植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水バリアとして機能する細胞外層に依存しています。これらの親油性細胞は、関連する構造でありながら、病原性感染を制限し、植物組織に出入りするガス、水、溶解物質の受動的輸送を調節します。重要な障壁の一つは、植物特有の複雑な構造である植物クチクラです。

クチンは、キューティクルの構造マトリックスを構成する不溶性グリセロール脂質ポリエステルであり、溶媒抽出可能なワックスに関連しています。ここでは、脂質ポリエステルの組成をアッセイし、脂質植物組織を保持するための信頼性の高い技術を紹介します。このプロトコルでは、全組織サンプルを回収し、均質化し、一連の溶媒抽出によって徹底的に老朽化させ、クチクラワックスやエピ特異的ワックスなどの溶媒可溶性脂質を除去します。

膜脂質中のトリグリセロール。次に、サンプルは、メトオキシドナトリウム触媒によるメチル溶解により、その成分脂質モノマーに解重合されます。シミュレーション試薬は、トランスメチル化ヒドロキシル基を、ガスクロマトグラフィー分析に適した対応するトリメチル細胞誘導体に添加します。

次に、誘導体残渣をGCバイアルに移し、分析のためにA-G-C-M-Sにロードしてクロマトグラムを生成し、バイオポリエステルのモノマー組成を特徴付けます。抽出したサンプルに存在します。ここでは、野生型と成熟シロイヌナズナのANA植物の2つの変異体から全葉サンプルを採取します。

抽出および分析のために、クロロホルムで事前にすすいだ清潔なガラス管に0.5グラムのティッシュを加えます。フラスコに100ミリリットルのイソプロパノールを入れ、0.01%の濃度にブチル化ヒドロキシトルエンを追加しますBHTは、溶媒抽出中に二重結合と脂肪酸を酸化から保護するために添加される抗酸化剤です。水浴中で溶媒を約85度に予熱します。

植物組織1gあたり25ミリリットルの加熱イソプロパノールを加え、サンプルを85度の加熱LOCで15分間インキュベートします。チューブを室温まで冷まし、耳と目の保護具を付けます。最後に、ホモジナイザーでサンプルを粉砕して、スクリューキャップ付きの均質な分散シールチューブを実現し、100 RPMで1〜2個の遠心分離サンプルを800 Gで10分間振とうします。

ペレットに圧縮された高密度材料から有機相を分離するには、パスツールまたはプロペントを使用して上清を取り除き、廃棄します。ペレットを乱さないように注意してください。等量のイソプロパノールを室温で加え、サンプルを一晩振盪します。

100 RPMでサンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。クロロホルム、メタノール、組織のパーグラムの2対1の溶液を25ミリリットル加え、サンプルを一晩遠心分離して有機相を廃棄します。次に、1〜2個のクロロホルムメタノール溶液を使用してこのプロセスを繰り返します。

ペレットを一晩乾燥させ、チューブをヒュームフードから無水硫酸カルシウムを含む真空乾燥剤に移し、少なくとも3日間、または一定の質量に達するまでサンプルを脱水します。完全に乾燥されたサンプルは、メタキシドナトリウム触媒メタリシスによる脱フローレーションの準備が整います。ガラスシリンジを使用して、乾燥組織を含むチューブに、25マイクロリットルのHETOデカン酸メチル、25マイクロリットルのオメガペンテックおよびラクトンから始めて、内部標準の2つの溶液を追加します。

深部重合を開始するには、0.9ミリリットルの酢酸メチルをサンプルに加え、続いて1.5ミリリットルのメスオキシドナトリウム触媒と3.6ミリリットルのメタノールを加えます。反応系内で周期的なボルテックスを行いながら、サンプルを60度で2時間インキュベートすると、脂質ポリエステルは求核性のメスオキシドアニオンと反応して不安定な四面体中間体を形成し、脂肪酸、メチルエステル、および酸化物アニオンに容易に解離します。これらの酸化物は共役塩基であり、メタノールと反応して触媒活性のあるメタIDEアニオンを再生し、それによって追加の深い重合反応を維持します。

システム内に水が存在する場合、水はメトオキシドナトリウムと反応して水酸化ナトリウムを形成します。ポリエステルを不可逆的に望ましくない遊離脂肪酸に変換する強力なベース。加水分解を防ぐために、fasの代わりに酢酸メチルを添加して、システム内の水酸化ナトリウムを除去します。

チューブを室温まで冷まします。インキュベーション後、各チューブに10ミリリットルの二塩化メチレンを加えてモノマーを抽出します。次に、1.5ミリリットルの氷酸を加えてサンプルを酸性化します。

チューブに0.5モルの塩化ナトリウム溶液を充填し、十分にボルテックスして数分間遠心分離します。ヒュームフードの下。下部有機相をピペットで慎重に、清潔なすすぎ済みの中型のチューブに移します。

サンプルを生理食塩水ボルテックスで再度洗浄し、10分間遠心分離します。上部の水相を取り除き、次に乾燥剤として無水硫酸ナトリウムをサンプルに加え、溶液渦サンプルに残っている微量の水を除去し、遠心分離機に溶媒を移し、事前にすすいだ小さなサイズのチューブをきれいにし、チューブを窒素蒸発器にロードして溶媒を蒸発させ、モノマーの乾燥残留物を取得します。ガラスシリンジを使用して、100マイクロリットルのプリンと100マイクロリットルのB-S-T-F-Aを加えて、ヒドロキシル基を揮発性トリメチル細胞誘導体に変換します。

サンプルを100度で10分間インキュベートします。チューブを冷まし、窒素ガス下で蒸発させます。500マイクロリットルの1対1のHEPTANEトルエン溶液を赤色溶解残基に加え、その後、短時間遠心分離します。

誘導体サンプルを400マイクロリットルのインサートが入ったGCバイアルに移します。バイアルロードサンプルをガスクロマトグラフに封入し、ガスクロマトグラフでキャピラリーカラムに注入して分析し、溶出液を4重質量分析計で検出します。GCMS分析によって取得された生データは、各サンプルのクロマトグラムとして処理され、提示されます。

異なるクロマトグラフィーピークに対応する個々のモノマーは、その特異的質量スペクトルによって識別されます。GC保持時間では、個々のモノマーの量は内部標準定量法を使用して決定されるため、サンプル間でモノマーの存在量と組成を比較することができます。ここに示されているのは、野生型に対応するウサギの膿瘍葉組織と、異なるモノマープロファイルを示す P 4 50 モノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の 2 つの変異対立遺伝子から放出されたモノマーの代表的な分析からの重ね合わせクロマトグラムです。

私たちの結果は、有意な違い、3つの主要なクチン、モノマー、および野生型および突然変異シロイヌナズナ植物の豊富さを示しています。このプロトコールは、植物脂質ポリエステルの構成モノマーの単離同定および定量化により、植物脂質ポリエステルの組成をアッセイするための堅牢な方法です。この手順はスケーラブルで、根、種子、葉、その他の組織全体など、さまざまな植物材料を大量に処理するために容易に適応させることができます。

この手法は、高等植物におけるクチンとスベリンの生合成制御と分布を調査する研究に適用できます。