条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコルのCre-LOXマウスモデル
2015年11月21日
腸の上皮幹細胞（のISC）は、パネート細胞と混在しています。これらの細胞は、のISCをサポートするISCの子孫を分化し、抗菌保護を提供しています。ここでは、我々はパネート細胞は腸管上皮を維持する上で重要な役割を果たしていることを確立するために、トランスジェニック条件付きマウスモデルを使用する方法を示します。
この解剖手順の全体的な目標は、その後の特性評価技術のためにマウス腸を分離し、準備する方法を実証することです。この方法は、実験手順の後に腸幹細胞が腸に再増殖する能力を調査するために使用できます。この技術の主な利点は、それが任意の技術や任意の手順の後に、または遺伝子操作の後に使用できることです クレイロック技術を使用して 安楽死させた成体マウスを仰臥位に置き、毛皮を70%エタノールで濡らすことから始めます。
次に、はさみを使用して、正中線に沿って縦方向に腹腔を開き、鉗子で胃を固定します。次に、食道への接続を切断し、胃をそっと引っ張って虫垂までの小腸を切除します。その後、虫垂をそっと引っ張って、大腸を肛門まで取り除きます。
腸が分離されたら、虫垂の胃を取り出し、鈍い端のピペットチップを備えた注射器を使用して、洗い流した直後に腸をPBSで洗い流し、腸を近位、中央、遠位の3つの等しいサイズに切断します。次に、各切片を1センチメートルの小片に切り、組織の3〜5つの断片を2 x 2センチメートルの外科用テープの中央に置きます。ピラミッド型では、すべての組織が取り付けられたら、縦方向にピースの周りにテープをシールして丸太の山を作ります。
次に、組織の体積に対して少なくとも10倍の体積の中性、緩衝、フォーマル、固定剤を含む平底のレセプタクルにテープを置き、サンプルを摂氏4度で保存してから、埋め込みおよび切片化します。固定後、組織体積の70%エタノールの10倍以上の体積を含む平底レセプタクルに組織を移し、フラッシング直後にメトコンで組織を固定します。先ほど示したように、腸を3つの同じサイズのセクションに切ります。
次に、各セクションを15 x 15センチメートルの濾紙に並べて置き、すべてのセクションが分割されたら、スプリングボウハサミを使用してFOSSのセクションを開きます。固定終了時に、調製したばかりのメトコンを入れたガラス皿に濾紙を室温で3〜24時間移し、鉗子を使用して腸の各片の端を一度に1つずつピックアップし、鉗子の周りに組織を巻き付けて個々のスイスロールを形成します。鉗子をわずかに開き、組織を通して25ゲージの針を挿入して、各ロールを固定します。
次に、ロールした組織を、組織として少なくとも10倍の量の中性緩衝フォーミュラと固定剤を含む平底のレセプタクルに少なくとも1時間入れてから、組織のバースト全体を緩く視覚化するための処理を行います。鉱油を混ぜた溶かした生ワックスを15センチのシャーレに注ぎます。次に、腸を氷冷PBSで洗い流した直後に、25ミリリットルの氷冷excal固定剤で組織を洗い流します。
固定後、腸を3〜5等分し、冷却したワックスプレートの1つに各切片を置きます。プレートの上部にある腸間膜線でセクションがわずかに伸びるように、各端をピンで留めます。余分な腸間膜をトリミングします。
次に、スプリングボウハサミを使用して、すべてのセクションがピン留めされたときに開くときに、内臓を縦方向にピンで留めてカットします。摂氏4度で少なくとも1時間後に、すべての組織を覆うのに十分なxal固定剤でプレートを浸します。.25ミリリットルのピペットまたは注射器を使用して固定剤を取り出し、30ミリリットルのPBSで組織を一度洗浄します。
次に、切片を30ミリリットルのDTTD統一溶液で覆い、室温で30〜60分間ロッキングしながらインキュベーションします。インキュベーションの終わりに、25ミリリットルのピペットまたはシリンジで神格化溶液を取り除き、さらに30ミリリットルのPBSで組織を浸します。次に、洗浄後に後部ピペットを使用して、PBSで粘液を取り除きます。
PBSを30ミリリットルのxalと交換して、暗闇の中で室温で一晩染色し、翌朝、ロッキングプラットフォームで穏やかに攪拌します。切片に青緑色の汚れが生じた場合は、xalを30ミリリットルのPBSと交換します。3分間穏やかに攪拌した後、示したようにスイスロールを作り、4°Cの組織の体積の少なくとも10倍の適切な固定剤を含む広口の平底レセプタクルに組織を少なくとも24時間置いてから、包埋および切片化します。
ROSA 26 R Laxyコンディショナルレポーターを使用すると、組換えベビーベッドから抽出したDNAを使用して、小腸での誘導後3日で100%の組換えを観察できます。組換え対立遺伝子のQPCRは、VIクリース系内の組換えの有意でない増加を示しましたが、これはおそらく観察されなかったパネート細胞での組換えによるものでした。laxy reporterを使用したahクリースシステムを使用すると、どちらのシステムも導入後3日で組換え細胞が完全に失われることを示しました。
有糸分裂とK陰窩の細胞高さデータは、ah H Creeシステムがおそらく結合していない腸幹細胞による再増殖により回復する可能性があることを示しました。それとは対照的に、悪役のクリー族は、上皮の陰窩細胞を保持しているにもかかわらず、回復することができなかった。さらに、vi Cree Cantin B群れマウスの陰窩細胞は非増殖性であり、腸幹細胞マーカーの発現を欠いていました。
EMの4。同様に、ah creマウスの陰窩とは異なり、PTH細胞はCaden b欠失後にVI Cree系内でのみアポトーシスを受けました。一度習得すれば、このテクニックは約10分で完了することができます。
組織の劣化を防ぐために、遅延を最小限に抑えることが重要です。このビデオを見れば、マウスから腸を取り出して下流の分析を行う方法についてよく理解できるはずです。
概要
この記事では、腸上皮幹細胞（ISC）とパネート細胞の相互作用に焦点を当て、マウスの腸の分離と解析技術の特徴づけに向けた準備について説明しています。研究は、腸上皮を維持するパネート細胞の重要性とISC再生を調査する手法を強調しています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 消化器科学
背景
- 腸上皮幹細胞（ISC）は腸の維持に不可欠です。
- パネート細胞はISCをサポートし、抗菌保護を提供します。
- それらの役割を理解することで、再生医療と消化器の健康に役立ちます。
- これらの相互作用を研究するために、トランスジェニックマウスモデルが使用されます。
研究の目的
- 下流の分析のためにマウスの腸を分離し準備すること。
- ISCが腸を再生する能力を調査すること。
- 腸の健康におけるパネート細胞の役割を示すこと。
使用した方法
- 標準化された手順によるマウスの腸の解剖。
- PBSによる腸のフラッシングとホルマリンによる固定。
- 分析のための組織の埋め込みと切片化。
- ISCの組換えを観察するための条件付きリポーターシステムの使用。
主な結果
- 分析のための腸組織の成功的な分離。
- 腸の完全性を維持するパネート細胞の重要な役割の実証。
- 遺伝子操作に基づくISC集団の回復の違いの観察。
- 特定の条件下でのパネート細胞のアポトーシスの同定。
結論
- この方法は腸幹細胞の効果的な研究を可能にします。
- パネート細胞はISCの維持と腸の健康に不可欠です。
- さらなる研究により、腸の再生メカニズムが解明される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the dynamic interplay between intestinal stem cells and their niche components, such as Paneth cells, is critical for de-risking regenerative medicine strategies. This model system enables mechanistic interrogation of stem cell-niche dependencies, supporting target validation in gastrointestinal pathophysiology. Insights from conditional Cre-lox manipulation inform predictive confidence in therapeutic approaches aimed at enhancing tissue repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates functional dependencies between stem cells and niche-supporting cells like Paneth cells.
- Operational Value: Enables genetic ablation of specific cell populations to assess niche necessity.
- Strategic Value: Supports target de-risking by clarifying cellular requirements for stem cell-mediated regeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized tissue preparation workflow for downstream histological and molecular analysis.
- Operational Value: Ensures reproducible intestinal segment isolation and fixation for consistent staining and imaging.
- Strategic Value: Facilitates assay-ready samples for evaluating stem cell repopulation and niche integrity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models injury-induced regeneration and tests the requirement of Paneth cells for stem cell recovery.
- Operational Value: Uses conditional genetic systems to temporally control gene deletion in specific cell lineages.
- Strategic Value: Enables preclinical assessment of niche-targeted therapies for mucosal repair.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology by enabling conditional gene deletion in stem cell or niche populations to test regenerative capacity.
- Discovery Biology: Allows hypothesis testing of stem cell-niche interactions through lineage-specific Cre drivers.
- Screening: Generates fixed tissue sections suitable for immunohistochemistry and morphometric analysis of crypt dynamics.
- Analytics: Enables quantification of mitotic activity, crypt height, and stem cell marker expression post-injury.
- Translational Research: Connects niche function to preclinical models of intestinal regeneration and repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying stem cell dependencies across disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stem cell regulation by isolating niche variable contributions.
- Operational Value: Standardizes intestinal dissection and fixation for multi-site reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in regenerative programs by validating target cell necessity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in niche-modulating therapies based on mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse genetics, conditional Cre-lox systems, and intestinal dissection.
- Dependent on access to fluorescent reporters, fixation infrastructure, and sectioning equipment.
- Necessitates standardization across teams for tissue orientation, staining, and imaging protocols.
- Adaptation considerations include varying Cre driver specificity and recombination efficiency across intestinal regions.
- Practical limitations include variability in Cre penetrance and potential compensatory mechanisms in niche ablation models.
