細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証
December 10th, 2015
核膜タンパク質は、多くの基本的な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしており、さまざまなヒトの病気に関与しています。 このプロトコルは、LINC複合体の破壊の時空間制御を可能にする新しいCre/Loxベースのマウスモデルを記述しています。
この実験の全体的な目標は、トランスジェニックマウスモデルの有用性を説明することであり、蛍光タグ付きEGFPキャッシュ、in vivoでの2つのペプチドの誘導性および標的発現、およびその結果としての内因性リンク複合体の破壊を可能にします。この実験では、蛍光タグ付きキャッシュの発現2つを小脳パーキン細胞に標的とする。この遺伝的アプローチは、さまざまなほとんどの組織内の核の位置におけるリンク複合体の役割に関する重要な問題に対処できます。
E-G-F-P-K twoの誘導性および標的発現には、いくつかの利点があります。まず、既存のクルーズ系統を持つケイマウスの単一の繁殖スキームが必要です。第二に、このアプローチは、リンク複合体コンポーネントの生殖細胞変異のマウスモデルで観察される周産期性を回避します。
最後に、この方法は、特定の細胞または組織内のリンク複合体の生理学を研究することを可能にします。生体内で。ラボのメンバーであるChloe Potterが、小脳BurkinG細胞のE-G-F-P-K 2を視覚化するために必要なさまざまなステップを紹介します。
まず、PCPを用いたclac Zマウスを2つのCREマウスで、以前の出版物に記載されたようにPCP 2つのCAG C2つのマウスを作製する。出来上がった仔が生まれたら、ジェノタイピングを行います。前述のようにEGFPとクリートランスジーンの両方を有するものを特定するには、PBSに30%スクロース溶液を50ミリリットル調製し、適切な年齢で組織採取の日まで摂氏マイナス20度で保存し、麻酔下でマウスのトランスカーディオ灌流を行い、書面によるプロトコルに記載されているように脳組織を解剖するために準備します。 解剖した脳を10ミリリットルのPBSを含む10センチメートルの組織培養プレートに入れ、小脳を脳から分離します。
次に、メスを使用して矢状面の小脳を解剖し、切片を30%ショ糖溶液に移し、摂氏4度で一晩保存します。ドライアイスと2つのメチルブタンのスラリーを準備します。お風呂の温度を5分間平衡化させます。
次に、クライオ型にOCT化合物を充填し、解剖顕微鏡と一対の鉗子を使用して、解剖した小脳の半分を型に入れます。小脳の正中線近くにある二分割面が型の中で上を向くように小脳を配置します。次に、OCT化合物が組織標本の周囲に固体の白いマトリックスを形成するまで、クライオ型をドライアイスラリーに5分間移します。
埋め込まれた標本は、必要になるまで摂氏マイナス20度で保管してください。組織切片を採取するための前処理されたポリリジンスライドをラベル付けし、新鮮なOCTで小脳組織のブロックを組織ホルダーに取り付けます。ブロックがしっかりと取り付けられたら、ティッシュホルダーを取り付け、ティッシュに到達するまで余分なOCTを取り除くために40マイクロメートルのスライスを剃ります。
厚さを15マイクロメートルに設定し、OCTセクションをスライドのポリリジンコーティング面と慎重に接触させてセクションを収集します。組織切片は、染色とイメージングに進むまで、マイナス20°Cで保存します。続行する準備ができたら、蛍光タンパク質の退色を防ぐために、暗闇で小脳切片を解凍します。
疎水性バリアペンを使用して、組織切片の周囲に長方形を描きます。約500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを切片に5分間加えて、組織を後固定します。次に、ピペットで組織切片を乱さないように特に注意する必要がありますが、真空を使用して固定液を吸引します。
組織切片を乱さずにスライドにPBSを優しく塗布します。5分後、真空ピペットを使用して液体を慎重に取り除き、PBSすすぎを合計3回繰り返します。次に、スライドに約500マイクロリットルのブロッキング溶液を加え、10分間インキュベートします。
ブロッキング溶液を取り外し、1〜300希釈のcal結合抗体またはnesin 2抗体を含む同じ溶液と交換します。次に、抗体溶液を取り出し、スライドをPB S3ですすいでください。スライドを暗所で室温で1時間インキュベートします。
次に、牛の結合標識スライド用の抗US Alexaフロア5 94とネスプリン2つの標識スライド用の抗Alexa Fluor 5 94の1〜1000希釈液を調製し、ブロッキング溶液中に溶液を暗所で保存します。最終的なPBSリンスを静かに取り除き、希釈した二次抗体で切片を暗所で1時間覆います。インキュベーション後、二次抗体溶液を取り出します。
次に、PBSに300ナノモルのDPIなどの核染色を5分間塗布します。その後、切片をPBSでさらに2回すすぎます。PBS溶液をできるだけ多く取り除き、組織切片を1滴の封入剤で覆います。
気泡を避けてティッシュ部分の上にガラスカバースリップを置き、暗所で室温で15〜30分間置いておきます。次に、蛍光顕微鏡を使用して、抗体の染色と蛍光タンパク質を視覚化します。小脳スライスの場合は、20 x または 40 x の対物レンズを使用します。
ここに示すように、E-G-F-P-C の 2 つの核リムを表示するには、E-G-F-P-C の 2 つをフィッツィー チャネルの小脳スライスで直接視覚化できます。さらに、EGFPとウシ結合との共局在化は、パーキン細胞を特異的に標識するため、E-G-F-P-Cの2つの発現がパーキン細胞内のパーキン細胞に限局していることが確認されています。EGFPキャッシュ2は、核の周囲に観察されるEGFPポジティブRIMのようなパターンで示されるように、核膜を標的としています。
この例では、EGFPキャッシュ2の発現が、結合陽性のPerkin細胞のウシの70%以上で検出されました。EGFPキャッシュは、利用可能な太陽ドメインの飽和を通じて、核膜から内因性ネスプリンを2つ置換します。したがって、内因性NESIN 2は、EGFPキャッシュ2を発現するPerkin細胞の核膜から置換される。
E-G-F-P-C 2を発現しないPerkin細胞は、予想通り核膜に内在性ネシン2を保持しているが、CREリコンビナーゼを発現していない細胞は、ビキニ細胞集団全体の核膜にNESIN 2を示す。そのため、組織のCTブロックが利用可能です。E-G-F-P-Kの2つを約4時間で可視化できます。
この手順を試みる際には、PFFの固定や埋め込み条件の程度がエピトープの抗原性に大きく影響する可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、特定のエピトープを保存する最適な固定条件を決定することが非常に重要です。このビデオを見れば、CK 2トランスジェニックマウスモデルを使用して、VGFPカシューナッツの発現を特定の組織に標的とする方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、蛍光タグ付きEGFPキャッシュの発現を誘導し、標的化できるトランスジェニックマウスモデルを導入します。このモデルは、内因性のリンク複合体を破壊し、核の位置決めにおけるそれらの役割についての洞察を提供するように設計されています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 細胞生物学
背景
- 核膜タンパク質は様々な生物学的プロセスにとって重要です。
- LINC複合体の破壊はいくつかのヒトの疾患と関連しています。
- 既存のモデルは生殖細胞変異による制限に直面しています。
- この研究は新しいアプローチでこれらの制限を克服することを目指しています。
研究の目的
- LINC複合体を研究するためのマウスモデルを開発すること。
- リンク複合体の破壊の時空間的制御を可能にすること。
- 核の位置決めにおけるリンク複合体の役割を調査すること。
使用された方法
- Cre/Loxベースのトランスジェニックマウスモデルの作成。
- 蛍光タグ付きEGFPキャッシュの発現を誘導すること。
- 発現を小脳プルキンエ細胞に標的化すること。
- 内因性リンク複合体への影響の分析。
主要な結果
- 蛍光タグ付きキャッシュ2の特定の細胞への標的化の成功。
- リンク複合体を破壊するモデルの能力の実証。
- 細胞プロセスにおけるLINC複合体の役割についての洞察。
- 核生物学における重要な質問に対処する可能性。
結論
- トランスジェニックマウスモデルは研究に価値あるツールを提供します。
- 誘導発現は実験における精密な制御を可能にします。
- このアプローチは核の位置決めのより良い理解につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell-specific disruption of LINC complexes using a transgenic mouse model enables precise interrogation of nuclear-cytoskeletal interactions in development and tissue homeostasis. This approach overcomes the limitations of germline knockout models, supporting mechanistic de-risking and target validation in disease-relevant systems. The model's inducibility and specificity provide predictive confidence for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of LINC complex components in specific cell types.
- Supports mechanistic de-risking by isolating nuclear positioning pathways.
- Facilitates hypothesis testing for nuclear-cytoskeletal linkage roles in tissue biology.
- Improves predictive confidence for target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological systems for downstream phenotypic screening.
- Enables reproducible, quantitative imaging of nuclear envelope disruptions.
- Supports assay standardization through cell-type specific genetic control.
- Prepares platforms for reliable compound evaluation targeting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying nuclear positioning defects.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation in tissue-specific contexts.
- De-risks translational biomarker strategies by enabling cell-autonomous analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for nuclear envelope targets.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation, enabling cell-specific hypothesis testing and quantitative readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of nuclear-cytoskeletal interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development.
- Analytics: Provides measurable displacement of endogenous proteins for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable genetic platform adaptable to diverse cell types and tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in nuclear positioning studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of genetic disruption models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling targeted validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of nuclear envelope targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse breeding and Cre/Lox genetic systems.
- Needs access to fluorescence imaging and quantitative analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation to other cell types may require additional Cre driver lines.
- Fixation and embedding conditions must be optimized to preserve antigenicity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Preparation of Mice and Materials for Dissection and Tissue Collection
2:06
Dissection and Tissue Collection
2:38
Tissue Processing and Sectioning
4:06
Staining and Imaging of Cerebellum
6:41
Results: Disruption of Endogenous LINC Complexes in Cerebellar Purkinje Cells
8:07
Conclusion
