デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

この実験の全体的な目標は、病原体が感染環境に適応し、宿主に損傷を与える方法を明らかにするために、in vivoで病原体の遺伝子発現を正確に測定することです。この技術は、感染症の分野の研究者が、さまざまな組織タイプで複数の時点で実際の感染中に病原体遺伝子発現ダイナミクスを調査する道を開きました。この方法の主な利点は、感度が高く、再現性が高いことです。

この方法により、実際の感染から得られた微量の組織から病原体遺伝子の発現を定量化することが可能になります。試薬の調製を開始するには、2-メルカプトエタノールをバッファーRLTに添加し、よく混合します。フェノール-クロロホルムイソアミルアルコール溶液の25:24:1混合物を準備します。

M型均質化チューブにラベルを付け、氷の上で冷却します。2ミリリットルのスクリューキャップチューブにラベルを付け、各チューブに約300マイクロリットルのジルコニアビーズを追加します。組織解離器、ビーズビーター、50ミリリットルチューブと96ウェルプレート用のアダプター付き卓上遠心分離機、光度計など、次の機器を準備してください。

C.albicansに感染したマウスから分離した以前に凍結した腎臓を摂氏80度の冷凍庫から取り出し、氷の上に置きます。各腎臓に1.2ミリリットルの緩衝RLTを追加します。.次に、各腎臓をバッファーでM型ホモジナイズチューブにデカントします。

使用されるバッファー RLT の量は、経験的に決定されます。バッファーRLTが多すぎるとサンプル濃度が希薄になり、少なすぎるとホモジネートが非常に粘性が高くなり、取り扱いが非常に困難になります。次に、プリロードされたセッティングRNA2.01に組織解離器を用いて、腎臓をホモジナイズします。

その後、1000 x Gで1分間遠心分離します。各ホモジネートの600マイクロリットルをジルコニアビーズが入ったスクリューキャップチューブに移し、残りのホモジネートを氷上に保存します。各チューブに600マイクロリットルのフェノール-クロロホルムイソアミルアルコールを加え、蓋をしっかりと閉じ、ビーズビーターで摂氏4度で3分間ボルテックスします。

15, 000 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。水相を新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブに慎重に移し、等量の70%エタノールを加えます。次に、スピンカラムにロードし、8, 000 x G.With 700マイクロリットルのバッファーRWでスピンし、各スピンカラムを1回洗浄し、続いて500マイクロリットルのバッファーRPEで2回洗浄します。

カラムをドライコレクションチューブに移し、さらに1分間回転させて、残っている液体を取り除きます。最後に、50マイクロリットルの水を使用してRNAを溶出します。次に、外径216アニメーターの分光光度計を使用して、RNA濃度を測定します。

デジタルバーコードを使用して遺伝子発現プロファイリングを行うには、まずレポーターコードセットとキャプチャコードセットを氷上で解凍します。130 マイクロリットルのハイブリダイゼーション バッファーをレポーター コード セットに追加します。Invert to mix and spin down(反転してミックスしてスピンダウンします。

次に、12本の反応チューブのそれぞれに20マイクロリットルの混合物を加えます。次に、各チューブに10 μgの全組織RNAを加え、ピペッティングで混合します。感染モデル、接種材料のサイズ、および使用する病原体株に応じて、総RNA内の病原体RNAの割合は0〜2%から変動するため、それぞれに添加する必要のあるRNAの総量は経験的に最適化する必要があります。

次に、各チューブに 5 マイクロリットルのキャプチャ コード セットを追加します。チューブを裏返して混ぜ、すばやくスピンダウンします。次に、反応を摂氏65度のサーマルサイクラーで、加熱した蓋で約18時間インキュベー

20°Cからサンプルカートリッジを1つ取り出し、室温まで温めます。摂氏4度から2枚の試薬プレートを取り出し、670 x Gの卓上遠心分離機で2分間回転させます。次に、画面上のステップバイステップの指示に従って準備ステーションをセットアップし、高感度オプションを選択します。

次に、サーマルサイクラーから反応を取り出し、すぐにプレップステーションにロードします。3時間の高感度プログラムを実行した後、カートリッジを取り外し、透明なテープを使用してレーンをシールします。必要に応じて、カートリッジの底に鉱油を塗布します。

次に、カートリッジをデジタルアナライザーにロードします。画面のステップバイステップの指示に従ってデジタルアナライザーをセットアップし、高解像度スキャンオプションを選択します。スキャンプログラムを実行した後、結果をダウンロードするか、電子メールで受信して生データをメーカーのソフトウェアにインポートすることを選択します。

テキストプロトコルに従ってデータを分析します。このビデオで紹介されているプロトコルには、キャプチャプローブとレポートプローブの両方を使用して特異性を高め、宿主RNAからのノイズを低減するという独自の利点があります。ここに示すように、感染していない組織サンプルのバックグラウンド生カウントはすべて 10 未満でしたが、2 つの感染組織サンプルの生カウントはすべて 10 を超えていました。

2つの生物学的サンプルからの生のカウントは、R二乗値0.945と非常に良好な相関関係がありました。また、このプラットフォームは、自然な生物学的発現レベルを網羅するのに十分なダイナミックレンジを提供します。248の環境応答遺伝子を同定するプローブセットを用いて、病原体遺伝子発現の2つの段階を決定した。

初期の遺伝子発現応答は、接種サンプルと感染後12時間サンプルとでRNAレベルが大きく異なる遺伝子で構成されます。また、感染後12時間時点と48時間後のサンプルでRNAレベルが大きく異なる遺伝子を含む遅延遺伝子発現応答も発見されました。これらの結果は、C.albicansの遺伝子発現が哺乳類宿主の侵襲性感染中に動的に制御されることを示しています。

この方法は簡単で高速です。組織採取からデータ発現までの全手順が48時間未満で完了します。ハンズオン時間は12サンプルで約4時間です。

この方法は、in vivoで病原体の遺伝子発現を捕捉するために開発されましたが、宿主遺伝子の発現に答えるためにも同じことを使用できます。したがって、研究者は感染の両側から同時に有用な情報を得ることができます。