Name: 条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコルのCre-LOXマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶマウス腸の解剖法とパネート細胞の役割。Cre-LOXマウスモデルを用いて腸上皮幹細胞の維持と再生メカニズムを解析する手法を解説。再生医療や消化器病学研究に応用可能です。

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著者はMark Bishop氏、Mathew Zverev氏、Victoria Marsh-Durban氏、Adam Blackwood氏、Sylvie Robine氏に感謝します。 この研究は、Cancer Research UKからのプログラム助成金によって資金提供されました。

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 <a target="_blank" href="http://www.molecularmovies.com/movies/view/96">http://www.molecularmovies.com/movies/view/96</a> (2015).</li>
<li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li>
<li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5%2B+crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract%3A+effect+of+loss+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li>
<li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+background+recombination%3A+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+%28crypt%29+and+horizontal+%28duodenum%2C+cecum%29+axes+of+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li>
<li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li>
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<li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice%3A+evidence+for+a+delayed%2C+p53-independent+G2%2FM-associated+cell+death+after+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li>
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<li>Jardé, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O%CE%94N89%CE%B2-catenin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li>
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<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

遺伝子および細胞の機能を分析するために、条件CRE-LOXトランスジェニックマウスを使用すると、一般的に使用されるアプローチです。これらのモデルは、特定し、特徴づける幹細胞2,4-6をし、病気25におけるその役割を理解するために腸で大きな成功を収めて使用されています。完全にこれらのモデルを活用するために、正しく解釈されるデータを可能にするために、システムの総合的な特性評価が必要です。これらのシステムの完全な理解が原因遺伝子はほとんど孤立細胞型または位置、生物学的知識及びCre発現を誘導するために使用されるシステムの非効率性の欠如に特定されないように達成することは困難です。ここで説明する方法は、我々は実験的なデザインと既存の知識のアプリケーションを介してこれらの問題を克服する方法を示します。我々は、ここで紹介するテクニックは一般的なものとムリを調査する任意の研究に利用することができる特定の研究の質問に答えるために、これらのメソッドを使用しましたがNE腸。 腸組織の作製 強固な結果を確保するための重要なステップは、厳密に付着適時および固定プロトコルで処理する必要がある組織の採取及び処理です。ほぼすべての重要な問題は、下流の組織乾燥アウトおよび/または不完全な固定に関連するアーティファクトに起因することができます。タイミングは、組織構造および/または核酸およびタンパク質の分解を防ぐために重要です。不完全または熱心固定は、組織化学的解像度の損失につながることができます。固定液の浸透がIHC分析の際に「潮マーク」として観察することができる腸陰窩内解像度の損失をもたらすことができるようにするにはあまりにも厚く、不十分な時間やセクションに不完全な固定。さらに核βカテニンはすぐにプロのない限り、核の外に拡散することができるように、それは、固定が長すぎるために拡張されないことが重要ですcessedとホルマリン固定次の埋め込みワックス。 ISCのニッチでパネート細胞の役割 ここに示されたデータは、効果的に、ISCの損失以下の成人の腸内で暗号再生におけるパネート細胞の重要性を示しています。しかしそこにAH-CREはVIL-のCre-ER T2をターゲットことのISCの人口を惜しみ可能性が残りました。天ら26はエレガント LGR5 ハイテクのISCがLGR5 LO予備のISCの人口に置き換えられていることを実証しました。今はこれらのISCが原因で分泌細胞前駆体6,7として同定された予備の集団にAH-CREシステムに免れている可能性が高いようです。 ISCの状態に戻すために必要なときに、これらの分泌細胞前駆体を支える成熟パネート細胞の重要性が答えられることを残ります。パネート細胞は、Iを構成するようにSCニッチ8とカロリー摂取量27と炎症28にISC応答の調節に役割を果たし、それは彼らの看護の機能は、独自の前駆体に拡張される可能性が残っています。 新しいアプローチとテクノロジモデルヒト結腸直腸癌を効果的に ISCの発見は、今やクラークら9によって概説腸生物学および疾患における遺伝子と細胞の役割を調べるための新しいマウスモデルを生成するために使用されている遺伝子の同定につながりました。この技術の唯一の制限は、Creタンパク質を発現する遺伝子の同定です。現在のISCは定期LGR5遺伝子発現パターンに基づいて、条件付きトランスジェニックマウスを用いて調べました。 LGR5プロモーターからのCreを発現するマウスは 、APC、最も一般的に大腸癌で変異遺伝子（CRCを削除するために使用されています）、起源25のセルとして、ISCを実証します。選択的に削除するこれらの細胞内の他のCRC遺伝子は、疾患の進行への洞察を提供し、広がっているなど。PTEN 29。 ISC機能へのさらなる洞察は、ヒトジフテリア毒素受容体（DTR）遺伝子を用いて、マウスの細胞を発現性LGR5を切除することにより取得されるLGR5座 26にノックしました。他の戦略は、変異タンパク質30の継続的な可逆的発現を可能にテト-Oシステムを使用しています。異なるセル31との位置32,33における遺伝子（複数可）を変更するためにこれらのツールを使用すると、癌は、進行を開始し、34の転移方法を理解するために使用されます。あるいは、眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いて、突然変異誘発は、CRCの新しいドライバを識別しています。マウス、技術や遺伝子変化戦略の継続的な開発は、より多くの患者関連するモデルを開発し続けています。 新しいメートルethodsは、腸管上皮とのISCの特徴付けのために開発されてきました。上皮細胞型の割合の特徴付けは、レクチンおよびCD24 35の示差的な発現に基づいてフローサイトメトリーを用いて達成することができます。潜在ISC生物学および疾患におけるそれらの役割を理解する上で最大の進歩は 、ex vivoオルガノイド培養系36を用いて説明します。このシステムは、彼らが複製し、より生理学的に関連する方法で差別化、3D、培養に正常および悪性のISCを可能にします。これらは個別化医療37への道を切り開いて、in vitroで患者サンプルに対する薬物の直接的な試験を可能にすることが期待されています。

哺乳動物の腸の管腔表面は、突起のような陰窩と指の繰り返し単位を備え、内腔に突出する絨毛は、と呼ばれます。 4日目1 -この表面は、ほぼ毎3完全な自己再生を受ける上皮の連続シートです。最初LGR5遺伝子 2,3の発現によって同定した。この動的な組織が ​​急速にサイクリング幹細胞（も陰窩ベース円柱細胞として知られているのISC）の人口でサポートされています。これらの細胞は、リーベルの陰窩の下部に特化したニッチに存在します。当初、のISCが急速にサイクリングた発見は、幹細胞が本質的に静止したことを支配する考えと耳障りでした。それは静止ラベルの人口は、陰窩のベースに対して4位置に細胞を保持すると仮定されたLGR5 + ISCの同定前、のISC 1でした 。最近の研究の時間今主に運命隣国4,5によって規制されている各陰窩における等効力サイクリングのISCのプールがあることを実証することによって、これらの観察を両立。イベントでは、彼らは、これらは通常、分泌系統にコミットしているが、ISCの人口は6を損傷した場合のISCに戻すことができ、静止細胞に置き換えることができます失われます。 ISCの隣人はのISCまたはその娘細胞のいずれかとすることができます。 ISCは、増殖しているライン腸管腔1上皮シートを備える特殊な細胞型に分化ナイーブ娘細胞を産生します。ゴブレット、腸、腸、房およびM細胞は、様々な吸収や調節機能を提供腔表面に上向きに移動するが、パネート細胞は、それらがのISCと混ざり存在陰窩の底に残っています。近年では、ナイーブdaughtの割合ことが実証されています分泌系統宛てER細胞が傷害6,7時に、ISCに戻すことのできるLGR5 LO細胞を保持静止ラベルです。 原因陰窩再生におけるその重要性に優先順位をのISCとその近隣諸国、特にパネート細胞間の相互作用を理解する上に置きました。パネート細胞はのISC 8をサポートしてニッチで重要な役割を果たしています。殺菌製品に加えて、パネート細胞は、ISCの再生または分化を支配する経路を活性化するシグナル伝達分子を生成します。以前の研究は、彼らが自分の娘パネート細胞8が提供する本質的なニッチ信号を競うことができたときにLGR5 +のISCにのみ存在することを示しました。これらの研究は、通常のLGR5 +のISCではなく、それらが損傷し、LGR5 LO集団からの補充を必要としている状況でパネート細胞の役割を調べました。 <pクラス= &quot;jove_contentは&quot;&gt;我々はトランスジェニックマウスモデル9,10を用いて細胞および/ ​​または遺伝子の機能的役割を調べ腸生物学とモデル疾患を理解するために。頻繁にこれらのモデルは、条件付き遺伝子（複数可）9,10を変更するには、CRE-LOX 技術を活用しています。のCre（組み換えを起こす）リコンビナーゼは、バクテリオファージP1から分離され、インテグラーゼファミリーの部位特異的リコンビナーゼである。Creを&#39;は定義された34塩基対の間の部位特異的組換えを触媒しますロックスP &#39;（クロスオーバーP1の軌跡χ）サイト。マウスは遺伝的にCreリコンビナーゼの発現の際に切除される関心領域に隣接するLoxP部位を含むように操作されています。セルまたは発生特異的プロモーターにCre遺伝子の発現をリンクすると、変更は、空間ファッション9,10で行われるために、これは胚性致死突然変異を克服するのに特に有用であることができます。さらに受容体経路にCre発現を結びます、それは一時的な変更を可能にし、人為的に活性化させることができます。 この技術を用いて、我々は、腸上皮にCatnB遺伝子 11を不活性化。 βカテニン、CatnB遺伝子産物は 、ISCのホメオスタシスを支配する標準的なWntシグナル伝達経路の重要な調節因子です。この戦略を使用して、前の2つの研究では、矛盾する結果12,13を生産しました。 Fevr ら12の研究は、幹細胞および腸の恒常性の喪失を示しました。アイルランドらに対し、14の研究では、細胞生存率の低下を以下陰窩-絨毛軸がCatnBを発現する野生型細胞からの再増殖したことを報告しました。これらの研究における主な違いは、腸の上皮でのCreを発現するために使用されるプロモーターでした。 Fevr らの研究は、Tを投与することによって活性化することができる、エストロゲン受容体に結合されたビリン遺伝子プロモーターを使用しましたamoxifen（VIL-のCre-ER T2の ）15,16。対照的にアイルランドらは、生体異物βナフトフラボン（AH-CRE）に応答して、Cre発現を駆動するために、ラットチトクロームP450A1（CYP1A1）遺伝子のプロモーター要素を利用します。これら異なるシステムの特徴は、これらの異なった観察を考慮するために、2つの仮説を生成しました。 CatnBをより効率良くサブ再増殖レベルへのISCの数を減らす、AH-CREに比べVIL-のCre-ER T2のシステムを使用して ISCで削除されていることを初めて。あるいは、それは、分化した細胞集団でCatnBの削除を差によるましました。 VIL-のCre-ER T2システムの対象AH-CREシステムに対し、陰窩および絨毛のすべての上皮細胞にのみ、ISCのニッチと陰窩の非パネート細胞を標的とします。これらのシステムはbehavを調べるための理想的なツールを提供しますISCのIORとパネート細胞との相互作用。ここでは、我々はパネート細胞は傷害17に腸の応答を媒介するのに重要な役割を果たしていることを決定するためにこれらのシステムを使用する方法に基づいていくつかの詳細なプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>酢酸緩衝液</td><td>*</td><td>*</td><td>100 mlを作るには:4.8 ml 0.2 M酢酸、45.2 ml 0.2 M酢酸ナトリウム、50 ml蒸留水</td></tr><tr><td>フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td>C<td>/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸溶液</td><td>*</td><td>*</td><td>2 M無水酢酸0.1 Mトリエタノールアミン塩酸塩アル</td></tr><tr><td>シアンブルー</td><td>シグマ</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>アルシアン ブルー pH 2.5</td><td>*</td><td>*</td><td>500 ml を作るには: 15 ml 酢酸、5 g アルシアン ブルー & 485 ml 蒸留水</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ標識抗体</td><td>アブカム</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(ベータ)-ナフトフラボン</td><td>シグマ</td><td>N3633</td><td>BNFは、化合物が溶液から脱落するので、溶液を冷ましすぎないように注入してください。ソリューションは再利用できます&ndash;-20°Cで保管します。使用の間にC、2回以上再加熱しないでください。</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vector Labs</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM パープル</td><td>ロシュ</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>ウシ血清アルブミン</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C/4920/17</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸緩衝液/抗原アンマスキングソリューション</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>コーン油</td><td>Σ</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>解粘液</td><td>*</td><td>*</td><td>500 mlの場合:50 mlグリセロール、50 ml Tris 0.1M pH8.8、100 ml EtOH、300 ml生理食塩水(0.9% NaCl in water)、DTT 1.7 g.&nbsp;解粘液は事前に作って保存することができますが、DTTはインキュベーション直前(340mg/100ml)に添加する必要があります。</td></tr><tr><td>DEPC 処理水</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ</td><td>101509944</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>O3690</td><td>0.5M</td></tr><tr><td>エタ</td><td>ノール フィッシャー サイエンティフィック</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>SLBL11382V</td><td>中性緩衝ホルマリン</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td>F5786</td><td></td></tr>グル<tr><td>タルアルデヒエ</td><td>シグマ</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>レイモンドAラム</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS(-MgCl2+;-CaCl2)</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファー</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp;5回;SSC、50%ホルムアミド、5%SDS、1 mg / mlヘパリン、1 mg / ml子牛肝臓tRNA</td></tr><tr><td>ハイドロキノン</td><td>Sigma</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB ペルオキシダーゼ</td><td>ベクターラボ</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP 抗マウスIgGキット</td><td>ベクターラボ</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP 抗ウサギIgGキット</td> ベクター<td>ラボ</td><td>MP-7401</td><td></td></tr>腸<tr><td>組織粉末</td><td>*</td><td>*</td><td>5匹の成体マウスの小腸を組み合わせ、氷冷PBSの最小量で均質化しました。4容量の氷冷アセトンを均質化した腸に添加し、十分に混合して氷上で30分間インキュベートしました。これを遠心分離し、ペレットを氷冷アセトンを使用して洗浄しました。これをさらに遠心分離し、得られたペレットを濾紙上に広げて乾燥させた。完全に乾いたら、乳棒と乳鉢を使用して材料を微粉末に粉砕しました。</td></tr><tr><td>K-フェリシアン化</td><td>物</td><td>Σ P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-フェロシアン</td><td>化物 Σ</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>Σ</td><td></td> L0380000 <td></td></tr><tr><td>メタカン</td><td>*</td><td>*60</td><td>% メタノール:30% クロロホルム:10% 酢酸</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Σ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Vector Labs</td><td>S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>正常なウサギ血清</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT</td><td>*</td><td>*</td><td>100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM レバミゾール</td></tr><tr><td>PAP ペン</td><td>ベクター</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0.5 M NaCl、10 mM TrisHCL pH7.5、0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x solutiuon.</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(10x)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP3994</td>蒸留<td>水で1:10を希釈して1x</td></tr><tr><td>PLLスライドを</td>作製 <td>シグマ</td><td>P0425-72EA</td><td>ポリ-L-リジン顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>シグマ</td><td>P2308</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テイナーゼK溶液</td><td>*</td><td>*</td><td>プロテイナーゼKを200 & microで希釈;g/mL 含有 50 mM Tris、5 mM EDTA。</td></tr><tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 7N</td><td></td></tr><tr><td>レデューサーソリューション</td><td>*</td> <td>*</td> <td>100 mlを作るには:1 gハイドロキノン、5 g亜硫酸ナトリウム、100 ml蒸留水</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>*</td> <td>* *</td> <td>0.9%NaCl蒸留水</td></tr><tr><td>SDS</td><td>シグマ</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>シグマ</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>銀溶液</td><td>*</td><td>*</td><td>100 ml を作るには: 10 ml 酢酸緩衝液、87 ml 蒸留水、3 ml 1% 硝酸銀</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>亜硫酸</td>ナトリウム <td>Σ</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>シグマ</td><td>93017</td><td>20x生理食塩水クエン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>T5648</td><td>TAMは、化合物が溶液から脱落するため、溶液が冷えすぎないように注入します。ソリューションは再利用できます&ndash;-20°Cで保管します。使用の間にC、2回以上再加熱しないでください。</td></tr><tr><td>TBS/T</td><td>Cell Signalling</td><td>#9997</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Hardset Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>ベクタステイン ABC キット</td><td>ベクターラボ</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>X-gal 固定剤</td><td>*</td><td>*</td><td>2% ホルムアルデヒド、0.1% グルタルアルデヒド 1x PBS</td></tr><tr><td>X-gal stain</td><td>*</td><td>*</td><td>X-gal stain; 200 &#956;50 mL溶液B(0.214 g MgCl2、0.48 gのK-フェリシアン化物、0.734 gのK-フェロシアン化物500 ml PBS)中のX-gal(A)。.ソリューションBは、事前に作成して4°Cで保存できます。C</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em&gt;のcre-lox</em&gt;マウスモデル

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

7日 - 哺乳類の腸の上皮表面は、すべて3を更新動的な組織です。この更新プロセスを理解することは、急速にLGR5遺伝子の発現によって特徴付けられる腸管幹細胞（のISC）をサイクリングの人口を同定しました。これらは、損傷の際にそれらを置き換えることができるBMI-1発現によってマーク静止幹細胞集団、によって支持されています。これらの集団間の相互作用を調査すると、疾患や癌における役割を理解するために不可欠です。 ISCは、腸の表面に陰窩内に存在し、これらのニッチは、上皮を補充するには、ISCをサポートしています。それは以前にLGR5 ISCの&#39;&#39;幹細胞性」が「密接に隣接パネート細胞の存在に結びついていることが実証されているように、活性と静止のISCとの間の相互作用はおそらく、ニッチ内の他の分化細胞を含んでいます。条件CRE-LOXのマウスを使用モデル我々は、パネート細胞の存在下または非存在下で活性のISCの大部分を削除する効果を試験しました。ここでは、腸を特徴付け、パネート細胞はかなりの損傷後の回復を助けるのに、ISCのニッチ内の重要な役割を果たしていることを証明するために行わ技術と分析について説明します。

腸の上皮幹細胞（のISC）は、パネート細胞と混在しています。これらの細胞は、のISCをサポートするISCの子孫を分化し、抗菌保護を提供しています。ここでは、我々はパネート細胞は腸管上皮を維持する上で重要な役割を果たしていることを確立するために、トランスジェニック条件付きマウスモデルを使用する方法を示します。

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em&gt;のCre-LOX</em&gt;マウスモデル

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

この解剖手順の全体的な目的は、その後の特性評価技術に用いるために、マウスの腸を分離し準備する方法を示すことです。この手法は、実験的な処置後に腸管幹細胞が腸を再構築する能力を調査するために使用できます。この技術の主な利点は、あらゆる手法や処置、あるいは遺伝子操作の後に適用できることです。Cryolock技術を用いて、安楽死させた成体マウスを仰向けに配置し、被毛を70% ethanolで濡らすことから始めてください。次に、はさみを用いて腹腔を正中線に沿って縦方向に切開し、胃をピンセットで固定します。続いて、食道との接続部を切断し、胃を穏やかに牽引して、虫垂までの小腸を取り除きます。その後、虫垂を穏やかに牽引して、肛門までの大腸を取り除きます。腸管を単離した後、虫垂にある胃を除去し、鈍端ピペットチップを装着したシリンジを用いてPBSで腸管内を洗浄します。洗浄直後に、腸管を近位、中間、遠位の3つの等分に切断します。次に、各セクションを1 cmの断片に切り分け、2 cm × 2 cmのサージカルテープの中央に組織片を3〜5個配置します。すべての組織をピラミッド状に配置した後、組織の周囲を縦方向にテープで密閉し、丸太を積み重ねたような形状にまとめます。次に、組織量に対して少なくとも10倍量の中性緩衝ホルマリン固定液を入れた平底容器にテープを入れ、包埋および切片作成まで4°Cでサンプルを保存します。固定後、組織をフラッシング直後にMetconで固定するため、組織量に対して少なくとも10倍量の70% ethanolを入れた平底容器に移します。デモンストレーションした通りに、腸管を3つの等しいサイズのセクションに切断します。次に、各セクションを15 by 15 cmのフィルターペーパーの上に並べて置き、すべてのセクションが分割されたら、スプリングボウシザーを使用してFOSS上のセクションを開きます。フィルターペーパーを、調製したばかりのMetconが入ったガラス皿に移し、室温で3〜24時間置きます。固定が終わったら、ピンセットで腸管片の端を一つずつつまみ、ピンセットに組織を巻き付けて個別のスイスロール状にします。ピンセットをわずかに開き、25ゲージの針を組織に通して、各ロールを固定します。次に、丸めた組織を、組織量の少なくとも10倍の量の中性緩衝定形液および固定液を含む平底の容器に入れ、組織のホールマウント乳酸可視化処理を行う前に、少なくとも1時間固定します。ミネラルオイルを混ぜた溶融パラフィンを15 cmのシャーレに注ぎます。その後、腸管を氷冷PBSで洗浄した直後に、組織を25 mLの氷冷Ex Cal固定液で洗浄します。固定後、腸管を3〜5等分に切断し、各切片を冷却したワックスプレートの上に配置します。切片の両端をピンで固定し、腸間膜のラインがプレートの上側にくるようにして、切片をわずかに伸展させます。余分な腸間膜は切り取り除いてください。次に、スプリングボウ剪刀を用いて腸管を縦方向に切開し、すべての部位のピン留めが完了した時点で、開いた状態のままピンで固定します。4°Cで少なくとも1時間置いた後、すべての組織が浸る十分な量のxal固定液をプレートに満たします。25 mLピペットまたはシリンジを使用して固定液を除去し、30 mLのPBSで組織を1回洗浄します。次に、切片を30 millilitersのDTTD統合溶液で覆い、室温でロッキングしながら30～60分間インキュベートします。インキュベーション終了後、脱水溶液を25 milliliterのピペットまたはシリンジで除去し、組織にさらに30 millilitersのPBSを注ぎます。その後、後方ピペットを使用して、洗浄後のPBSとともに粘液を除去します。PBSを30 millilitersのxalに交換し、室温・暗所にて、ロッキングプラットフォーム上で緩やかに撹拌しながら一晩染色し、翌朝に回収します。切片に青緑色の染色が見られる場合は、xalを30 millilitersのPBSに交換してください。3分間緩やかに撹拌した後、先ほど示した方法でスイスロール状に巻き、組織量に対して少なくとも10倍量の適切な固定液を入れた広口の平底容器に入れ、包埋および切片作成前の24時間以上、4 °Cで保存します。ROSA 26 R Laxy 条件付レポーターを用い、組み換え後の組織から抽出したDNAを用いて、小腸において誘導後3日で100%の組み換えが観察されました。組み換えアレルに対するqPCRでは、Vila creaseシステムにおける組み換えの増加は有意ではありませんでした。これは、パネト細胞における組み換えが観察されなかったためである可能性があります。laxyレポーターを用いたah creaseシステムにおいても、両システムともに誘導後3日で組み換え細胞の完全な消失が示されました。有糸分裂およびKクリプトの細胞高データは、ah H Creeシステムが、おそらく未結合の腸幹細胞による再構築によって回復可能であることを示唆していました。対照的に、villain Creeは上皮クリプト細胞を保持していたにもかかわらず、回復しませんでした。さらに、vi Cree Cantin Bを導入したマウスのクリプト細胞は非増殖性であり、腸幹細胞マーカーの発現も認められませんでした。EM 4。ah cre マウスの陰窩とは異なり、PTH細胞はVI Creeシステムにおいてのみ、Caden b 欠損後にアポトーシスを起こしました。習得すれば、この手法は約10分で完了できます。組織の分解を防ぐため、遅延を最小限に抑えることが重要です。このビデオを視聴することで、後続の解析に向けてマウスから腸管を摘出する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、マウス近位結腸ループまたはpcLoopセグメントを生成する外科的処置と、その後に蛍光マーカーをセグメントに注入して腸上皮透過性を研究する手順について説明します。...

マウス近位結腸ループモデルの生成:管腔内注射後の血清中の蛍光マーカーの検出により、近位結腸ループを生成し、腸の透過性を測定する外科的処置

腸の粘膜内層に沿って上皮細胞の正確な同定と位置が異なる細胞系譜を定義することが不可欠です。腸組織の適切な画像化は、最大解像度でのタンパク質発現パターンの同定のために重要です。本研究では、マウスの腸組織を処理するための最適な方法および条件を線引きすることを目指しています。...

免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック

透明な線虫の腸、「体内組織商工会議所「多細胞 tubulogenesis の中に apicobasal の膜と内腔の生合成単一セルおよび細胞内レベルでの勉強のためとして使用できます。このプロトコルでは、分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ、機能喪失遺伝的/RNAi...

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

腸内における文化は全体の陰窩からされ細胞特異的自己複製と分化の解析を許可しません。このプロトコルを記述する並べ替えられた幹 (Lgr5+) の再構成とその前の生化学的および遺伝性の変更と機能解析を可能にしながらオルガノイドを生じさせる (Paneth)...

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

調節不整合な腸上皮バリア機能および免疫応答は、生理学的モデルの欠如のために十分に調査されていない炎症性腸疾患の特徴である。ここでは、生体内での粘膜透過性および白血球の採用を研究するために、十分に血管化され、外装された腸セグメントを採用したマウス腸管ループモデルについて述べている。...

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

本プロトコルでは、腸内窩から直接マウスの一次上皮結腸単層を生成する方法を説明する。透過性フィルター上にコンフルエント単層を生成する実験的アプローチ、傷創傷治癒および生化学的研究のためのコンフルエント単層、免疫蛍光分析のためのまばらでコンフルエントな単層を提供する。...

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。...

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

消化管は、放射線治療によるがん治療の損傷に対して最も敏感な臓器の1つです。それは同時に、そのような侮辱に続く最高の再生能力の1つを持つ臓器系です。提示されたプロトコルは、腸上皮の再生能力を研究するための効率的な方法を記載している。...

電離放射線照射による腸管上皮再生

ここでは、レーザー誘導創傷時の腸の画像を取得する方法を紹介します。マウスの腸を多光子レーザーにさらすことによって、単一または複数の陰窩の喪失が局所的に誘発される。損傷領域を数か月にわたって繰り返しイメージングすることにより、腸の回復のリアルタイムのダイナミクスがキャプチャされます。...

腸のリモデリングを研究するためのレーザーアブレーションと生体内顕微鏡

3次元コロノイドの発生のためのマウス結腸陰窩の単離を詳述するプロトコルについて説明します。その後、確立されたコロノイドは、炎症性チャレンジを受ける前、または上皮単層を確立するように指示される前に、宿主上皮の細胞組成を反映するように最終分化され得る。...

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

学ぶマウス腸の解剖法とパネート細胞の役割。Cre-LOXマウスモデルを用いて腸上皮幹細胞の維持と再生メカニズムを解析する手法を解説。再生医療や消化器病学研究に応用可能です。

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル

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