Name: 細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶCre/Lox系トランスジェニックマウスモデルを用いた細胞特異的LINC複合体破壊法。蛍光標識EGFP-cKASH2を小脳プルキンエ細胞で誘導発現させ、核位置決定におけるLINC複合体の役割を解析する革新的アプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、分子遺伝学のコア（眼科およびVisual科学科）の医学のセントルイス校のワシントン大学でマウス遺伝学コアの形態とイメージングコアのスタッフに、感謝します。作者は、携帯用のマクドネルセンター分子神経生物学、神経疾患のためのホープセンターから小規模助成プログラムでサポートされている、国立眼研究所（DHへ＃R01EY022632）、国立眼研究所センターコアグラント（＃1 P30EY002687）と眼科およびVisual科学科に失明を防止するための研究から無制限の助成金。

倫理声明：動物を対象とする手順は、セントルイスにあるワシントン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.マウスの繁殖とジェノタイピング<ol><li> （PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）19,20のTgを生成するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）Tgを有するマウス（PCP2-CRE）マウスを飼育。注：このプロトコルの残りは小脳内のプルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（PCP2-CRE）マウス系統の使用に焦点を当てているが、同様の手順は、他のTg（CRE）マウスで追跡することができます（ 図2A）。 </li><li>以前に19を説明したように、両方のEGFPとのCre導入遺伝子を保有する子犬を識別するために、遺伝子型判定を行います。 </li></ol>解剖および組織収集のための材料の作製<ol><li> -20℃で30％のPBS中のスクロース（1×PBS、30gのスクロース/ 100ミリリットル）と店の100ミリリットルを準備します。組織Hの日transcardial灌流35 mlシリンジにarvesting、解凍およびショ糖液の負荷〜30〜35ミリリットル。 </li><li> PBS中の4％PFA（10ミリリットル、16％パラホルムアルデヒド、30 mlのPBS）の40ミリリットルを準備します。 transcardial灌流35 mlシリンジにロード〜30〜35ミリリットルの4％PFA。 </li><li>組織切開のためにPBS 10mlで10cmの組織培養プレートを埋めます。 </li><li> 16 mg / mlのケタミンおよび3 mg / mlのキシラジンから成るケタミン/キシラジンのカクテルを用意します。 </li><li>解剖のための70％エタノール溶液を調製します。 </li></ol> 3.解剖と組織収集<ol><li> 1mlシリンジを使用して、体重25グラムあたりのケタミン/キシラジンのカクテルの500μLを注入し、15分〜を待ちます。あるいは、目的の生物学的システムに適した別の制度承認鎮静メソッドを使用します。 </li><li>鎮静時に、そっとの背側と発泡スチロールのトレイ上のすべての足をピン、疼痛応答の欠如を確認するために、後部足を挟まマウスを下に向けて。 </li><li> 70％エタノールで腹部をスプレーし、心臓へのアクセスを得るために胸郭の上に下腹部から切開を行います。 </li><li>心臓の右心房に小さな切開を行い、心臓の左心室に30％ショ糖溶液を含む注射器を挿入します。 </li><li> 〜2〜5ミリリットルあたり分の速度で溶液を灌流。ときに空のシリンジを除去し、4％PFA溶液で繰り返します。 </li><li>発泡スチロールのトレイからマウスの固定を解除し、脳にアクセスするために首を切ります。 </li><li>ピンセットやハサミを用いて動物の頭の周りの皮膚を削除します。針で頭蓋骨の後部の穴を突く、慎重にはさみや解剖鉗子で頭蓋骨を削除します。 </li><li>脳は明らかにアクセス可能になると、小脳を除去し、PBS中でそれを置くために鉗子を使用しています。メスで矢状面で小脳を二等分し、4℃で一晩、30％スクロース溶液に移します。注：準備へパラフィン切片は、組織が埋め込み、切片の前に4％PFA中で4℃で一晩小脳を修正しています。 </li></ol> 4.組織処理とセクショニング<ol><li>ドライアイスのスラリーと2-メチルブタンを準備します。浴の温度を5分間平衡化させます。 </li><li> OCT化合物でcryomoldを記入し、金型に二分小脳の半分を置きます。 </li><li>解剖顕微鏡とピンセット位置のペア（小脳の正中線に近い）二等分面が上を向いているように、小脳を使用。 </li><li> OCT化合物は、組織標本の周りの白色の固体マトリックスを形成されるまで5分間ドライアイススラリーにcryomoldを転送します。注：必要に応じて凍結標本は現在、-20℃で保存することができます。 </li><li>組織切片を収集するために前処理されたポリリジンスライドにラベルを付け、Cereの15ミクロン切片を収集するために、製造業者の指示に従ってクライオスタットを準備bellum。セクションを収集するには、慎重にスライドのポリリジンコーティングした側を10月セクションにお問い合わせください。セクションの向きを維持するために、このステップの間にスライドを回転させないでください。 </li><li> -20℃で保存組織切片染色およびイメージングに進むまで。 </li></ol> 5.染色および小脳切片のイメージング<ol><li>組織染色の前に、以下のソリューションを準備します。 PBSの〜50ミリリットル 〜PBS中の4％PFA 5〜10mlの 〜PBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清の10-20 mlの</li><li>小脳のセクションを解凍します。重要なことは、EGFPの退色を防止するために、連続した強い光の任意のソースへの露出を最小限に抑えることができます。 </li><li>疎水性バリアペンを使用して、組織切片の周囲に四角形を描画します。 </li><li> 5分間、4％PFAでセクションをポスト修正。疎水性バリア（通常〜500μL）で区切ら領域全体をカバーするのに十分な液体を使用してください。真空またはピペットを使用して、再組織切片を乱さないように特に注意しながら固定液を移動します。 </li><li>ピペットを用いて、やさしく組織切片を乱すことなく、スライド上のPBSを適用します。 5分後、慎重に液体を除去するために真空またはピペットを使用しています。 PBSを繰り返して合計3回すすいでください。 </li><li>ピペットを使用して、慎重にPBS中0.5％トリトンX-100、10％ロバ血清中（溶液の900μLあたり3μlのカルビンジンおよび/またはNesprin2抗体）は、適切な一次抗体の希釈物を適用します。暗所で室温で1時間インキュベートします。 注：EGFP-KASH2は、凍結切片上の直接蛍光顕微鏡によって見えるようになり、それは抗EGFP抗体を利用する必要はありません。パラフィン切片を調製している場合は、EGFP-KASH2のイメージングは​​、抗EGFP抗体を用いた免疫検出を必要とします。 </li><li>抗体溶液を除去し、PBSで3回すすいでください。 </li><li> 、0.5％トリトンX-100でアレクサ・フルーア二次抗体の希釈液千：1を準備します10％ロバ血清、PBS中、暗所で保管してください。 </li><li>静かに最後のPBSリンスを削除し、暗所で1時間、二次抗体の希釈を適用します。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、セクションを3回洗浄し、洗浄してください。必要であれば、最初のPBS適用中に、このようなDAPI​​などの核染色、（〜300nmの）を適用します。 </li><li>完全組織と組織切片上でメディアをマウントする場所〜5-7μlの周りからのPBS溶液を除去。組織切片の上にカバーガラスを置き、暗所で室温〜15〜30分間のために確保さ。 </li><li> EGFPおよびステップ5.8 / 5.9で使用される二次抗体のための適切な任意の他の波長を可視化するために、適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。小脳切片では、EGFP-KASH2核リムを表示するには、20Xの対物レンズを使用しています。 </li></ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li>
<li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li>
<li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li>
<li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li>
<li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li>
<li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li>
<li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enaptin%2C+a+giant+actin-binding+protein%2C+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li>
<li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

正常のTg（CAG-のLacZ / EGFP-KASH2）モデルを用いてインビボで LINC複合体の役割を研究するための最も重要なステップは、適切なのCreマウス系統を同定することです。 Creが同様の経路に関与する他の細胞型で活性であれば確かに、それは結果の解釈を複雑にすることができます。小脳（ 図2B）の分子および顆粒細胞層にここに示されるように、したがって、それは、近隣の細胞を調べることが重要です。同様に、任意の生理学的に関連する表現型を最大化するためには、目的の細胞型を横切る広範Cre発現とのCre株を同定することが重要です。これは、目的のシステムの開発時にLINC複雑なコンポーネントの発現パターンの詳細な特性評価を行うことも重要です。実際、Tgは（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの欠点の1つは、Sunタンパク質またはNesprins変異体は、生物学的システムに関与しているためにどのように任意の情報を提供しないということであるUファインダーの考慮。しかし、この問題は、両方の転写物およびタンパク質レベルでの厳密な特性評価を実施することによ...

核膜（NE）は、細胞質から核質を分離します。これは、核膜孔に接続し、内側と外側核膜（INMとそれぞれONM）で構成されています。両方の膜で区切らルーメンは核周辺領域（PNS）と呼ばれています。 ONMは、粗面小胞体（ER）を拡張したものであり、INMは核ラミナ、核A-で表さタイプ-Vの中間フィラメントおよびB型ラミン1,2の網目構造に準拠しています。細胞核の骨格と細胞骨格（LINC）複合体のリンカーは、物理的に細胞骨格フィラメントと分子モーター（ 図1A）に核の内部を接続するための全体の核エンベロープにまたがる高分子集合体です。日（SAD1 / Unc84）タンパク質とNesprins（核膜SPectRINS）：彼らは、NEの一体型膜貫通型タンパク質の2家族を特徴づける進化的に保存されたモチーフ間の相互作用で構成されています。哺乳類では、Sun1とSun2 ARN末端 ​​核質地域INMの電子の膜貫通タンパク質は、A及びB型ラミン3-5と直接対話します。 INMの反対側には、PNS内、日タンパク質は、〜150のC末端アミノ酸の進化的に保存されたストレッチを抱い日ドメインと呼ばれます。日ドメインは、進化的に保存さKASH（Klarsicht / ANC-1、あれから相同性）ドメイン、Nesprinsの分子署名と直接対話。 KASHドメインは、膜貫通ドメイン6に続いて、PNS内に突出〜30のC末端アミノ酸のストレッチで構成されています。少なくとも4つの異なるNesprin遺伝子（Nesprin1-4）は、NE 7に局在KASH含有タンパク質をコードします。サイズ〜50kDa（Nesprin4）から驚くほどの千キロダルトン（Nesprin1巨人）に変わるNesprins、の細胞質領域は、複数のスペクトリンは、アクチン、プレクチンと分子モーター8のような細胞骨格成分との相互作用を可能にするだけでなく、特定のモチーフを繰り返し含ま13。 &lt;脊椎動物と無脊椎動物のpクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;研究は、ラミン/日/ Nesprin /分子モーターは、進化的に保存された「軸」の核移行と足場を制御を構成していることが示されています。 LINC複雑なコンポーネントのいくつかのノックアウト（KO）マウスモデルが記載され、哺乳類の発生9,14,15中のNEで太陽とNesprinタンパク質の役割を理解するためのフレームワークを提供することに尽力したされています。最も顕著なのが、本これらのモデルには、いくつかの重大な欠点、：細胞非自律的効果による表現型の解釈に1）困難、KASHレスNesprinは16アイソフォーム対KASH含有の表現型の貢献を区別するのに2）難易度、3）多数の細胞タイプで、NEで太陽とNesprinタンパク質の機能的冗長性は、両方のKASHドメインを欠損したマウス17内のすべてのSUN-KASH相互作用およびマウスの4）周産期致死性を不活性化するために、複雑な繁殖スキームが必要ですNesprins1と2は、大人の表現型18の分析を排除します。 このプロトコルは、このように上記で概説した欠点の多くをバイパスして、細胞自律的かつ発生的に調節方法で、 生体内でのすべてのSUN-KASH相互作用を破壊するように設計された新規マウスモデルを記述しています。これのCre / LOXベースのマウスモデルは、2つの重要な概念に依存している：1）任意の公知Nesprinタンパク質のKASHドメインが細胞培養系内のNEにEGFPを標的とし、2）SUNドメインがの過剰発現、従って、KASHドメインと無差別に相互作用するのに十分です任意のKASHドメインは、すべての内因性日ドメインを飽和させ、ドミナントネガティブな方法17（ 図1B）にLINC複合体を不活性化します。このプロトコルは、小脳プルキンエ細胞内のすべてのSUN-KASHの相互作用の破壊を確認するために使用される組織の収穫と処理手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT 化合物</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>接着スライド</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー 血清</td><td>Σ Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>抗カルビンジン抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>抗EGFP抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>抗Nesprin2抗体</td><td></td><td></td><td>以前に文献21で説明した</td></tr>蛍光<tr><td>マウントメディア</td><td>ダコ</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞特異的にlinc複合体を破壊するマウスモデルの検証

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

発達組織および成体組織内での核移動と定着は、核骨格および細胞骨格(LINC複合体)のリンカーと呼ばれる大きな高分子タンパク質集合体に大きく依存しています。 これらのタンパク質スキャフォールドは核膜にまたがり、核の内部を周囲の細胞質細胞骨格の構成要素に接続します。 LINC複合体は、Sunタンパク質とネスプリンという2つの進化的に保存されたタンパク質ファミリーからなり、それぞれSUNドメインとKASHドメインと呼ばれるC末端分子シグネチャーモチーフを宿しています。 SUNタンパク質は、N末端の核質ドメインが核ラミナと相互作用し、C末端のSUNドメインが核周囲空間に突き出てネスプリンスのKASHドメインと相互作用する、内核膜の膜貫通タンパク質です。 標準的なネスプリンアイソフォームは、細胞質に突出し、細胞骨格の成分と相互作用する可変サイズのN末端を持っています。 このプロトコルは、細胞型特異的な方法で内因性のSUN/KASH相互作用を破壊するドミナントネガティブトランスジェニックマウス戦略の検証を説明しています。 私たちのアプローチは、LINC複合体の不活性化の生殖細胞モデルに関連する周産期致死率や細胞非自律的な表現型などの多くの欠点を回避するCre/Loxシステムに基づいています。 このため、このモデルは、さまざまな組織におけるLINC複合体の発生および恒常性におけるLINC複合体の役割を理解するための有用なツールを提供します。

このプロトコルは、Tgは（PCP2-CRE）マウスを用いた小脳プルキンエ細胞にEGFP-KASH2発現を制限するためのTg（CAG-LacZを/ EGFP-KASH2）マウスモデルの有用性を示しています。 Tgは（PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2）の子孫では、LacZを/ V5オープンリーディングフレームは、それによって特異的にプルキンエ細胞（ 図2A）を対象とし、EGFP-KASH2の発現を導くCreリコンビナーゼによってP6で切除されます。予想されたように核（ 図2B）を中心に観察EGFP陽性リム状のパターンによって示されるように、EGFP-KASH2は核膜を対象にしています。任意の生理学的な表現型を最大にするために、それは、EGFP-KASH2は、細胞特異的抗体マーカーで共染色されたEGFP-KASH2陽性細胞の割合を計算することにより、標的細胞の大部分で発現されることを保証することが重要です。この例では、EGFP-KASH2発現がカルビンジン陽性プルキンエ細胞（ 図2B）の70％以上で検出さ...

核膜タンパク質は、多くの基本的な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしており、さまざまなヒトの病気に関与しています。 このプロトコルは、LINC複合体の破壊の時空間制御を可能にする新しいCre/Loxベースのマウスモデルを記述しています。

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

この実験の全体的な目的は、蛍光タグ付きEGFP cache twoペプチドの誘導可能かつ標的化された発現を可能にするトランスジェニックマウスモデルの有用性と、それに伴う内因性リンク複合体の崩壊を実証することです。本実験では、蛍光タグ付きcache twoの発現を小脳のプルキンエ細胞に標的化します。この遺伝学的アプローチにより、さまざまなマウス組織内における核配置におけるリンク複合体の役割に関する重要な疑問を明らかにすることができます。E-G-F-P-K twoの誘導性および標的性発現には、いくつかの利点があります。第一に、既存のあらゆるcruise系統のマウスとの単一の交配計画のみで済むことです。第二に、この手法により、link complex構成因子の生殖細胞系列変異マウスモデルで観察される周産期の致死性を回避できることです。最後に、この手法を用いることで、特定の細胞や組織におけるリンク複合体の生理学的研究が可能になります。in vivoにおいて、研究室のメンバーであるChloe Potterが、小脳のプルキンエ細胞でE-G-F-P-K2を可視化するために必要な各ステップを解説します。まず、既報の通り、clac ZマウスとPCP two CREマウスを交配させ、PCP two CAG C twoマウスを作製します。得られた仔マウスが誕生したら、ジェノタイピングを行います。既報の通り、EGFPとCreeの両トランスジーンを保有している個体を特定するため、PBSで30%スクロース溶液を50 milliliters調製し、適切な週齢の組織採取日まで-20°Cで保存します。書面でのプロトコルに従い、麻酔下でマウスに経心腔灌流を行い、脳組織を解剖するための準備をします。解剖した脳を10 centimeterの組織培養プレートに入れ、10 millilitersのPBSを加え、小脳を大脳から分離します。次に、メスを用いて小脳を矢状面で解剖し、切片を30% sucrose溶液に移して4°Cで一晩保存します。ドライアイスと2-メチルブタンを用いてスラリーを調製します。バスの温度が平衡状態になるまで5分間待ちます。次に、クライオモールドにOCTコンパウンドを満たし、解剖顕微鏡とピンセットを用いて、解剖した小脳の半分をモールドに入れます。小脳の中線に近い解剖面がモールドの上側を向くように配置してください。その後、OCTコンパウンドが組織検体の周囲で固まって白いマトリックスを形成するまで、クライオモールドをドライアイススラリーに5分間浸します。包埋した検体は、使用時まで-20°Cで保存します。組織切片を回収するためのプレコート済みポリリジンスライドにラベルを貼り、小脳組織のブロックを新鮮なOCTを用いて組織ホルダーに固定します。ブロックがしっかりと固定されたら、組織ホルダーを装着し、組織が現れるまで40 µmの厚さでスライスして余分なOCTを除去します。厚さを15 µmに設定し、OCT切片をスライドガラスのポリリジンコート面に慎重に接触させて切片を回収します。組織切片は、染色およびイメージングを行うまで-20 °Cで保存してください。次へ進む際は、蛍光タンパク質の退色を防ぐため、小脳切片を暗所で融解させます。疎水性バリアペンを使用して、組織切片の周囲に長方形を描きます。組織を後固定するため、切片に約 500 µL の 4% パラホルムアルデヒドを加えて5分間静置します。その後、吸引機を使用して固定液を吸引します。この際、ピペットで組織切片を乱さないように特に注意してください。組織切片を乱さないように、スライド上にPBSを静かに適用します。5分後、バキュームピペットを用いて慎重に液体を除去し、PBSによる洗浄を計3回繰り返します。次に、スライドにブロッキング液を約500 µL加え、10分間インキュベートします。ブロッキング溶液を除去し、cal結合抗体またはnesin 2抗体を1/100から1/300に希釈して調製した同溶液に置換します。次に、抗体溶液を除去し、スライドをPBSで3回洗浄します。スライドを室温、暗所にて1時間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液を用いて、anti-US Alexa Fluor 594（cow bindingラベルスライド用）およびanti-Alexa Fluor 594（Nesprin 2ラベルスライド用）を1:1000に希釈して調製し、使用時まで遮光して保存します。最後のPBS洗浄液をゆっくりと取り除き、希釈した二次抗体溶液を切片に滴下し、遮光下で1時間おきます。インキュベーション後、二次抗体溶液を除去します。次に、300 nanomolarのDPIなどの核染色剤を用いて、PBS中で5分間染色します。その後、切片をさらに2回PBSで洗浄します。PBS溶液をできるだけ取り除き、組織切片に封入剤を1滴滴下してカバーします。気泡が入らないように組織切片の上にガラスカバースリップを載せ、室温・暗所で15〜30分間静置します。その後、蛍光顕微鏡を用いて抗体染色および蛍光タンパク質を可視化します。小脳切片の場合は、20倍または40倍の対物レンズを使用してください。ここで示されているE-G-F-P-C twoの2つの核縁を観察するためには、小脳スライスにおけるFitzyチャネルでE-G-F-P-C twoを直接可視化することができます。さらに、プルキンエ細胞を特異的に標識するcow bindingとEGFPの共局在により、E-G-F-P-C twoの発現がプルキンエ細胞内のプルキンエ細胞に限定されていることが確認されます。核の周囲に観察されるEGFP陽性のリム様パターンが示すように、EGFP cache twoは核膜に標的化されています。この例では、EGFP KASH2の発現が、cow結合陽性のPerkin細胞の70%以上で検出されました。EGFP KASH2は、利用可能なSUNドメインを飽和させることで、核膜から内因性nesprinを置換します。したがって、EGFP KASH2を発現しているPerkin細胞の核膜からは、内因性NESPRIN2が置換されます。E-G-F-P-C twoを発現していないPerkin細胞は、期待されるコントロールとして核膜に内因性のnesin twoを保持しているが、CREリコンビナーゼを発現していない細胞は、全bikini細胞集団の核膜にNESIN twoを示す。したがって、組織のCTブロックが利用可能である。E-G-F-P-K twoは約4時間で視覚化できる。この手順を行う際は、PFFの固定度合いや包埋条件がエピトープの抗原性に極めて大きな影響を及ぼす可能性があることに留意することが重要です。したがって、特定のエピトープを保持するための最適な固定条件を決定することが非常に重要となります。このビデオを視聴することで、CK2トランスジェニックマウスモデルを用いて、VGFP cashewの発現を特定の組織に標的化する方法について十分な理解が得られるはずです。

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、タモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼシステムを使用して、マウスモデルにタモキシフェンを腹腔内注射した後の標的遺伝子ノックアウトの手順を説明しています。...

CreER-LoxPシステムに基づく標的遺伝子の不活性化:マウスモデルにおける標的遺伝子ノックアウトのためのタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼシステム

このビデオでは、2点リゾフォスファチジルコリン(LPC)注入を用いた局所性脱髄マウスモデルの作成を実演しています。麻酔をかけたマウスの頭蓋骨が露出しています。注入座標が決定され、穴が開けられて、標的部位でのLPC注入が可能になります。LPCは炎症を介してニューロンの局所性脱髄を誘導しますが、2点注射によりその持続可能性が保証されます。...

リゾホスファチジルコリンの2点注入による局所脱髄マウスモデルの確立

マイクロRNAは、脳の構造と機能に重要な役割を持っている。ここでは、設計されたmiRNAの発現レンチウイルスの定位注射を使用して過剰発現海馬のmiRNAを強制する方法について説明します。このアプローチは、評価するための比較的急速な方法として役立つことができる...

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。...

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。...

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。...

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre...

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X...

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

このプロトコルでは、マウス卵管における局所的に制限されたCRISPRを介したゲノム編集のためのマイクロインジェクションと in vivo...

in vivoマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを用いた体細胞ゲノム改変マウスモデル

学ぶCre/Lox系トランスジェニックマウスモデルを用いた細胞特異的LINC複合体破壊法。蛍光標識EGFP-cKASH2を小脳プルキンエ細胞で誘導発現させ、核位置決定におけるLINC複合体の役割を解析する革新的アプローチです。

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

さらに動画を探す