December 12th, 2015
このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。
この手順の全体的な目標は、可変角度のエピ蛍光顕微鏡を使用して、植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質の動きを観察することです。この容器は、プレート細胞表面でタンパク質がどのように働くかなど、植物細胞生物学の分野における進歩に役立ちます。この手法の主な利点は、手順を開始する前に、蛍光攻撃タンパク質のリアルタイムダイナミクスを視覚化できることです。
顕微鏡のレーザーセンタリングとフォーカシングを、製造元の指示に従って校正します。次に、対物レンズの自由光路を使用して、顕微鏡室の天井の中心を特定し、色付きのシールで位置に印を付けます。次に、対物レンズで天井を照らし、照らされた領域を中央の位置に移動します。
次に、レーザーの焦点を合わせ、レーザーの位置を天井の中央に微調整します。レーザーのセンタリングとフォーカシングは、可変角度落射顕微鏡やVAEM観察を成功させるために非常に重要です。ユーザーは、実験を開始する前に、顕微鏡会社の専門スタッフによるトレーニングを受ける必要があります。
顕微鏡の準備ができたら、30マイクロリットルの基礎バッファーを76 x 26 mmのスライドガラスの中央に分注します。次に、解剖ハサミを使用して、7日齢の苗からコリードインを取り除き、観察面を上にしてコリードインを基底バッファードロップに浮かせます。次に、30 x 18 mmの中央に18マイクロリットルの基礎バッファーを追加します。
ガラスを覆い、カバーガラスを逆さまにします。やさしく表面張力が滴が落ちるのを防ぎ、片方の端にピンセットでカバーガラスを保持します。反対側の端をスライドガラスに置き、バッファーが共同リードインの上にくるようにします。
次に、カバーガラスの端をスライド上に保ちます。液滴の位置をオレインサンプルの真上にくるように調整し、カバーガラスを落とします。気泡がない場合は、糸くずの出ないティッシュを使用して余分なバッファーを拭き取り、すぐに調製物を顕微鏡に移します。
明視野照明を使用して、観察する細胞を選択します。次に、蛍光タンパク質が観察できることを確認し、エピ蛍光照明を使用して細胞表面のZ軸位置を設定します。VAEMを実行するには、コントローラーボックスを使用してレーザービームの入射角度を傾けます。
ライブ映像をじっくりと見ながら、徐々に。最初は、画像はぼやけて見えます。レーザー角度が大きくなると、VAEM画像のぼやけが少なくなり、最終的には鮮明な画像が得られます。
この時点で、レーザー角度の増加を停止します。これで大丈夫です。レーザーの入射角度を調整してより良い画像を取得し、必要に応じて光学センサーとイメージセンサーのパラメーターを調整します。
次に、市販の顕微鏡ソフトウェアを使用して、マルチページのTIFF画像ファイルとして動画を取得します。この動画は、STAモデルセルの表面で点滅するGFPラベル付きドットを示しています。フィジーを使用してGFPラベル付きDOT滞留時間を定量化するには、ファイルオープンメニューに移動し、取得した複数ページのチップファイルを開きます。
直線選択ツールを使用して、目的の側に線を配置します。次に、image stacks dynamic res slice プラグインを使用してグラフ画像を生成します。線が変化すると、グラフの画像も動的に変化します。
ファイルの下に画像をTIFFファイルとして保存し、TIFFとして保存します。次に、ノイズリダクションを実行するには、プロセスフィルターのガウスぼかしメニューに移動し、クロノグラフ画像にガウスフィルターを適用します。シグマ半径パラメータは、必要に応じて調整する必要があります。
イメージ調整しきい値ツールを使用して、しきい値によって信号領域をセグメント化し、解析セット測定メニューを開きます。次に、設定された測定ウィンドウで外接する四角形を確認し、可能な限り最小のピクセル数を選択します。次に、分析で粒子を分析メニュー。
Y軸に対する目的のドットの時間を測定し、表示結果を確認し、データ値を表示するためのマネージャーボックスに追加します。最後に、結果テーブルメニューでファイルを選択し、名前を付けて保存し、適切な分析ソフトウェアを使用してドット画像期間のデータセットを処理します。ここでは、chmグラフ解析により測定した第8エディンの12の独立した補助セルから1ドットの185人のGFPパトロールの滞留時間をグラフに示すように示しています。
適合密度関数により、GFPパトロール1ドットのほとんどが2〜10秒間、ピークが約3.5秒で補助セルに常駐していることが明らかになりました。これは、補助細胞表面上のプロトンポンプの迅速なエキソサイトーシスエンドサイトーシスを示唆しています。このビデオの作業を終えると、可変角度のエピ蛍光顕微鏡を使用して植物細胞表面のary型タンパク質ダイナミクスを視覚化し、定量化する方法を十分に理解できるはずです。
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このプロトコルは、可変角度エピ蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質の動態をモニタリングすることを示しています。この技術は、アラビドプシス・タリアナの気孔複合体の細胞皮質における膜輸送タンパク質であるGFP標識PATROL1の点滅する点を可視化します。
Variable-angle epifluorescence microscopy (VAEM) enables real-time, high-resolution imaging of protein dynamics at the plant cell surface, providing critical insights into membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for understanding protein localization and trafficking relevant to plant biotechnology and synthetic biology. Integrating VAEM-derived quantitative data strengthens target validation and informs translational research decisions across R&D portfolios.
VAEM imaging is positioned at the interface of early discovery and assay development, enabling hypothesis-driven interrogation of protein dynamics and supporting quantitative analytics for downstream translational research.