可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

この手順の全体的な目的は、可変角エピ蛍光顕微鏡を用いて、植物細胞表面上の蛍光タグ付きタンパク質の移動を観察することです。本手法は、タンパク質が植物細胞表面でどのように機能するかなど、植物細胞生物学分野の進展に寄与します。この技術の主な利点は、蛍光タグ付きタンパク質のリアルタイムなダイナミクスを可視化できることです。手順を開始する前に、以下の点を確認してください。

メーカーの指示に従い、顕微鏡のレーザーセンタリングとフォーカスの校正を行います。次に、対物レンズのフリーライトパスを用いて、顕微鏡室の天井の中心を特定し、その位置に色付きのシールを貼って印を付けます。続いて、対物レンズで天井を照射し、照射領域を中心位置に移動させます。

次にレーザーに焦点を合わせ、レーザーの位置を天井の中心に微調整します。可変角度エピ蛍光顕微鏡（VAEM）による観察を成功させるには、レーザーのセンタリングとフォーカシングが非常に重要です。ユーザーは、実験を開始する前に顕微鏡メーカーの専門スタッフによるトレーニングを受ける必要があります。

顕微鏡の準備が整ったら、76 × 26 mmのガラススライドの中央に基底バッファーを30 µL滴下します。次に、解剖用ハサミを使用して、7日目の苗から子葉を切り出し、観察面を上にして基底バッファーの液滴上に浮かべます。続いて、18 × 18 mmのカバーガラスの中央に基底バッファーを30 µL加えます。

カバーガラスを被せ、それを裏返します。ピンセットでカバーガラスの端を持ち、表面張力によって液滴が落ちないように注意してください。バッファーがリードインの上に載るように、反対側の端をガラススライドの上に置きます。

次に、カバーガラスの端をスライドガラスに乗せたままにします。液滴がオレイン試料の真上にくるように位置を調整し、カバーガラスをゆっくりと下ろします。気泡が入っていないことを確認し、余分なバッファーをリントフリーティッシュで拭き取り、直ちに調製物を顕微鏡にセットしてください。

明視野照明を用いて、観察する細胞を選択します。次に、蛍光タンパク質が観察できることを確認し、エピ蛍光照明を用いて細胞表面にZ軸位置を設定します。VAEMを行うには、コントローラーボックスを使用してレーザービームの入射角を傾けます。

ライブ画像を注意深くモニタリングしながら、徐々に調整します。最初は画像がぼやけて見えますが、レーザー角度が増加するにつれてVAEM画像からぼやけが解消され、最終的に鮮明な画像が得られます。

ここで、レーザー角度の調整を停止します。次に、必要に応じて光学パラメータおよびイメージセンサーのパラメータを調整しながら、レーザー入射角を微調整して、より良好な画像を得てください。

次に、市販の顕微鏡ソフトウェアを用いて、マルチページTIFF画像ファイルとして動画を取得します。ここでは、STAモデル細胞の表面でGFP標識されたドットが点滅している様子が動画に示されています。Fijiを使用してGFP標識ドットの滞在時間を定量化するには、「File」メニューから「Open」を選択し、取得したマルチページTIFFファイルを開いてください。

直線選択ツールを使用して、関心領域にラインを配置します。次に、Image Stacks Dynamic Res Sliceプラグインを使用して、グラフ画像を生成します。ラインを移動させると、グラフ画像が動的に変化します。

「ファイル」メニューの「名前を付けて保存」から、画像をTIFF形式で保存します。次に、ノイズ除去を行うため、「プロセス」メニューの「フィルタ」から「ガウスぼかし」を選択し、クロノグラフ画像にガウスフィルタを適用します。シグマ半径のパラメータは、必要に応じて調整してください。

画像調整しきい値ツールを使用して、しきい値処理により信号領域をセグメント化し、「測定設定」メニューを開きます。次に、「測定設定」ウィンドウで「境界矩形」にチェックを入れ、可能な限り最小のピクセル数を選択します。その後、「解析」メニューから「粒子解析」を選択します。

注目しているドットの時間をY軸に対して測定し、表示結果を確認して、データ値を表示するためにマネージャーボックスに追加します。最後に、結果テーブルメニューの「ファイル」、「名前を付けて保存」を選択し、適切な解析ソフトウェアを使用してドット画像の持続時間のデータセットを処理します。ここでは、chmグラフ解析により測定された、8つのedinの12個の独立した娘細胞由来の185個のGFPパトロール1ドットの滞在時間を、グラフに示した通りに表示しています。

適合密度関数により、ほとんどのGFP patrol oneドットは、補助細胞に2秒から10秒間留まっており、ピークは約3.5秒であることが明らかになりました。このことは、補助細胞表面におけるプロトンポンプの迅速な開口放出とエンドサイトーシスを示唆しています。このビデオを視聴することで、可変角エピ蛍光顕微鏡を用いて、植物細胞表面におけるあらゆる種類のタンパク質ダイナミクスを可視化し、定量化する方法について十分な理解を得られるはずです。