植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水バリアとして機能する細胞外層に依存しています。これらの親油性細胞および関連構造は、病原体の感染を制限し、植物組織へのガス、水、および溶解物質の受動的な輸送を調節します。重要なバリアの一つに、植物に特有の複雑な構造である植物クチクラがあります。

クチンは、クチクラの構造マトリックスを構成する不溶性のグリセロール脂質ポリエステルであり、溶媒抽出可能なワックスを伴っています。本稿では、脂質ポリエステルの組成および脂質を除去した植物組織を分析するための信頼性の高い手法を提示します。このプロトコールでは、組織サンプル全体を採取し、ホモジナイズした後、一連の溶媒抽出によってクチクラおよびエピクチクラワックスを含む溶媒可溶性脂質を完全に除去し、脱脂処理を行います。

膜脂質中のトリグリセロール。次いで、ナトリウムメトキシド触媒によるメチル分解により、試料を構成脂質モノマーへと脱重合させる。シミュレーション試薬を添加し、ヒドロキシ基をガスクロマトグラフィー分析に適した対応するトリメチルシル誘導体へと転移メチル化する。

その後、誘導体化した残渣をGCバイアルに移し、A-G-C-M-Sにロードして分析を行い、クロマトグラムを作成することでバイオポリエステルのモノマー組成を特性評価します。抽出サンプル中に存在します。ここでは、成熟した野生型および2種類の変異体arabidopsis ANA植物から全葉サンプルを採取します。

抽出および分析のため、クロロホルムで予備洗浄した清潔なガラスチューブに0.5 gramsの組織を加えます。フラスコに100 millilitersのイソプロパノールを入れ、BHTを0.01%濃度になるように加えます。BHTは、溶媒抽出中の二重結合や脂肪酸の酸化を防ぐために添加される抗酸化剤です。ウォーターバスを用いて、溶媒を約85 degreesまで予熱します。

植物組織1gあたり25mLの加熱済みイソプロパノールを加え、サンプルをヒートブロックにて85°Cで15分間インキュベートする。耳および目の保護具を着用し、チューブを室温まで冷却させる。最後に、ホモジナイザーでサンプルを粉砕して均一に分散させ、スクリューキャップでチューブを密閉し、100RPMで1〜2分間振とうした後、サンプルを800Gで10分間遠心分離する。

有機相をペレットに凝縮された高密度物質から分離するため、パストールピペットまたはプロピペットを用いて上清を除去し、廃棄します。この際、ペレットを乱さないように注意してください。室温のイソプロパノールを同量加え、サンプルを一晩振盪させます。

100 RPMでサンプルを遠心分離し、上清を捨てます。組織1gあたり、クロロホルムとメタノールの2:1溶液を25 mL加え、一晩振とうした後、遠心分離して有機相を捨てます。その後、クロロホルムとメタノールの1:2溶液を用いてこの工程を繰り返します。

ペレットを一晩乾燥させ、チューブをドラフトチャンバーから無水硫酸カルシウムを含む真空デシケーターに移し、少なくとも3日間、または恒量に達するまでサンプルを脱水させます。十分に乾燥した後、ナトリウムメトキシド触媒によるメタリシスによる脱アシル化の準備が整います。ガラス製シリンジを用いて、乾燥させた組織が入ったチューブに2種類の内部標準溶液を添加します。まず25 µLのmethyl HETO decanoateを加え、次に25 µLのomega pentec and lactoneを加えます。

深層重合を開始するには、サンプルに0.9 millilitersの酢酸メチルを加え、続いて1.5 millilitersのナトリウムメトキシド触媒と3.6 millilitersのメタノールを加えます。サンプルを60 degreesで2時間インキュベートし、反応システム内で定期的にボルテックス処理を行います。脂質ポリエステルは親核的なメトキシドアニオンと反応して不安定な四面体中間体を形成し、これが容易に分解して脂肪酸メチルエステルと酸化物アニオンになります。これらの酸化物は共役塩基であり、メタノールと反応して触媒活性を持つメトキシドアニオンを再生し、それによってさらなる深層重合反応を維持します。

系内に水が存在する場合、水はナトリウムメトキシドと反応して水酸化ナトリウムを生成します。水酸化ナトリウムは強塩基であり、ポリエステルを望ましくない遊離脂肪酸へと不可逆的に変換します。加水分解を防ぐため、系内の水酸化ナトリウムを除去するために酢酸メチルが添加されます。

チューブを室温まで冷却します。インキュベーション後、各チューブに10 millilitersのジクロロメタンを加えてモノマーを抽出します。その後、1.5 millilitersの氷酢酸を加えてサンプルを酸性にします。

チューブに0.5 molar 塩化ナトリウム溶液を満たし、十分にボルテックスした後、数分間遠心分離します。この操作はドラフトチャンバー内で行ってください。ピペットを用いて、下層の有機相を慎重に、あらかじめ洗浄した中サイズの清潔なチューブに移します。

サンプルを再度生理食塩水で洗浄し、ボルテックス処理した後、10分間遠心分離します。上層の水相を除去し、溶液中に残存する微量の水分を取り除くための乾燥剤として無水硫酸ナトリウムをサンプルに添加し、ボルテックス処理および遠心分離を行います。その後、溶媒をあらかじめ洗浄した清潔な小型チューブに移し、窒素エバポレーターにセットして溶媒を蒸発させ、モノマーの乾燥残渣を得ます。ガラスシリンジを用いて、100 µLのピューリンと100 µLのB-S-T-F-Aを添加し、ヒドロキシ基を揮発性のトリメチルセル誘導体に変換します。

サンプルを100 °Cで10分間インキュベートします。チューブを冷却し、窒素ガス下で溶媒を蒸発させます。1:1のHEPTANE/トルエン溶液を500 µL加え、残留物を再溶解させた後、短時間遠心分離を行います。

誘導体化サンプルを400 µLのインサートが入ったGCバイアルに移します。バイアルを密閉してガスクロマトグラフにロードし、キャピラリーカラムに注入して分析を行い、溶出物を四重極質量分析計で検出します。GCMS分析によって得られた生データは処理され、各サンプルのクロマトグラムとして提示されます。

異なるクロマトグラフィーピークに対応する個々のモノマーは、それぞれの固有のマススペクトルによって同定されます。GC保持時間における個々のモノマーの量は、内部標準定量法を用いて決定され、これによりサンプル間でのモノマーの量と組成の比較が可能になります。ここでは、野生型およびP450モノオキシゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の2つの変異アレルに対応するウサギ膿瘍葉組織から放出されたモノマーの代表的な分析による重ね合わせクロマトグラムを示しており、それぞれ異なるモノマープロファイルを示しています。

我々の結果は、野生型および変異型シロイヌナズナ植物において、3つの主要なクチンモノマーの含有量に有意な差があることを示しています。本プロトコルは、構成モノマーの単離、同定および定量により、植物脂質ポリエステルの組成を分析するための堅牢な手法です。この手順はスケールアップが可能であり、根、種子、葉、その他の全組織を含む、さまざまな植物材料の大容量処理に容易に適応させることができます。

この技術は、高等植物におけるクチンおよびスベリンの生合成調節と分布を調査する研究に適用可能です。