自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断と予後に役立つバイオマーカーの発見を約束する重要な新しい分野です。ここでは、タンパク質抽出、再可溶化還元、アルキル化、酵素消化など、臨床プロテオミクスで使用されるいくつかの処理ステップを統合した新しいデジタルマイクロ流体工学またはDMF法について報告します。DMFは、電極アレイ上のサンプルタンパク質の離散的な微小液滴を使用し、室温で実行できるため、サンプルの並列自動分析が可能になります。

この方法論は、従来の方法よりも大幅に進歩しており、臨床プロテオミクスにおける有用な新しいツールとなる可能性を秘めています。こんにちは、トロント大学化学科および生体材料・生物医学工学研究所のエリン・ウィーラー研究室教授のスティーブ・シェです。こんにちは、私はトロント大学のホイーラー研究室のガブリエルです。

そして、私はビビアン・ルークで、同じくトロント大学のウェアラブル研究室に所属しています。エリン・ウィーラーです。私は幸運にも、スティーブ・メイスとビビアンと一緒に働くことができました。

本日は、デジタルマイクロ流体工学を用いたプロテオミクス処理の手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用してタンパク質と生物学的サンプルを研究しています。それでは始めましょう。

ピラニア溶液でガラス基板を洗浄することにより、ヒュームフードで手順を開始します。適切な保護を着用しながら、ピラニア溶液は30%の過酸化水素に対して3対1の濃硫酸で構成されています。したがって、それを使用するときは注意が必要です。

ガラス基板をピラニアで10分間インキュベートし、洗浄後、それらをすすぎ、脱イオンまたは脱水し、窒素ガスで基板を乾燥させます。基板を電子ビーム蒸着チャンバー内に置き、厚さ250ナノメートルのクロムを堆積させます。この厚さに達したら、チャンバーから基質を取り出し、イソプロパノールですすぎ、ホットプレートで摂氏115度で5分間乾燥させます。

乾燥した基材をヘキサメチルキシラジンまたはHMDSで30秒でスピンコーティングしてプライミングします。Shipley S 1811の写真で再び3000RPMスピンコード。同じパラメータを使用して抵抗します。

基板をホットプレート上で直接摂氏100分で事前に焼きます。次に、フォトマスクを介して紫外線またはUV照射を5秒間照射することにより、フォトレジストをパターン化します。次に、Shipley MF 3 21現像液でUV露光基板を開発します。

DIウォーターポストで基板をすすぎ、100°Cのホットプレートで直接1分間焼きます。基板を完全に覆うのに十分なクロムエッチングに基板を30秒間浸漬することにより、露出したクロムをエッチングします。

基板をDI水ですすぎ、Z 300 Tストリッパーに10分間浸漬します。残ったフォトレジストを除去します。脱イオン水ですすぎ、窒素ガスで乾燥させます。

この堆積に続いて、2〜5マイクロメートルのパラリンC.化学蒸着により基板上に絶縁ポリマーを50ナノメートルのテフロンAFを堆積させ、スピンコーティングによって表面を疎水性にします。植物神経FC 40で1重量あたり1%の重量を2000RPMで60秒間。基板上。

未通過の酸化インジウムスズ基板または ITO ガラス基板で繰り返して、トッププレートポストを作成します。両方の基板を 160°C のホットプレートで焼きます。10 分間でデジタルマイクロ流体デバイスをセットアップします。

メスでこすり落とすことにより、底面基板の接触パッドからポリマーコーティングを取り除きます。底面基板の露出パッドを40ピンコネクタ電源と結合し、ラボビューを実行しているコンピューターで接続します。dpadによって制御される信号を備えたリレーを含む自家製のコントロールボックスを使用します。

コンピュータ制御ボックスは、40ピンコネクタを介してデバイスへの18キロヘルツ信号あたり100ボルトRMSのアプリケーションに対するユーザー制御を容易にします。また、ファンクションジェネレーターとアンプの電源を入れます。底面基板の端に合計厚さ140マイクロメートルの両面テープを2枚配置してデバイスを組み立てます。

4マイクロリットルのDI水をリザーバーの1つにピペットで入れ、パターン化されていない酸化インジウムスズスライドをデバイスの上部に配置し、テフロンコーティング面を下に向けてデバイスを囲みます。アースコネクタをトッププレートランに取り付けます。ラボでは、フィードバック制御をキャリブレーションするためにラボビューで初期化プログラムを作成し、デバイスの実験準備が整いました。

このプロトコルでは、ウシ血清アルブミンまたはBSAをタンパク質サンプルとして使用して、デジタルマイクロ流体の設計と使用法を実証します。BSAは、100ミリモルトリスHCL pH 7.8、体積あたり0.08%onic F1 27重量のWBで作られたワーキングバッファーまたはWBで希釈されます。各サンプルと試薬溶液を1ミリリットル調製し、それが追加されるリザーバーを示します。

試薬の調製後、トッププレートを装置から取り外し、4マイクロリットルの溶液を割り当てられたリザーバーにピペットで入れます。リザーバーを満たした後、トッププレートをデバイスに交換します。社内のラボビュープログラムを使用して、次の手順を実行します。

コンピュータインターフェースにより、ユーザーはリザーバーから約600ナノリットルの液滴を分注し、電極アレイ上の液滴を操作できることを忘れないでください。まず、R 1からタンパク質を含むサンプルの液滴を分注し、R 2から沈殿剤の液滴を分注します。2つの液滴を結合し、結合した液滴を5分間インキュベートして、タンパク質が表面に沈殿するようにします。

上清を沈殿したタンパク質から廃棄物リザーバーに作動させます。R 3は、沈殿したタンパク質を洗浄するために、R 4から洗浄バッファーの3つの液滴を分注し、沈殿したタンパク質を横切って廃棄物リザーバーに駆動します。沈殿物を乾燥させ、R 5から再可溶化バッファーの液滴をタンパク質に分注します。

沈殿物が溶解するまで、バッファーを20分間インキュベートします。次に、R sixから還元剤の液滴を分注し、サンプル液滴と合流させます。結合した液滴を6つの電極に円形に作動させて混合します。

液滴を室温で1時間インキュベートします。R sevenからアルキル化剤の液滴を分注し、サンプル液滴と合流させた後、混合します。液滴を光から保護された室温で15分間インキュベートします。

最後に、R eightからトリプシンの液滴を分注し、サンプル液滴と合流させ、続いて混合します。液滴をホットプレート上のシャーレで摂氏37度で3時間インキュベートします。反応を終了するには、トッププレートを取り外し、ピペッティングで消化を急冷します。

6ミリリットルの2.5%トリクロロ酢酸を水に点として反応液滴に点付けます。急冷した反応生成物を精製するには、底板から直接サンプル液滴を吸い上げます。C 18ジップチップを使用して、製造元の指示に従って、必要に応じてサンプルを希釈し、質量分析で評価してサンプル中のタンパク質を同定することができます。

続いて、質量分析タンパク質は、確率スコアがEの1倍未満から負の3つに、99.9%信頼区間に相当し、配列カバレッジが少なくとも30%であることで同定されました。そこで、今日は、デジタルマイクロ流体を利用してタンパク質を自動的に抽出および処理する方法を紹介しました。この分析法は、タンパク質の単離および同定中のサンプル損失およびコンタミネーションに対する潜在的な解決策を提供します。

将来的には、この方法をイムノアッセイや細胞ベースのアッセイなど、他の生物学的アプリケーションに適用したいと考えています。この種の実験を行うとき、最も重要なことはそれを楽しむことを忘れないことです。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。