大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

この手順の全体的な目標は、大きなコイルコイルタンパク質内の可能なドメイン境界を迅速に特定してテストし、結晶化する内因性フラグメントを見つける可能性を向上させることです。この方法は、研究者が結晶化が難しいことで有名な大きなコイルドコイルタンパク質の結晶化プロセスを効率化するのに役立ちます。この手法の利点は、実験方法と計算方法の両方を統合して、結晶化の可能性のある候補を迅速に特定してスクリーニングし、成功の可能性を高めることです。

この手法を実証するのは、私の研究室の大学院生であるJenna Zalewskiと、私の研究室の学部生研究者であるKeith O'Conorです。まず、確立されたWebベースのツールからの出力を組み合わせて、テキストプロトコルで説明されているように、可能なコイルコイルドメイン境界の予測を生成します。発現プラスミドを作製し、本文に詳述されているように発現レベルをテストした後、Rubyタグ付きタンパク質の発現に成功した各株の精製を開始します。

細胞を溶解するには、まず、解凍した各細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を添加した1.5ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。1ミリグラム/ミリリットルの濃度で30マイクロリットルのリゾチームを添加し、室温で20分間インキュベートした後、使用する機器の指示に従って超音波処理します。テーブルトップ遠心分離機でサンプルを14, 000倍Gで30分間遠心分離し、不溶性物質または未溶解細胞をペレット化します。

上清とペレットの両方を保存して、SDS-PAGEによるその後の分析に役立ててください。ニッケルアフィニティー精製を行うには、まず100マイクロリットルのニッケルNTAビーズをインキュベートし、溶解性溶解物を含む溶解緩衝液で5〜10分間予洗浄します。懸濁液を数回反転させてビーズを混合します。

サンプルをGの800倍で30秒間遠心分離し、卓上遠心分離機でビーズをペレット化します。これに続いて、ペレットを溶解バッファーで3〜5回洗浄し、非特異的な汚染物質を洗い流します。最後に、1モルのイミダゾールを添加した溶解バッファーでビーズからRuby融合タンパク質を溶出します。

280ナノメートルに設定された分光光度計を使用してRuby融合タンパク質の濃度を測定し、1〜5マイクログラムの融合タンパク質をネイティブPAGEゲルにロードしてサンプルの均一性を評価します。10%ネイティブのPAGEゲルを摂氏4度で175ボルトで140分間泳がせます。蛍光を可視化する装置を備えたイメージャーを使用してネイティブPAGEをイメージングし、このアッセイでRubyタグ付き融合が移動する場所を観察します。

最初に95マイクロリットルのRuby-Shroom SD2融合と5マイクロリットルの0.025 Subtilisin A.Sampleの時間点で反応をサンプリングし、0.5、2、5、15、60、および120分の時点で反応をサンプリングし、各時間点の反応から10マイクロリットルを除去し、15%アクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGEを介して反応の進行を視覚化することにより、安定して折り畳まれたドメインを特定するための限定的なタンパク質分解を実行します。ゲルをクマシーブルーで染色し、プロテアーゼ耐性種を同定できるかどうかを評価します。精製効率、ネイティブPAGEでの挙動、および部分的に精製されたmRuby2-Shroom融合タンパク質の限定的なタンパク質分解からのデータを統合して、溶液中のこれらのタンパク質の全体的な挙動を包括的に評価します。

mRuby2-Shroom SD2の2リットル培養で大規模な発現を行い、5〜20ミリグラムの完全精製サンプルを達成することを目標としています。細胞増殖後、Gの8,000倍で10分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。得られた細胞ペレットは、必要になるまで摂氏マイナス80度で保存することができます。

次に、凍結細胞ペレット1グラムあたり約8ミリリットルの溶解緩衝液にペレットを再懸濁します。ホモジナイザーを使用して再懸濁した細胞を溶解します。細胞溶解に続いて、Gの30,000倍で30分間遠心分離することにより、細胞破片をペレット

次に、10ミリリットルの予備洗浄ニッケルNTA樹脂を使用して可溶性画分をバッチ結合します。ビーズ懸濁液を適切な重力カラムに注ぎ、未結合のタンパク質を排出した後、40ミリリットルの溶解バッファーで樹脂を3〜5回洗浄し、続いて1モル塩化ナトリウムを添加した溶解バッファーで洗浄します。80ミリモルのイミダゾールを添加した40ミリリットルの溶解緩衝液で樹脂の最終洗浄を行います。

Ruby-Shroom融合タンパク質を、1モルのイミダゾールを含む40ミリリットルの溶解緩衝液で溶出します。溶出したタンパク質を4〜10ミリリットルの画分に手動で分画します。Ruby-Shroom融合タンパク質を含む画分を10%SDS-PAGEゲルで確認します。

融合タンパク質の25〜50ミリグラムごとに1ミリグラムのTEVプロテアーゼを添加して、Rubyタグを削除します。次に、6〜8キロダルトンの分子量カットオフ透析チューブを使用して、適切な画分をTEV切断バッファーに透析します。タンパク質を室温で一晩、ゆっくりと攪拌しながら透析します。

透析後、ニッケルアフィニティー精製ステップを繰り返します。Shroom-SD2ドメインは非結合画分に流れ込み、Rubyタグはレジンに結合したままになります。スピン濃縮器を使用して、ピーク画分を約 10 ミリグラム/ミリリットルに濃縮し、12%SDS-PAGE ゲルを介してピーク画分を分析するサイズ排除クロマトグラフィーを実行します。

ピーク画分をプールした後、溶液を結晶化バッファーに透析し、透析したタンパク質を結晶化前に10ミリグラム/ミリリットルまで濃縮します。12種類の条件をスクリーニングし、24個のウェルシッティングドロップ結晶化トレイを使用して、結晶化試験に最適なタンパク質濃度を特定します。蒸気拡散法を用いて結晶化試験を行います。

まず、12の条件のそれぞれについて500マイクロリットルを別々のウェルにピペットで移します。各台座に、1マイクロリットルのウェル溶液と1マイクロリットルのタンパク質サンプルを含む滴を作ります。トレイを透明なテープですばやく密封してから、振動のない適切な温度制御された環境にトレイを移動します。

次の3日間でトレイ内の滴を顕微鏡で最大100倍の倍率で調べます。3日間の期間の終わりに、各ドロップに降水量、小雨、大雨、または結晶が含まれていないとスコアを付けます。適切なタンパク質濃度には、6回以下の激しい降水量が含まれている必要があります。

測定したタンパク質濃度を使用して、市販の幅広い結晶化スクリーニングをスクリーニングします。リキッドハンドリングロボットまたは結晶化ロボットを使用すると、このプロセスが大幅にスピードアップすると同時に、液滴の誤差も最小限に抑えられます。必要なタンパク質がはるかに少ないため、ユーザーは1つのサンプルでより多くの条件をスクリーニングできます。

ブロードスクリーンから特定された初期条件を改善するには、以前と同様に、24ウェルスクリーントレイを使用して結晶化液滴内の各変数を体系的に変化させます。限定的なタンパク質分解は、タンパク質の柔軟性がある領域、またはプロテアーゼによりアクセスしやすい領域を特定するために使用されます。ここに示されているのは、タンパク質分解に敏感なSD2ドメインと、非常に安定しているSD2ドメインの分解パターンです。

限定的なタンパク質分解は、Ruby融合タンパク質のコンテキスト内で行われました。この場合、RubyとSD2ドメインの間のリンカー配列は予想通り急速に切断されましたが、結果として得られるRubyとSD2のフラグメントはほぼ安定していました。ネイティブPAGEによる分析により、結晶化に適した候補を迅速に明らかにすることができます。

異なるタンパク質電池を持つ4つのShroom-Rock複合体を、天然のPAGEゲルで泳動しました。岩石834から913を含む錯体は、最良の振る舞いを持ち、容易に結晶化しましたが、他の錯体は劣化時にのみ結晶化するか、完全に結晶化しませんでした。このビデオを見れば、大きなコイルドコイルタンパク質の潜在的なドメイン境界のセットを開発する方法と、Rubyシステムを使用して結晶化の最適な候補を迅速かつ迅速に特定する方法について十分に理解できるはずです。

結晶学は依然として時間のかかる作業ですが、この手法を使用すると、単純なアッセイを使用して結晶化するタンパク質の検索に集中し、不良な候補を取り除くことができ、成功の見通しが立っている候補により多くの時間を費やすことができます。この手順を試行する際は、ドメイン境界を選択する際にできるだけ多くの情報を含めることを忘れないでください。この手順を利用する際に選択する情報は、タンパク質ごとに異なります。

可能であれば、細胞ベースアッセイや生化学的アッセイなどの他の方法を実施して、問題のタンパク質断片が生物学的に関心のある機能をまだ含んでいることを確認する必要があります。この方法はコイルドコイルタンパク質に焦点を当てていますが、全体的なフレームワークはほとんどすべてのタンパク質に容易に適応できます。特定の機器や生物学的試薬の取り扱いは危険な場合があり、この手順を実行する際には、手袋の使用や保護メガネの着用などの予防措置を常に守る必要があることを忘れないでください。