Name: 植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ植物キューティクル脂質ポリエステルの単離と組成分析方法。葉組織を用いてデポリマー化しGC-MSでモノマーを分析することで、カチンの生合成と植物の環境ストレス応答メカニズムを解明できます。

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この作業は、S.J.への自然科学および工学研究（NSERC)-USRA助成金と、I.M.へのNSERC-Discovery助成金によって支援されました。技術支援を提供してくださったリチャード・ブルゴー氏、メーガン・レインズ氏、アマンダ・フルーク氏に感謝します。att1-1およびatt1-2変異体のシードは、中国・北京のInstitute of Genetics and Developmental BiologyのJian-Min Zhou博士のご厚意により提供されました。

注：このプロトコルは、ボナベンチャーらから適応されました。 （2004）、モリーナら。 （2006）、Liら。 （2013）7,10,11。ステップ1-5は、図1に要約されています。 1.組織脱脂注：必ず使用する前に、ヒュームフードの下で乾燥させる、クロロホルムですべてのガラス器具とキャップをすすぎます。 注意：組織の均質化およびヒュームフードの下にあるすべての溶媒の転送手順を実行します。常に化学物質との直接接触を避けるために、汚染からサンプルを保護するために、実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> 85℃に予熱水浴とヒートブロック。 </li><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）-facedスクリューキャップで予め秤量した20ミリメートル×125 mmのガラス製試験管に各葉サンプルの約0.5グラムを秤量します。サンプルごとに4つの複製を含めます。 </li><li>三角フラスコ（約125ミリリットルに2-プロパノールを置き、SAMPのグラム当たり25ミリリットルル）。 0.01％の最終濃度になるように（また、ブチル化ヒドロキシトルエン、BHTとしても知られる）、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールを加える（w / v）の。 注：（BHTは、不飽和脂肪酸の酸化を最小限に抑えることができます）をメタノール中の5％（w / v）のストック溶液からBHTを加えます。 </li><li>水浴中で85℃に予熱2-プロパノール溶液。 </li><li>ヒートブロック中で85℃で15分間、各試料管と熱に12 mlの熱い2-プロパノール溶媒を加えます。このステップは、破壊された細胞から放出され得るリパーゼを不活性化します。 </li><li>チューブを室温まで冷却し、均一な懸濁液が得られるまでホモジナイザーで十分に組織を粉砕してみましょう。 </li><li>オービタルシェーカーでサンプルを置き、100rpmで、室温で1〜2時間振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> 2-プロパノールの等量を加え、室温で12時間振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> CH 12ミリリットルを追加します。CL 3：CH 3 OH（2：1、V / V）（試料のグラムあたり25 ml）を残渣に100rpmで、室温で一晩振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> 12ミリリットルの CHCl 3 を追加 ：CH 3 OH（1：2、v / v）の残基および100 rpmで、室温で一晩振盪し。 </li><li> 800×gで10分間遠心分離し、溶媒を除去します。 </li><li>サンプルは室温で一晩換気フードの下で乾燥させます。 </li><li>残留物を空気は、乾燥した後、無水塩化カルシウムまたは重量が一定に（3~5日）に達するまでのCaSO 4上真空デシケーター中に置きます。 </li></ol> 2.解重合：ナトリウムメトキシドメタノリシス（図2） 注意： - 2.4、2.7から2.8、2.10 - 手順2.3実行2.15と2.17 - - 2.11、2.13ヒュームフードの下で2.18;常に実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> 60℃に予熱ヒートブロック。 </li><li> （さらなる計算のための重要な）乾燥残留物を含む試験管を計量。 </li><li>各チューブに内部標準を追加します：25ωLメチルheptadecanoate（1 mg / mlのストック）と25μlのω-ペンタデカラクトン（1 mg / mlのストック）。 </li><li>各チューブに0.9 mlの酢酸メチル、1.5 mlのナトリウムメトキシド、および3.6 mlのメタノールを追加し、それらをキャップ。あるいは、これら3試薬と反応ミックスを調製し、各サンプルに6 mlのアリコートを追加します。 </li><li> 15分間隔で定期的に60°Cとボルテックスで2時間加熱サンプル。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。 </li><li>脂肪酸メチルエステルを抽出するために、塩化メチレン（CH 2 Cl 2）と氷酢酸1.5mlを10mlのを追加します。 </li><li>各チューブキャップを充填するために生理食塩水（0.5 MのNaCl）を加えます。 </li><li> 800×gで10分間、1分間遠心のための渦のサンプル。 </li><li>ポリ16×125ミリメートルガラス試験管（中サイズのチューブをきれいにするために、有機相（下）を転送テトラフルオロエチレン（PTFE）-facedスクリューキャップ）。 </li><li>各チューブキャップを充填するために生理食塩水（0.5 MのNaCl）を加えます。 </li><li> 800×gで10分間、1分間遠心のための渦のサンプル。 </li><li>水（上）相を除去し、繰り返しは2.11から2.12までを繰り返します。 </li><li>全ての水性（上）相を削除します。 </li><li>溶媒を無水硫酸ナトリウム（Na 2 SO 4）を加えるチューブにキャップをし、1分間ボルテックス。サンプルは、以下の日まで放置することができる。 この時点で、サンプルは、ヒュームフード下で一晩放置することができます。 </li><li>底の中のNa 2 SO 4塩を圧縮するために800×gで2分間遠心。 </li><li>小さなガラス使い捨て管に有機相を転送（ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）と13×100mmのガラス試験管スクリューキャップを-​​faced）。 </li><li>窒素下で乾燥するまで溶剤を蒸発させ、誘導体化のステップに進みます。すぐに処理されない場合は、ストアは-20℃でサンプルを蒸発させる（サンプルをすることができますLSO）蒸発工程の前に格納されています。 </li></ol>ガスクロマトグラフィーのためのデリバティブの調製注意：ステップ3.1.2と3.1.5を実行 - ヒュームフードの下で3.1.8。常に実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> トリメチルシリル誘導体 <ol><li> 100℃に予熱ヒートブロック。 </li><li>各チューブにピリジンを100μlとBSTFA（N、Oビス - トリメチルシリルトリフルオロ）の100μlを添加して、それらをキャップ。 </li><li> 10分間100℃で熱サンプル。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。 </li><li>窒素下、室温でサンプルを蒸発させます。試料に熱を加えることを避ける、モノマーは、この段階では非常に揮発性です。 </li><li> 1（v / v）のヘプタン：トルエン1の500μLを追加します。 </li><li> 800×gで2分間の1分と遠心のための渦のサンプル。 </li><li> GCバイアルにサンプルを追加し、GC / MS分析に進みます。 </li></ol></li><li> アセチルデリバティブ 注：アセチル化については、手順を変更する3.1.1-3.1.3上記（ビデオには示されていない）は次の通りです。同じです3.1.4-3.1.8の手順を実行します。 <ol><li> 60℃に予熱ヒートブロック。 </li><li>チューブにピリジン100μlの無水酢酸（C 2 O）の100μLを加えます。 </li><li> 60℃での熱サンプル1時間。 </li></ol></li></ol> 4. GC / MS分析<ol><li> HP-5キャピラリーカラム（30 MX 0.25ミリメートル×0.25μmの膜厚）または同等（すなわち、5％のジフェニル、95％のジメチルポリシロキサン）を使用します。プログラム3℃/分で300℃まで150からプログラムされたヘリウムキャリアガスを1.5ml /分に設定流量とオーブン温度を有するGC。 </li><li>スプリット注入（スプリット比1:10）を使用し、40から600 AMU（電子衝撃イオン化）を介してモードをスキャンする質量分析計を設定します。 </li><li>示さクチン分析法を用いて、それぞれ、WTおよび変異体の複製、（空白）は、溶媒を含むシーケンステーブルを作成します。 </li><li>ロード溶剤そして、カルーセル上のサンプルバイアルは、必要に応じてオートサンプラシリンジすすぎバイアルにヘキサンを追加して、シーケンスを開始します。シーケンスが完了した後、全イオンクロマトグラムのトレースは、すべてのサンプルのために利用可能です。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>公開された質量スペクトルの各ピークのマススペクトルを比較することによって、または使用可能な場合は、市販のライブラリーを検索することにより、脂質ポリエステルモノマーを特定します。 </li><li>総イオン電流クロマトグラムの各識別されたピークについて、GC / MSソフトウェア（ 補足図1）からの積分結果テーブル上の領域を見つけるために、それぞれの保持時間を使用しています。 </li><li>各単量体（カラムA-B）については、あるモノマーのExcelのテーブル（ 補足ファイル2、カラムCF）、サンプルを複製するすべてのための対応する列に統合テーブル（ 補足図1、列D）で見つかった面積値を追加シロイヌナズナを定量化するために、スプレッドシートクチンTMSI誘導体。アセチル化誘導体が代わりに用意されている場合は、補足ファイル3を使用してください 。 </li><li> ISカラム（HK）への内部標準（IS）の領域を追加します。それらの誘導体化されていない単量体、すなわち、脂肪酸メチルエステル（FAME）、およびジカルボン酸ジメチルエステル（DCAのDME）については、17を使用します。モノマーテーブル内の紫色の網掛けセルは（定量化のためにISとして0 FAME（IS1）を、 補足ファイル2/3）。第一級アルコール、フェルラ酸、ωヒドロキシ酸を含むヒドロキシルモノマーについては、15を使用します化合物の定量化のための選択であるとして、0〜15ヒドロキシFAME（IS2）を（モノマーテーブル内の緑shadded細胞; 補足ファイル2/3） 。 </li><li>それぞれが列AX-BA（ 補足ファイル2）またはAQ-AT（ 補足ファイル3）に複製するための乾燥葉の重量を追加します。代替的に、単位当たりのモノマーの負荷を表現するために表面積を計算し、モノマーのテーブルに面積値を追加するために、葉をスキャン表面積。 </li></ol>

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利益相反は宣言されていません。

DNAやタンパク質などの生体高分子、他のとは異なり、植物脂質のポリエステルは、テンプレートから作られていません。代わりに、その組成物は、これらの細胞外ポリマーを製造するための組織に存在する酵素の特異性に依存します。このように、構成成分の化学分析は、脂質のポリエステル組成物を理解することが重要です。 エステル結合を切断するための化学的方法は、ケン化、水素化分解、酸触媒トランスメチレーション、および塩基触媒トランスメチレーション2を含みます 。それらの各々は、長所と短所を有しています。鹸化は、二次反応を受けることができる遊離脂肪酸ヒドロキシ酸を生成します。水素化アルミニウムリチウム（LiAlH 4を）と水素化分解16は、クチン解析7に使用されています。水素化分解は、アルコールに官能基化炭素を減少させ、元の構造は、重水素化リチウムアルミニウム（LiAlD 4）でdeuteriolysisによって推論される必要があります。ザ・このアプローチの欠点は、それらの構造の割り当てを行うために得られる脂肪ポリオールのdeuteriationの程度を比較するための高分解能GC / MSの要件です。メタノール三フッ化ホウ素（BF 3）との酸触媒エステル交換を頻繁にクチンおよびスベリン8,17,18解重合に使用されてきたが、試薬は、限定された貯蔵寿命を有し、そして反応を15側に起因するアーチファクトを導入することができます。メタノール硫酸また、モノマーのメチルエステルが得られるが、おそらく、他の方法10に比べ、真の脂質ポリエステル成分でない2-ヒドロキシ脂肪酸のより大きな割合を有します。 このプロトコールに記載のNaOMe触媒によるエステル交換法は、識別のための特徴的な質量スペクトルを提供し、ヒドロキシル基のシリル化によって誘導体化された脂肪酸メチルエステルを生成し、またはアセチル化によってfoのヒドロキシル基のより安定な誘導体を提供することR定量。この技術の一つの欠点は、水が反応中に存在する場合、加水分解は、エステル交換反応と競合することです。水は、のNaOMe（触媒）と反応し、次いで、遊離酸（ 図2D）を得た脂肪酸メチルエステルを加水分解水酸化ナトリウムを生成します。したがって、分析を複雑に、メチルエステルおよびTMSIエステル誘導体：2つのピークが、各脂肪酸のために存在するので、これは望ましくない副反応です。無水の試薬 ​​を使用し、ケン化に対抗するために共溶媒として酢酸メチルを添加することは、加水分解（ 図2D）を防止することが重要なステップです。 クチンおよびスベリンは1と26％グリセロール4との間に含まれています。しかしながら、このモノマーは、このプロトコルに記載された実験条件では検出されないであろう。グリセロールは、脂肪酸メチルエステルモノマーとは異なり、水性溶媒洗浄工程中に除去される、高度に親水性であり、。この制限は、クチン他の解重合方法にpplies、グリセロール、酵素法を用いてエステル交換した後、得られた水層に決定することができます。あるいは、グリセロール定量化の目的のために有用な.Althoughグリセロール19,20を含む全てのモノマーを検出するためにさらに水抽出することなく、より穏やかな条件（ 例えば 、0.05 MのNaOMe）を用いて定量することができ、穏やかな条件は、通常、クチンの不完全な解重合を与えますスベリン。 炎イオン化検出器（FID）に結合されたGCが利用可能である場合の代表的な試料のピークは、GC / MSによって同定された後、すべての複製は、定量的な目的のために、この機器で分析することができます。それらの保持指標が知られている場合は別の方法として、GC / FIDトレース中のモノマーを特定することができます。水素炎イオン化検出器は、特に高感度、メジャーとマイナーの試料成分の定量化のために重要である比例の広い範囲を持っていますシングルランインチまた、堅牢で維持し、15を操作しやすいです。 記載されたプロトコルは、一つ以上の脂質ポリエステルモノマーの組成が異なる変異体の化学的な特徴付けを可能にする、植物脂質のポリエステルモノマーの信頼性と再現性の分離、同定、および定量を可能にします。手続きは、それが容易に根、種子、葉、茎、花などの種々の植物材料の小さなバルクの両方の量を処理するように適合させることができる、拡張可能です。多くの種からの脂質ポリエステルモノマーの質量スペクトルデータは、 例えば公開されている。、21-26と他の組織および/ ​​または種にこのプロトコルを適応させる際に、未知の単量体を識別するために貴重なリソースを構成しています。この方法は、高等植物における脂質ポリエステルの生合成、調節、及び分布の調査に適用可能です。

維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水障壁として機能する細胞外の層に依存しています。これらの親油性の細胞壁に関連する構造は、病原体感染を制限し、および植物組織1からのガス、水および溶解した物質の受動輸送を調節します。このような障壁は、植物のクチクラ、植物2、および異なるスベリン含有拡散バリアに固有synapomorphic構造です。キューティクルは、細胞壁3-5の細胞外側にペクチンの層を介して上皮細胞により合成され、それらに結合した親油性層です。これは、植物組織と環境との間の重要なインターフェースとして機能し、高等植物の主要な空中臓器を包みます。 クチン、キューティクルの構造マトリックス、およびスベリンは、溶媒抽出ワックス2,4に関連する2つの不溶性グリセロポリエステルです。これらの高分子リットルipidsは、飽和および不飽和脂肪酸誘導体で構成され、両方の構造的および機能的に類似しているされています。しかし、彼らは化学組成と堆積サイトでの特性差によって区別されています。 スベリンは、二次壁を形成する特定の外部と内部組織の細胞壁の内側に位置する脂肪族ポリエステルです。 Suberized組織が ​​根、塊茎および樹皮のperiderms、根の内皮、種 ​​皮層、および癒さ傷2を含みます 。クチンとは異なり、スベリンポリエステルは、一般的に、アルコール、飽和およびモノ不飽和ジカルボン酸、および超長鎖モノマー（C≥20）の大部分が含まれています。 クチンは、維管束植物6で最も豊富な脂質ポリエステルであり、グリセロールおよび、ヒドロキシおよびヒドロキシ置換されたエポキシ脂肪酸4としてC16-C18 interesterified脂肪酸誘導体、から構成されています。クチンポリマーの組成をしながら0、18 - ヒドロキシ-9,10-エポキシ18：0、および9,10,18トリヒドロキシ18：0脂肪酸維管束植物種間で異なり、最も優勢な主要なモノマーは、10、16ジヒドロキシ16です。 2ジカルボン酸7,8：興味深いことに、シロイヌナズナの葉とクチン茎は主に18から構成されています。 植物のキューティクルも数ナノメートルから数マイクロメートル9までの範囲、厚さにかなりのばらつきを示します。キューティクル分離は特に、 シロイヌナズナ 8のものと非常に薄い葉のクチクラのための労力と時間のかかるステップであるため、キューティクルの分離を回避する方法が開発され、7,8を検証されています。ここでは、ナトリウムメトキシド（NaOMeの）触媒解重合とそれに続くガスクロマトグラフィー/質量分析（GC / MS）分析によりシロイヌナズナの葉におけるクチンのモノマー組成物を研究するための詳細なプロトコルを記述する。このプロトコルは、共同をアッセイするための堅牢な方法を提供しています全体脱脂組織における植物脂質ポリエステルのmposition、とは、以前に報告されたプロトコル7,10,11から適応されています。全組織サンプルは、クチクラとエピクチクラワックス、膜脂質、およびトリアシルグリセロールを含む溶剤抽出脂質を除去し、均質化された第一及び徹底的に脱脂されています。細胞壁に富む残渣を、次いでナトリウムメトキシドで触​​媒メタノリシスによってそれらの構成メチルエステルモノマーに解重合されます。脂肪酸メチルエステルは、酸性化時に抽出され、それらの対応するトリメチルシリルまたはアセチル誘導体​​を得るために誘導体化されます。誘導体化された残基は、高度に揮発性であり、およびGC / MS分析の間にその構造コンフォメーションを変更することなく、妥当な温度でのガスクロマトグラフィーカラムから溶出することができます。

<table><tbody><tr><td>化学薬品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BPA451-4</td><td>脱脂用溶媒</td></tr><tr><td>無水</td>ナトリウム <td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>320102</td><td>誘導体化剤</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-ビス(トリメチルシリル)-トリフルオロアセトアミド)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>15222</td><td>誘導体化剤</td></tr><tr><td>ブチル化ヒドロキシトルエン (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>抗酸化</td></tr><tr><td>剤 塩化カルシウム、無水</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C614-3</td><td>乾燥剤</td></tr><tr><td>カルシウム・スフレート・無水 (DRIERITE- 8 MESH 指示薬付き)</td><td>アクロス・オーガニックス</td><td>219090020</td><td>乾燥剤</td></tr><tr><td>クロロホルム (トリクロロメタン)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C6074</td><td>有機溶剤</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP2401212</td><td>酸性化剤</td></tr><tr><td>ヘリウムキャリアガス、圧縮空気</td><td>リキード</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>キャリアガス、GC/MS</td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3501</td><td>有機溶剤</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>H3024</td><td>有機溶剤</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A4124</td><td>有機溶媒、トランスメチル化反応</td></tr><tr><td>性 酢酸メチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>ヘプタデカン酸メチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>内部標準(1mg/mLストック)</td></tr><tr><td>二塩化メチレン(ジクロロメタン)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>D374</td><td>有機溶媒</td></tr><tr><td>窒素、圧縮</td><td>エア・リキード</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>キャリアガス、GC-FID</td></tr><tr><td>ペンタデカノラクトン</td><td>フルーカ</td><td>76530</td><td>内部標準物質(1 mg/ml原液)</td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>誘導体化用共溶媒</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム フィ</td><td>ッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>BP358212</td><td>生理食塩水</td></tr><tr><td>ナトリウムメトキシド(25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>求核性トル</td></tr><tr><td>エン</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>有機溶剤</td></tr><tr><td>植物成長用品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>プレミアテック園芸株式会社</td><td></td><td>Pro-Mix PGXは、シロイヌナズナ植物を育てるために推奨されます（Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&nbsp;</td></tr><tr><td>パーマネスト 湿度ドーム&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>パーマネストプラントトレイ(22x11in)</td><td>Grower's Solution、LLC、テネシー州クックビル&nbsp;</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>スクエア温室ポット、3.5インチ&nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>汎用植物肥料、プラント製品 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm ガラス試験管、テフロン面スクリューキャップ付き</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm ガラス試験管、テフロン面スクリューキャップ</td><td>付きKimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm ガラス試験管、テフロン面スクリューキャップ付き</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC バイアルキャップ</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC バイアルマイクロインサート</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC バイアル</td> National <td>Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック<tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アレグラX15R遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析バランス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr>ベリー<tr><td>ダンサー</td><td></td><td></td><td>Belly Dancerが利用できない場合、シェーカーをこの目的に使用できます</td></tr><tr><td>DB-5キャピラリーGCカラム</td><td>J&W Scientific, CA, USA;&nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &m 膜厚</td></tr><tr><td>デシケーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT シングル四重極質量分析計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ック 窒素蒸発器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリトロンホモジナイザー</td><td>ビルクマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 ガスクロマトグラフ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 段レギュレータ</td>ー <td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

陸生植物は、特定の組織の細胞壁を修飾する細胞外脂肪族バイオポリエステルを生成します。表皮細胞は、グリセロールと修飾脂肪酸のポリエステルであるクチンを合成し、空中植物の表面を覆うキューティクルの骨格を構成します。スベリンは、根の内皮や塊茎、樹皮、根の周囲など、特定の組織の細胞壁に沈着する関連する脂質ポリエステルです。これらの脂質ポリマーは、植物種によって組成が大きく異なり、多くの場合、単一種内の組織間で異なります。ここでは、ナトリウムメトキシド(NaOMe)触媒による解重合、誘導体化、およびその後のガスクロマトグラフィー質量分析(GC / MS)分析により、シロイヌナズナの葉のクチンのモノマー組成を研究するための詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、クチンまたはスベリンのいずれかを有する全脱脂植物組織から単離された不溶性ポリエステルのモノマーを調査するために使用できます。この方法は、以前に分析されていない種の脂質ポリマーの組成を特徴付けるためだけでなく、候補遺伝子機能を評価するためのフォワードおよびリバースジェネティックアプローチの分析ツールとしても適用できます。

。10日-この原稿に記載されているプロトコル脂質ポリエステルモノマーを決定するように設定されている（ すなわち 、クチンまたはスベリン）、非クチン脂質10の貢献を最小化図1は、完全に8の間にかかるアッセイの概要を説明します（最初の組織の収穫からのGCデータを得るために）、乾燥させているどのくらいのサンプルに応じて。 選択された塩基触媒メタノリシス（ 図2）のポリエステルを解重合する方法は、以前クチンおよびスベリンの両方が含まれているシロイヌナズナの種子のために検証されました。組織は、最初に均質化し、徹底的に溶剤抽出脂質を除去するために脱脂されています。抽出後の残渣の収率は、最初の新鮮重量の割合として、通常Aの 6％ですシロイヌナズナ COL-0の葉。細胞壁に富む残渣を真空デシケーター中で乾燥した後、それらの構成によってメチルエステルモノマーに解重合されています塩基触媒トランスメチレーション。 2時間のインキュベーションは、適切な解重合および脂質ポリエステル成分の回収のために必要な重要な時期として選ばれました。より長いインキュベーション時間は、2-ヒドロキシ酸の増加をもたらしました。これらは、潜在的に、膜スフィンゴ脂質10から派生。 シロイヌナズナ野生型の葉クチンはO -TMSiエーテル誘導体（ 図3A）及びO -アセチル誘導体（ 図3B）は、 図3に示されている場合の典型的なクロマトグラム。各ピークは、文献7,8および12。当社のビデオプロトコルは、TMSIの誘導体を製造する方法を示して公共データベースからの質量スペクトルとの比較により同定したが、サンプルが代わりにヒドロキシル基を誘導体化するアセチル化することができます。彼らは診断マススペクトルを与えるため、シリル化誘導体は、識別の目的のために良いです。しかし、アセチル化誘導体は、より安定したシリル化に良い代替されています一度モノマーは、10を同定されています。唯一のGCは、水素炎イオン化検出器（FID）に結合されている実験室でこのプロトコルの実装を支援するために、GC / FIDをWT葉クチンモノマーの脂肪酸メチルエステルの標準同族系列のアセチル化誘導体に対応するも示されているトレース（ 補足図4）。 この方法は、定性的であり、変異体解析のためにその値したがって、サンプル間の定量的な差を検出します。個々のモノマーの量は、サンプル間のモノマーの存在量の比較を可能にする、定量化の内部標準法を用いて決定されます。これは、ピークの大きさ（総イオンカウント数）は、ポリエステル中のモノマーのモル比を反映していない可能性があること、しかし、明確にする必要があります。我々は、脂肪酸メチルエステルおよびTMSI誘導体（ 補足ファイル1）、またはエースとしてシロイヌナズナ葉クチン中のモノマー量を計算するために、モノマーの編集可能なテーブルを含むされています<html>アルコールのティル誘導体（ 補足ファイル2）。これらの表は、サンプルが異なる器官または植物種から抽出された場合に適応する必要があるかもしれません。 例として、我々はシロイヌナズナタリアナコロンビア（COL-0）は、野生型の葉とCYP86A2 / ATT1遺伝子の2つの以前に特徴付けヌル変異対立遺伝子、att1-1（M-1）とatt1-2（M-2を分析しました ）13,14。 CYP86AサブファミリーのシトクロムP450モノオキシゲナーゼは、推定ω-oxydasesをエンコードし、スベリンおよびクチンモノマー生合成に参加しています。我々の結果（ 図4）は 、WTの葉に比べて、変異体の葉における三大脂質モノマーの負荷の大幅な削減を実証します。 、酵素の予測機能と一致して16：0、18：2、および18：1ジカルボキシレートは、特にATT1変異体において影響を受けました。 「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg&quot; /&gt; 脂質ポリエステルの分析1.概要図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> NaOMeを触媒によるメチル基転移反応の図2機構求核メトキシアニオンを容易に脂肪酸メチルエステルおよびアルコキシドアニオン（B）に解離する不安定な四面体中間体（A）を形成する脂質ポリエステルのcabonyl炭素を攻撃します。これらのアルコキシドは共役塩基であり、それによって追加の解重合反応（C）の維持、触媒的に活性なメトキシアニオンを再生する、メタノールと反応します。水が中に存在する場合システムには、水酸化ナトリウム、不可逆的に望ましくない遊離脂肪酸を生成するためにエステルを加水分解強塩基を形成するために、ナトリウムメトキシドと反応します。酢酸メチルは、システム（D）の中に、水酸化ナトリウムの少量を削除するには、15共溶媒として追加されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> 図3。野生型シロイヌナズナの葉クチンモノマーの代表的なトータルイオンクロマトグラム。（A）O -trimethylsilyl（TMSI）エーテルと、（B）、酢酸ヒドロキシル誘導体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> 図シロイヌナズナ WTの4クチンモノマー組成及びCYP86A2遺伝子の2つのヌル変異体対立遺伝子（ 変異1 = att1-1;変異2 = att1-2）。エラーバーは平均の標準偏差を示す（N = 4） 。 ©ブラックウェルパブリッシング（2007）の許可を得て、13から適応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MSソフトウェアから補足図1のピーク積分結果テーブル。同定された単量体と内部標準に対応するピークは、彼らのretentiによって識別されます<html>時間に（列C）及び面積値が列Dに表にし<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> シロイヌナズナクチンモノマー（ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのトリメチルシリルエーテル誘導体）の補足ファイル2.表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> シロイヌナズナクチンモノマー（ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのOアセチル誘導体）の補足ファイル3表。COM /ファイル/ ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> （AB）脂肪酸メチルエステル（FAME）リテンションインデックススタンダード（ピークは各飽和FAME鎖長で標識される）の補足図4 GC / FIDトレース。及び（C）は、A をアセチル化WT シロイヌナズナ葉クチンモノマー。 16：0 FAME（1）、フェルラ酸（2）、18：3 FAME（3）、18：1/18：2のFAME（4）、18（5）、sinapate 0 FAME（6ピーク上の数字は、対応します）、16：0 DCA（7）、16-OH 16：0 FAME（8）、18：2 DCA（9）、18：1 DCA（10）18：0 DCA（11）、18-OH 18：2 FAME（12）、18-OH 18：1 FAME（13）、20：0 FAME（14）、10,16-DIOH 16：0 FAME（15）、24：0 FAME（16）。 DCA：ジカルボン酸ジメチルエステル。 FAME：脂肪酸メチルエステル。 IS1：内部標準1、17：0 FAME。 IS2：内部STandard 2、15-OH 15：0 FAME。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

脂質ポリエステルは、植物のキューティクルとスベリンを含む拡散バリアという2つの細胞壁修飾の構造成分を構成しています。この動画では、脱脂した葉全体からクチンを解重合する方法をご紹介します。この方法は、クチンまたはスベリンの生合成で損なわれた変異体の研究に適用することができます。

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水バリアとして機能する細胞外層に依存しています。これらの親油性細胞および関連構造は、病原体の感染を制限し、植物組織へのガス、水、および溶解物質の受動的な輸送を調節します。重要なバリアの一つに、植物に特有の複雑な構造である植物クチクラがあります。クチンは、クチクラの構造マトリックスを構成する不溶性のグリセロール脂質ポリエステルであり、溶媒抽出可能なワックスを伴っています。本稿では、脂質ポリエステルの組成および脂質を除去した植物組織を分析するための信頼性の高い手法を提示します。このプロトコールでは、組織サンプル全体を採取し、ホモジナイズした後、一連の溶媒抽出によってクチクラおよびエピクチクラワックスを含む溶媒可溶性脂質を完全に除去し、脱脂処理を行います。膜脂質中のトリグリセロール。次いで、ナトリウムメトキシド触媒によるメチル分解により、試料を構成脂質モノマーへと脱重合させる。シミュレーション試薬を添加し、ヒドロキシ基をガスクロマトグラフィー分析に適した対応するトリメチルシル誘導体へと転移メチル化する。その後、誘導体化した残渣をGCバイアルに移し、A-G-C-M-Sにロードして分析を行い、クロマトグラムを作成することでバイオポリエステルのモノマー組成を特性評価します。抽出サンプル中に存在します。ここでは、成熟した野生型および2種類の変異体arabidopsis ANA植物から全葉サンプルを採取します。抽出および分析のため、クロロホルムで予備洗浄した清潔なガラスチューブに0.5 gramsの組織を加えます。フラスコに100 millilitersのイソプロパノールを入れ、BHTを0.01%濃度になるように加えます。BHTは、溶媒抽出中の二重結合や脂肪酸の酸化を防ぐために添加される抗酸化剤です。ウォーターバスを用いて、溶媒を約85 degreesまで予熱します。植物組織1gあたり25mLの加熱済みイソプロパノールを加え、サンプルをヒートブロックにて85°Cで15分間インキュベートする。耳および目の保護具を着用し、チューブを室温まで冷却させる。最後に、ホモジナイザーでサンプルを粉砕して均一に分散させ、スクリューキャップでチューブを密閉し、100RPMで1〜2分間振とうした後、サンプルを800Gで10分間遠心分離する。有機相をペレットに凝縮された高密度物質から分離するため、パストールピペットまたはプロピペットを用いて上清を除去し、廃棄します。この際、ペレットを乱さないように注意してください。室温のイソプロパノールを同量加え、サンプルを一晩振盪させます。100 RPMでサンプルを遠心分離し、上清を捨てます。組織1gあたり、クロロホルムとメタノールの2:1溶液を25 mL加え、一晩振とうした後、遠心分離して有機相を捨てます。その後、クロロホルムとメタノールの1:2溶液を用いてこの工程を繰り返します。ペレットを一晩乾燥させ、チューブをドラフトチャンバーから無水硫酸カルシウムを含む真空デシケーターに移し、少なくとも3日間、または恒量に達するまでサンプルを脱水させます。十分に乾燥した後、ナトリウムメトキシド触媒によるメタリシスによる脱アシル化の準備が整います。ガラス製シリンジを用いて、乾燥させた組織が入ったチューブに2種類の内部標準溶液を添加します。まず25 µLのmethyl HETO decanoateを加え、次に25 µLのomega pentec and lactoneを加えます。深層重合を開始するには、サンプルに0.9 millilitersの酢酸メチルを加え、続いて1.5 millilitersのナトリウムメトキシド触媒と3.6 millilitersのメタノールを加えます。サンプルを60 degreesで2時間インキュベートし、反応システム内で定期的にボルテックス処理を行います。脂質ポリエステルは親核的なメトキシドアニオンと反応して不安定な四面体中間体を形成し、これが容易に分解して脂肪酸メチルエステルと酸化物アニオンになります。これらの酸化物は共役塩基であり、メタノールと反応して触媒活性を持つメトキシドアニオンを再生し、それによってさらなる深層重合反応を維持します。系内に水が存在する場合、水はナトリウムメトキシドと反応して水酸化ナトリウムを生成します。水酸化ナトリウムは強塩基であり、ポリエステルを望ましくない遊離脂肪酸へと不可逆的に変換します。加水分解を防ぐため、系内の水酸化ナトリウムを除去するために酢酸メチルが添加されます。チューブを室温まで冷却します。インキュベーション後、各チューブに10 millilitersのジクロロメタンを加えてモノマーを抽出します。その後、1.5 millilitersの氷酢酸を加えてサンプルを酸性にします。チューブに0.5 molar 塩化ナトリウム溶液を満たし、十分にボルテックスした後、数分間遠心分離します。この操作はドラフトチャンバー内で行ってください。ピペットを用いて、下層の有機相を慎重に、あらかじめ洗浄した中サイズの清潔なチューブに移します。サンプルを再度生理食塩水で洗浄し、ボルテックス処理した後、10分間遠心分離します。上層の水相を除去し、溶液中に残存する微量の水分を取り除くための乾燥剤として無水硫酸ナトリウムをサンプルに添加し、ボルテックス処理および遠心分離を行います。その後、溶媒をあらかじめ洗浄した清潔な小型チューブに移し、窒素エバポレーターにセットして溶媒を蒸発させ、モノマーの乾燥残渣を得ます。ガラスシリンジを用いて、100 µLのピューリンと100 µLのB-S-T-F-Aを添加し、ヒドロキシ基を揮発性のトリメチルセル誘導体に変換します。サンプルを100 °Cで10分間インキュベートします。チューブを冷却し、窒素ガス下で溶媒を蒸発させます。1:1のHEPTANE/トルエン溶液を500 µL加え、残留物を再溶解させた後、短時間遠心分離を行います。誘導体化サンプルを400 µLのインサートが入ったGCバイアルに移します。バイアルを密閉してガスクロマトグラフにロードし、キャピラリーカラムに注入して分析を行い、溶出物を四重極質量分析計で検出します。GCMS分析によって得られた生データは処理され、各サンプルのクロマトグラムとして提示されます。異なるクロマトグラフィーピークに対応する個々のモノマーは、それぞれの固有のマススペクトルによって同定されます。GC保持時間における個々のモノマーの量は、内部標準定量法を用いて決定され、これによりサンプル間でのモノマーの量と組成の比較が可能になります。ここでは、野生型およびP450モノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の2つの変異アレルに対応するウサギ膿瘍葉組織から放出されたモノマーの代表的な分析による重ね合わせクロマトグラムを示しており、それぞれ異なるモノマープロファイルを示しています。我々の結果は、野生型および変異型シロイヌナズナ植物において、3つの主要なクチンモノマーの含有量に有意な差があることを示しています。本プロトコルは、構成モノマーの単離、同定および定量により、植物脂質ポリエステルの組成を分析するための堅牢な手法です。この手順はスケールアップが可能であり、根、種子、葉、その他の全組織を含む、さまざまな植物材料の大容量処理に容易に適応させることができます。この技術は、高等植物におけるクチンおよびスベリンの生合成調節と分布を調査する研究に適用可能です。

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生物学

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グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

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プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

学ぶ植物キューティクル脂質ポリエステルの単離と組成分析方法。葉組織を用いてデポリマー化しGC-MSでモノマーを分析することで、カチンの生合成と植物の環境ストレス応答メカニズムを解明できます。

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

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