植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

植物のキューティクルは、植物のワックス状の外側の覆いであり、水の保全に主要な役割を果たしますが、病原性微生物の侵入に対する重要な障壁でもあります。キューティクルは、クチンと呼ばれる丈夫な架橋ポリマーと、植物の表面をシールする保護ワックス層で構成されています。キューティクルのワックス状の層は、ツタの葉に光沢のあるフィルムとして、またはブドウやキャベツの葉の表面にほこりっぽい外側の覆いとして現れる多くの植物で明らかです。

ワックスに存在する光散乱結晶のおかげで、キューティクルは植物を陸生環境に適応させるのに不可欠です。植物のクチクラ形成に関与する遺伝子が農業と林業の両方に応用できることを理解する。今日は、フォワードジェネティクスとリバースジェネティクスのアプローチによって同定された植物クチクラMUSの解析を紹介します。

こんにちは、私の名前はUVCのボット部門のリリカ・クンツ研究室のパトリシア・ラムです。今日、私自身と他の人は、これらの植物がABがどのように植物が特定のワックスを作るかを理解するために研究することができる方法を示すつもりです。UVCのBrain Heart Jet's LabのMeenで、ガスクロマトグラフィーを使用してクチクラワックスの化学組成を分析する方法を紹介します。

私は、同じくUBCのLacey Samuels研究室のAlan Dub Bonoで、クライオ走査型電子顕微鏡を使用してopsis表面の結晶構造を分析する方法をご紹介します。私たちの全体的な目標は、植物が16または18の炭素の通常の脂肪酸をどのように取り、それらを26〜34の炭素の非常に長い鎖に伸ばすかを理解することです。次に、それらを植物の表面で見つける保護脂質に変更します。

それでは、始めましょう、フォワードとリバースの遺伝的アプローチを使用して特定のワックス手段を特定する方法を紹介します。こんにちは。そこで、ここにはラピッドオピスのカットミュータントがあり、これをsroと呼んでいますが、これはワックスを背負わないことを意味します。

これらの突然変異体をOCIで分離するために、視覚スクリーニングが使用されました。つまり、それらは視覚によって識別されました。突然変異体を見ると、ウェルタイプの植物の流入と茎は白っぽいのに対し、突然変異体は濃い緑色の光沢のある茎を持っていることがわかります。マーティン・Kと彼の同僚によって行われたこのタイプの視覚スクリーンで分離された突然変異体の1つは、これは4またはSIR4から呼

cuco変異体を発見する別の方法は、逆遺伝学的アプローチで候補遺伝子を選択し、これらの変異体で破壊された遺伝子でPLA系統を研究することです。TDNAは、目的の遺伝子を破壊するために使用されました。TD NAはDNA自然界のアグロバクテリウム腫瘍糞便によって植物に挿入されたDNAのセグメントです。この細菌は感染過程の一部としてTNAに感染しますが、科学者たちは細菌を武装解除して病原性を持たせないようにし、DNAを植物に移植するツールとして使用しています。

今回のキューティクル研究では、TDNAを使用してシトクロムP four 50酵素の遺伝子を破壊し、現在はこれを M1.In と呼んでいます。TDA挿入がM1遺伝子を破壊したことを確認するために、PCRを行います。ここに示すPCRゲルは、TDAの挿入が目的の遺伝子にあることを確認します。2つの遺伝子特異的プライマーを使用してウェルタイプDNAを増幅すると、このレーンにバンドで示される産物が見えますが、変異体と同様にTDがそれを中断します。

逆にTDNAや遺伝子に特異的なプライマーを使用した製品はありません。産物は突然変異体でのみ見られます。私たちは通常、遺伝子の母方と父方の両方のコピーが破壊されているホモ接合型変異株を探します。

しかし、遺伝子の一方のコピーがTDNAによって破壊され、もう一方のコピーがまだウェルタイプである場合、PCR Rの結果はこのように混合されます。キューティクル変異体サーフ4 ml one meの同定方法を示したので、ガスクロマトグラフィーを使用して化学組成を特定する方法を示します。ありがとう、パトリシア。

さて、ガスクロマトグラフィーを行う前に、キューティクルIを分析してみましょう。可溶性ワックス化合物は、クロロホルムで深くすることにより、植物表面から除去する必要があります。クロロホルムは、植物から可溶性ワックスだけでなく、クチンも完全に除去します。

ワックス成分を可溶化した後、クロロホルムワックス混合物をガスクロマトグラフィーカラムに注入し、そこで加熱され、ガスの流れ上でセンサースルーされます。ワックス混合物とは異なる化合物が、化合物を分離するカラムの壁に多かれ少なかれ付着し、カラムのもう一方の端で次々と出てきます。次に、化合物が火炎イオン化検出器を通過すると、ピークが見えます。

各ピークの保持時間は、異なる化合物および質量分析法を使用する場合に特徴的です。ADOSワックスの各成分を特定しました。野生型植物のクロマトグラムを見ると、主要なピークが第二級アルコール中の 29 炭素浮遊鎖 LK ケオンに対応していることがわかります。

マイナーピークは、高さから出た主要なアルコールであり、標準に対するピークの下の面積は、各化合物がどれだけ存在するかを示しています。これが、Patriciaが見せてくれたばかりの植物系統のクロマトグラムです。第一級アルコールとエステルが不足している一方で、マワンには第二級アルコールとケトンが不足していることに注意してください。

これらの表現型は、植物に関心のある遺伝子の機能について多くのことを教えてくれます。例えば、pho系統でどの遺伝子が変異しているのかを知る前に、表現型は生合成経路の一次アルコール分岐に問題があることを教えてくれました。その遺伝子の分子同一性がconsta研究室で研究された後、それが脂肪酸レダクターゼの遺伝子ファミリーの一部であり、この化学表現型によく適合することが発見されました。

私たちは今、この遺伝子を経路上に配置することができ、植物がワックスのこの成分をどのように作るかを示しています。さて、これが私たちのキューティクル変異体の化学組成を分析する方法です。次に、アランは、走査型電気顕微鏡を使用してキューティクルの構造を調べる方法を示します。感謝。

キューティクルのきれいな画像を見たい人はいますか?さっそく始めましょう。Rapid opsys sine変異体を目で調べると、それらが濃い緑色の光沢のある表現型を持っていることがわかります。

野生型植物を研究すると、肉眼で見ることができるこれらの表現型の基礎を決定するために、茎に白っぽい外観を見ることができます。走査型電子顕微鏡は、植物の表面のキューティクル構造を見るために使用されます。ガスクロマトグラフィーの研究からワックスの化学組成がわかっているため、化学的性質がワックス結晶の構造とどのように関連しているかを確認できます。

これらの結晶は、昆虫や病原体が茎の表面に着陸する最初のものになります。したがって、それらはキューティクル藻類の重要な部分です。クライオSEMプラントを実行するときは、凍結する必要があります。

液体窒素植物では、観察中は摂氏マイナス150度から100度に保たれます。このスコープでは、SEMが動作するために真空が必要であり、凍結していないとサンプルが乾燥して崩壊するため、細胞を無傷に保つために極低温が不可欠です。これで、サーファー4とマー1のサンプルをワイルドタイプのコントロールと一緒に解剖する準備が整いました。

最初にこれらの植物から花とCLICを取り除き、次に野生型と突然変異体から発生的に一致した茎のセグメントを切り取りました。次に、それらをSEMステップに取り付けます。サンプルを顕微鏡の低温段階に移して視覚化すると、野生の超熱心なオプシスステムキューティクルの表面が結晶で覆われていることがわかります。

その結晶からの光が茎に白っぽい印象を与えます。さて、ミュータントの茎が光沢のあるように見えたことを思い出してください。SEM画像では、表面の結晶が不足していることがわかります。

では、これらの結晶は何からできていて、何が面白い形をしているのでしょうか?答えは違います。ワックスの化学成分は、さまざまな形の結晶を与えます。

植物のキューティクルから単一の純粋なワックス化合物を単離して再結晶化した実験では、結晶は植物に見られるものと同じ形を形成します。ウサギのオプシスでは、結晶は化合物の混合物で構成されており、状況ははるかに複雑であると考えています。例えば、MEOが行った化学分析では、サーフ4では、第一級アルコールとその誘導体エステルの微量成分のみが欠落していることが示されています。

しかし、サーフフォーステムのクリスタルはなくなってしまいました。M1の場合、シトクロムP four 50酵素の突然変異の影響は、突然変異植物がワックスの2つの主要な成分である第二級アルコールとケトンを欠いていることです。それでもMAHの水晶1つの植物は普通に形づくる。

つまり、光散乱する結晶が存在しないことが、SRAの変異体であることがわかります。それらの光沢のある表現型は、常にキューティクルの組成の変化と正の相関があります。しかし、マーのような突然変異体は、ガスクロマトグラフィーによって明らかにされた化学表現型の変化にもかかわらず、その結晶は正常であるため、このアプローチを使用して見つけることは決してありませんでした。

そのため、既知の遺伝子ファミリーからキューティクル遺伝子を特定するためには、リバースジェネティクスのアプローチも必要です。私たちは、フォワード遺伝学とリバース遺伝学の両方により、ラブダウスキューティクル変異体を特定できることを示しました。ガスクロマトグラフィーを使用した突然変異体の表現型の化学分析は、植物が保護キューティクル脂質をどのように作るかを理解するのに役立ちましたクライオSEMは、キューティクルの化学的性質が変化すると植物の表面の結晶がどのように変化するかを示しています。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。