デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

この実験の全体的な目的は、病原体がどのように感染環境に適応し、宿主に損傷を与えるかを解明するために、生体内で病原子の遺伝子発現を正確に測定することです。この手法により、感染症分野の研究者は、様々な組織タイプおよび複数のタイムポイントにおける実際の感染中の病原子遺伝子発現ダイナミクスを探索することが可能になりました。この方法の主な利点は、感度が非常に高く、極めて再現性が高いことです。

この手法により、実際の感染によるごく微量の組織から病原体遺伝子の発現量を定量することが可能になります。まず試薬の調製として、RLTバッファーに2-Mercaptoethanolを加えて十分に混合します。次に、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール溶液を25:24:1の比率で調製します。

M型ホモジナイズチューブにラベルを貼り、氷上で冷却します。2 mLスクリューキャップチューブにラベルを貼り、各チューブにジルコニアビーズを約300 µL加えます。組織解離装置、ビーズミル、50 mLチューブおよび96ウェルプレート用アダプターを備えた卓上遠心機、フォトメーターを含む以下の器具を準備します。

C.albicansに感染させたマウスから採取し、 previously frozen（以前に凍結保存した）腎臓を-80°Cのフリーザーから取り出し、氷上に置きます。各腎臓に1.2 mLのバッファーRLTを加えます。その後、バッファーとともに各腎臓をMタイプホモジナイズチューブに移します。

使用するRLTバッファーの量は経験的に決定します。RLTバッファーが多すぎるとサンプルの濃度が希釈され、少なすぎるとホモジネートの粘性が非常に高くなり、扱いが極めて困難になります。次に、プリセット設定をRNA 2.01にした組織解離装置を用いて、腎臓をホモジナイズします。

次に、1000 x Gで1分間遠心分離します。各ホモジネートから600 microlitersをジルコニアビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、残りのホモジネートは氷上で保存します。各チューブに600 microlitersのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、蓋をしっかりと閉め、ビーズミルを用いて4 degrees celsiusで3分間ボルテックスします。

4 °Cで15,000 Gにて5分間遠心分離します。水相を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに慎重に移し、等量の70%エタノールを加えます。その後、スピンカラムにロードし、8,000 x Gで遠心分離します。700 µLのバッファーRWで各スピンカラムを1回洗浄し、続いて500 µLのバッファーRPEで2回洗浄します。

カラムを乾燥した回収チューブに移し、さらに1分間遠心分離して残存した液体を除去します。最後に、50 µLの水を用いてRNAを溶出させます。その後、分光光度計を用い、OD 260 nmでRNA濃度を測定します。

デジタルバーコーディングを用いて遺伝子発現プロファイリングを行うには、まずレポーターコードセットとキャプチャコードセットを氷上で融解させます。レポーターコードセットにハイブリダイゼーションバッファーを130 µL加えます。転倒混和し、スピンダウンします。

次に、混合液を20 µLずつ12本の反応チューブそれぞれに加えます。その後、各チューブに10 µgの全組織RNAを加え、ピペッティングにより混合します。感染モデル、接種量、および使用した病原体株によって、全RNA中の病原体RNAの割合は0～2%まで変動します。したがって、それぞれに添加すべきRNAの総量は、経験的に最適化する必要があります。

次に、各チューブに5 µLのキャプチャーコードセットを加えます。チューブを反転させて混合し、速やかに遠心して液を集めます。その後、加熱蓋を備えたサーマルサイクラーを用い、65 °Cで約18時間、反応液をインキュベートします。

サンプルカートリッジを1本20 °Cから取り出し、室温に戻します。試薬プレートを2枚4 °Cから取り出し、卓上遠心機を用いて670 x Gで2分間遠心分離します。次に、画面上のステップバイステップの手順に従って調製ステーションをセットアップし、高感度オプションを選択します。

その後、反応液をサーマルサイクラーから取り出し、直ちにプレップステーションにロードします。3時間の高感度プログラムを実行した後、カートリッジを取り出し、透明テープでレーンを密閉します。必要に応じて、カートリッジの底部にミネラルオイルを塗布してください。

次に、カートリッジをデジタルアナライザーにロードします。画面上のステップバイステップの指示に従ってデジタルアナライザーをセットアップし、高解像度スキャンオプションを選択します。スキャンプログラムを実行した後、結果をダウンロードするか、メールで受信することを選択し、生データをメーカーのソフトウェアにインポートします。

テキストプロトコルに従ってデータを解析します。このビデオで実演しているプロトコルの独自の利点は、キャプチャープローブとレポートプローブの両方を使用することで特異性を高め、ホストRNA由来のノイズを低減できる点にあります。ここに示すように、非感染組織サンプルの背景生カウント数はすべて10未満であったのに対し、2つの感染組織サンプルの生カウント数はすべて10を超えていました。

2つの生物学的サンプルから得られたリードカウントは、R2値が0.945と非常に良好な相関を示しました。また、このプラットフォームは、天然の生物学的発現レベルを網羅するのに十分なダイナミックレンジを備えています。248個の環境応答遺伝子を指定するプローブセットを用いて、病原体遺伝子発現の2つのフェーズを決定しました。

初期遺伝子発現応答には、接種時と感染12時間後のサンプル間でRNAレベルに有意な差がある遺伝子が含まれます。また、12時間後と感染48時間後のサンプル間でRNAレベルに有意な差がある遺伝子からなる、後期遺伝子発現応答も発見されました。これらの結果は、哺乳類宿主への侵襲性感染において、C.albicansの遺伝子発現が動的に調節されていることを示しています。

この手法は簡便かつ迅速です。組織採取からデータの提示までの全工程に要する時間は48時間未満です。12検体あたりの実作業時間は約4時間です。

本手法は生体内での病原体遺伝子発現を捕捉するために開発されましたが、ホストの遺伝子発現の解析にも同様に利用可能です。したがって、研究者は感染の双方の側面から有用な情報を同時に得ることができます。