条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコルのCre-LOXマウスモデル

この解剖手順の全体的な目標は、その後の特性評価技術のためにマウス腸を分離し、準備する方法を実証することです。この方法は、実験手順の後に腸幹細胞が腸に再増殖する能力を調査するために使用できます。この技術の主な利点は、それが任意の技術や任意の手順の後に、または遺伝子操作の後に使用できることです クレイロック技術を使用して 安楽死させた成体マウスを仰臥位に置き、毛皮を70%エタノールで濡らすことから始めます。

次に、はさみを使用して、正中線に沿って縦方向に腹腔を開き、鉗子で胃を固定します。次に、食道への接続を切断し、胃をそっと引っ張って虫垂までの小腸を切除します。その後、虫垂をそっと引っ張って、大腸を肛門まで取り除きます。

腸が分離されたら、虫垂の胃を取り出し、鈍い端のピペットチップを備えた注射器を使用して、洗い流した直後に腸をPBSで洗い流し、腸を近位、中央、遠位の3つの等しいサイズに切断します。次に、各切片を1センチメートルの小片に切り、組織の3〜5つの断片を2 x 2センチメートルの外科用テープの中央に置きます。ピラミッド型では、すべての組織が取り付けられたら、縦方向にピースの周りにテープをシールして丸太の山を作ります。

次に、組織の体積に対して少なくとも10倍の体積の中性、緩衝、フォーマル、固定剤を含む平底のレセプタクルにテープを置き、サンプルを摂氏4度で保存してから、埋め込みおよび切片化します。固定後、組織体積の70%エタノールの10倍以上の体積を含む平底レセプタクルに組織を移し、フラッシング直後にメトコンで組織を固定します。先ほど示したように、腸を3つの同じサイズのセクションに切ります。

次に、各セクションを15 x 15センチメートルの濾紙に並べて置き、すべてのセクションが分割されたら、スプリングボウハサミを使用してFOSSのセクションを開きます。固定終了時に、調製したばかりのメトコンを入れたガラス皿に濾紙を室温で3〜24時間移し、鉗子を使用して腸の各片の端を一度に1つずつピックアップし、鉗子の周りに組織を巻き付けて個々のスイスロールを形成します。鉗子をわずかに開き、組織を通して25ゲージの針を挿入して、各ロールを固定します。

次に、ロールした組織を、組織として少なくとも10倍の量の中性緩衝フォーミュラと固定剤を含む平底のレセプタクルに少なくとも1時間入れてから、組織のバースト全体を緩く視覚化するための処理を行います。鉱油を混ぜた溶かした生ワックスを15センチのシャーレに注ぎます。次に、腸を氷冷PBSで洗い流した直後に、25ミリリットルの氷冷excal固定剤で組織を洗い流します。

固定後、腸を3〜5等分し、冷却したワックスプレートの1つに各切片を置きます。プレートの上部にある腸間膜線でセクションがわずかに伸びるように、各端をピンで留めます。余分な腸間膜をトリミングします。

次に、スプリングボウハサミを使用して、すべてのセクションがピン留めされたときに開くときに、内臓を縦方向にピンで留めてカットします。摂氏4度で少なくとも1時間後に、すべての組織を覆うのに十分なxal固定剤でプレートを浸します。.25ミリリットルのピペットまたは注射器を使用して固定剤を取り出し、30ミリリットルのPBSで組織を一度洗浄します。

次に、切片を30ミリリットルのDTTD統一溶液で覆い、室温で30〜60分間ロッキングしながらインキュベーションします。インキュベーションの終わりに、25ミリリットルのピペットまたはシリンジで神格化溶液を取り除き、さらに30ミリリットルのPBSで組織を浸します。次に、洗浄後に後部ピペットを使用して、PBSで粘液を取り除きます。

PBSを30ミリリットルのxalと交換して、暗闇の中で室温で一晩染色し、翌朝、ロッキングプラットフォームで穏やかに攪拌します。切片に青緑色の汚れが生じた場合は、xalを30ミリリットルのPBSと交換します。3分間穏やかに攪拌した後、示したようにスイスロールを作り、4°Cの組織の体積の少なくとも10倍の適切な固定剤を含む広口の平底レセプタクルに組織を少なくとも24時間置いてから、包埋および切片化します。

ROSA 26 R Laxyコンディショナルレポーターを使用すると、組換えベビーベッドから抽出したDNAを使用して、小腸での誘導後3日で100%の組換えを観察できます。組換え対立遺伝子のQPCRは、VIクリース系内の組換えの有意でない増加を示しましたが、これはおそらく観察されなかったパネート細胞での組換えによるものでした。laxy reporterを使用したahクリースシステムを使用すると、どちらのシステムも導入後3日で組換え細胞が完全に失われることを示しました。

有糸分裂とK陰窩の細胞高さデータは、ah H Creeシステムがおそらく結合していない腸幹細胞による再増殖により回復する可能性があることを示しました。それとは対照的に、悪役のクリー族は、上皮の陰窩細胞を保持しているにもかかわらず、回復することができなかった。さらに、vi Cree Cantin B群れマウスの陰窩細胞は非増殖性であり、腸幹細胞マーカーの発現を欠いていました。

EMの4。同様に、ah creマウスの陰窩とは異なり、PTH細胞はCaden b欠失後にVI Cree系内でのみアポトーシスを受けました。一度習得すれば、このテクニックは約10分で完了することができます。

組織の劣化を防ぐために、遅延を最小限に抑えることが重要です。このビデオを見れば、マウスから腸を取り出して下流の分析を行う方法についてよく理解できるはずです。