあたり約8ミリリットルの溶解緩衝液にペレットを再懸濁します。ホモジナイザーを使用して再懸濁した細胞を溶解します。細胞溶解に続いて、Gの30,000倍で30分間遠心分離することにより、細胞破片をペレット化します。次に、10ミリリットルの予備洗浄ニッケルNTA樹脂を使用して可溶性画分をバッチ結合します。ビーズ懸濁液を適切な重力カラムに注ぎ、未結合のタンパク質を排出した後、40ミリリットルの溶解バッファーで樹脂を3〜5回洗浄し、続いて1モル塩化ナトリウムを添加した溶解バッファーで洗浄します。80ミリモルのイミダゾールを添加した40ミリリットルの溶解緩衝液で樹脂の最終洗浄を行います。Ruby-Shroom融合タンパク質を、1モルのイミダゾールを含む40ミリリットルの溶解緩衝液で溶出します。溶出したタンパク質を4〜10ミリリットルの画分に手動で分画します。Ruby-Shroom融合タンパク質を含む画分を10%SDS-PAGEゲルで確認します。融合タンパク質の25〜50ミリグラムごとに1ミリグラムのTEVプロテアーゼを添加して、Rubyタグを削除します。次に、6〜8キロダルトンの分子量カットオフ透析チューブを使用して、適切な画分をTEV切断バッファーに透析します。タンパク質を室温で一晩、ゆっくりと攪拌しながら透析します。透析後、ニッケルアフィニティー精製ステップを繰り返します。Shroom-SD2ドメインは非結合画分に流れ込み、Rubyタグはレジンに結合したままになります。スピン濃縮器を使用して、ピーク画分を約 10 ミリグラム/ミリリットルに濃縮し、12%SDS-PAGE ゲルを介してピーク画分を分析するサイズ排除クロマトグラフィーを実行します。ピーク画分をプールした後、溶液を結晶化バッファーに透析し、透析したタンパク質を結晶化前に10ミリグラム/ミリリットルまで濃縮します。12種類の条件をスクリーニングし、24個のウェルシッティングドロップ結晶化トレイを使用して、結晶化試験に最適なタンパク質濃度を特定します。蒸気拡散法を用いて結晶化試験を行います。まず、12の条件のそれぞれについて500マイクロリットルを別々のウェルにピペットで移します。各台座に、1マイクロリットルのウェル溶液と1マイクロリットルのタンパク質サンプルを含む滴を作ります。トレイを透明なテープですばやく密封してから、振動のない適切な温度制御された環境にトレイを移動します。次の3日間でトレイ内の滴を顕微鏡で最大100倍の倍率で調べます。3日間の期間の終わりに、各ドロップに降水量、小雨、大雨、または結晶が含まれていないとスコアを付けます。適切なタンパク質濃度には、6回以下の激しい降水量が含まれている必要があります。測定したタンパク質濃度を使用して、市販の幅広い結晶化スクリーニングをスクリーニングします。リキッドハンドリングロボットまたは結晶化ロボットを使用すると、このプロセスが大幅にスピードアップすると同時に、液滴の誤差も最小限に抑えられます。必要なタンパク質がはるかに少ないため、ユーザーは1つのサンプルでより多くの条件をスクリーニングできます。ブロードスクリーンから特定された初期条件を改善するには、以前と同様に、24ウェルスクリーントレイを使用して結晶化液滴内の各変数を体系的に変化させます。限定的なタンパク質分解は、タンパク質の柔軟性がある領域、またはプロテアーゼによりアクセスしやすい領域を特定するために使用されます。ここに示されているのは、タンパク質分解に敏感なSD2ドメインと、非常に安定しているSD2ドメインの分解パターンです。限定的なタンパク質分解は、Ruby融合タンパク質のコンテキスト内で行われました。この場合、RubyとSD2ドメインの間のリンカー配列は予想通り急速に切断されましたが、結果として得られるRubyとSD2のフラグメントはほぼ安定していました。ネイティブPAGEによる分析により、結晶化に適した候補を迅速に明らかにすることができます。異なるタンパク質電池を持つ4つのShroom-Rock複合体を、天然のPAGEゲルで泳動しました。岩石834から913を含む錯体は、最良の振る舞いを持ち、容易に結晶化しましたが、他の錯体は劣化時にのみ結晶化するか、完全に結晶化しませんでした。このビデオを見れば、大きなコイルドコイルタンパク質の潜在的なドメイン境界のセットを開発する方法と、Rubyシステムを使用して結晶化の最適な候補を迅速かつ迅速に特定する方法について十分に理解できるはずです。結晶学は依然として時間のかかる作業ですが、この手法を使用すると、単純なアッセイを使用して結晶化するタンパク質の検索に集中し、不良な候補を取り除くことができ、成功の見通しが立っている候補により多くの時間を費やすことができます。この手順を試行する際は、ドメイン境界を選択する際にできるだけ多くの情報を含めることを忘れないでください。この手順を利用する際に選択する情報は、タンパク質ごとに異なります。可能であれば、細胞ベースアッセイや生化学的アッセイなどの他の方法を実施して、問題のタンパク質断片が生物学的に関心のある機能をまだ含んでいることを確認する必要があります。この方法はコイルドコイルタンパク質に焦点を当てていますが、全体的なフレームワークはほとんどすべてのタンパク質に容易に適応できます。特定の機器や生物学的試薬の取り扱いは危険な場合があり、この手順を実行する際には、手袋の使用や保護メガネの着用などの予防措置を常に守る必要があることを忘れないでください。

combining-wet-dry-lab-techniques-to-guide-crystallization-large

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

分子の3次元構造がどのように分子の機能のユニークな理解を提供します。ニア原子分解能で構造決定のための主要な方法は、X線結晶です。ここで、我々はX線結晶構造決定に適している任意の高分子の三次元結晶を得るための現在の方法を示しています。...

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

プロトコルは、LCP結晶化試験と収穫結晶の設定、LCP - FRAPプリ結晶アッセイで初期条件を見つけることが、脂質キュービック相（LCP）におけるタンパク質の再構成から開始して膜タンパク質の回折品質結晶を得るために不可欠な手順を説明します。...

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Bicellesは、脂質二重層内での膜タンパク質（MPS）を維持するが結晶化ロボットによるハイスループットスクリーニングを容易にするユニークな相挙動を持っている脂質/両親媒性物質混合物である。この手法は、正常に原核生物と真核生物の両方のソースから高解像度の構造体の数を生産している。このビデオでは、結晶化の試験を設定する（手動でだけでなく、ロボット制御）と媒体から結晶を収穫、bicelle混合物中にMPを搭載した、脂質bicelleの混合物を生成するためのプロトコルについて説明します。...

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

構造に基づいたドラッグデザインは、薬物開発において重要な役割を果たしている。並行して複数のターゲットを追求すると、大幅にリード発見のための成功の可能性が高くなります。次の記事では、感染症のためにシアトル構造ゲノム科学センターでは、PB2インフルエンザサブユニットの遺伝子対構造決定のためのマルチターゲットアプローチを利用してどのように強調しています。...

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。...

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

これは、分泌されたグリコシル化された哺乳類タンパク質の生産と、その後のX線結晶構造解析やその他の生物物理学的研究のための十分な収量の均質なタンパク質のシングルステップ精製のための迅速で費用対効果の高いプロトコルです。...

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

自動化されたシステムと画面の大きい数のルーチンの準備のためのプロトコル、蒸気拡散実験のためのナノリットル結晶滴は説明し、説明しました。...

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

タンパク質の結晶化制御用プロトコルをご紹介します。プロセスは、いくつかの結晶化パラメーターの制御操作をできるように自動化されたデバイスを使用します。タンパク質の結晶化が行われてアウト監視および結晶化液滴の粒子径分布を調査しながら結晶化ソリューションの制御と自動添加による。...

タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

提示されたプロトコルは、96ウェルハイスループット透析プレートを使用してタンパク質結晶化条件と結晶成長をスクリーニングするための簡単なアプローチを説明しています。微結晶の大規模な成長のためのダイアライザーチューブの使用は、シリアル結晶学およびMicroEDアプリケーションでも実証されています。...

マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化

このプロトコルはステロールの運送者ABCG5/G8の結晶化のための組み立てを記述する。ABCG5/G8は、ハンギングドロップ結晶化のためにバイセルに再構成されます。このプロトコルは特殊な材料や基質を必要としないため、X線結晶構造解析によってタンパク質の構造を決定するために、あらゆる実験室でアクセスしやすく、簡単に適応できます。...

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

学ぼう、大コイルドコイルタンパク質の結晶化手法。ウェットとドライラボ技術を組み合わせ、計算予測と実験的検証を統合して結晶化成功率を向上させる革新的なフレームワークです。

大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

さらに動画を探す