Name: 自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶデジタルマイクロ流体を用いた自動プロテオーム処理法。タンパク質抽出、還元、アルキル化、酵素消化を統合し、電極アレイ上の微小液滴で室温で並列自動分析を実現。臨床プロテオミクスにおけるバイオマーカー発見に有用な新技術です。

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我々は、自然科学と工学研究評議会（NSERC）と財政支援のためのカナダの癌協会に感謝します。 SCCS感謝NSERCとVNL感謝大学院奨学金のためのオンタリオ大学院奨学金（OGS）プログラム。 ARWは、カナダのリサーチチェアのためにCRCを感謝します。

パート1：デバイスの作製<ol><li>ピラニア溶液中で清浄なガラス基板（3:1濃硫酸：30％過酸化水素）。頻繁に攪拌しながら10分間ピラニア溶液中で基質にしておきます。 </li><li>脱イオン（DI）水で洗浄し、N 2ガ ​​スで基板を乾燥した後、クロム蒸着（250nmの厚さ）のための電子ビームチャンバー内の基板を置きます。 </li><li>クロムコーティングされた基質を脱水し、115℃で5分間ホットプレート上で焼いてからイソプロパノールで洗浄し、℃の</li><li>スピンコーティング（30秒、3000回転）により、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）で基板と素数を乾かします。シプリーS1811フォトレジストで再びスピンコート（同一のパラメータを使用して）。 </li><li>プリベークホットプレート（100℃、2分）で、基板と、パターンマスクを介して5秒間紫外線（UV）照射への暴露によってフォトレジスト。 </li><li>純水で3分間と洗浄のためのシプリーMF 321開発者のUVに曝露基板を開発する。 100℃のホットプレート上でポストベーク℃で1分間。 </li><li> 30秒のためにクロムエッチング液に浸漬することによって公開されているクロムエッチング残りのフォトレジストを除去するために10分間AZ300Tストリッパーに浸漬し、DI水ですすいでください。 DI水ですすぎ、N 2ガ ​​スで乾燥した。 </li><li>預金2から5μmのクロムをパターン化基板のベアリング上に化学蒸着によるパリレン- C（絶縁性ポリマー）。預金スピンコーティングによるテフロンAFの50 nmの（表面の疎水性を作るために）60秒2000rpmで解決策（フロリナートFC - 40の1％重量/重量）ホットプレート上でポストベーク（160℃、10分）。 </li><li>トッププレートを形成するために、コートのような上記非パターニング酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板上50nmのテフロンAF、。 </li><li>ポストベークのホットプレート上で両方の基板（160℃、10分）。 </li></ol>パート2：デバイスのセットアップおよび自動化<ol><li> &quot;二皿&quot;の構成で運用デジタルマイクロ流体デバイスでは、1滴がボトム基板（パターン化電極を有する）と上部基板（一般的にITOから形成された一つの連続した、透明電極、と）の間に配置されています。 </li><li>デバイスを設定するには、メスで優しくこすることにより底部基板のコンタクトパッドからのポリマーコーティングを取り除く。カップル40ピンコネクタ（図1a）と底部基板の露出パッドを。 </li><li>電源投入時にLabVIEW（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）、自作のコントロールボックス（ナショナルインスツルメンツのDAQPadをからの信号によって制御される高電圧リレーの配列を特色にする）、ファンクションジェネレータ、およびアンプを実行しているコンピュータ。コンピュータ/コントロールボックスは、100 V RMS / 40ピンコネクタを介してデバイスに18 kHzの信号のアプリケーションをユーザが制御を容易にします。 </li><li>底部基板のエッジに配置両面テープの2つ（140μmの総厚を）して、デバイスを組み立て、無地ITOスライド（トッププレート）で完了します。 </li><li>制御システムを初期化するには、フィードバック制御を校正するには、LabVIEWのキャリブレーションプログラムを（社内で作成）を実行します。 </li><li>適切な貯水池（以下のセクション3を参照）に試料と試薬をロードし、上部基板（テフロンコーティングされた面が下向き）で囲みます。上部基板にアースコネクタを取り付けます。 </li><li> LabVIEWでの作動のコードを（社内で作成）をロードし、液滴の作動を開始するプログラムを実行します。 </li></ol>パート3：サンプルと試薬の調製<ol><li> 100mMのTrisHCl（pH7.8）中および0.08％プルロニックF127 w / vの：作業バッファ（WB）を準備する</li><li>図1bに示すように、デバイス上でタンク1（R - 1）にWBとピペットのサンプルで分析するタンパク質（s）を、溶解する。 </li><li> R - 2に沈殿剤、20％トリクロロDI水で酸（TCA）、およびピペットを準備します。 </li><li> R - 4にバッファ、70/30クロロホルム/アセトニトリル（ACN）とピペットを洗う準備する。 </li><li> R - 5にresolubilizingバッファ、100 mM重炭酸アンモニウム（pH8.0）におよび0.08％プルロニックF127 W / V、およびピペットを準備します。 </li><li> R - 6にWBとピペットで10 mMで還元剤、 トリス （2 -カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を、溶解する。 </li><li> R - 7にWBとピペットで12 mMでアルキル化剤、ヨードアセトアミド（IAM）を、溶解する。 </li><li> R - 8への総タンパク質試料の濃度（上記、3.1参照）とピペットのTO1 / 5と同じ濃度でWBにトリプシンを溶解する。 </li></ol>パート4：デジタルマイクロ流体サンプル処理<ol><li>次の手順は、社内で書かれたLabVIEWコードによって自動的に実装されています。貯水池から分注された液滴の体積は、電極の大きさ（この場合は、液滴が〜600nLいる調剤）によって定義されます。 </li><li> R - 1からの蛋白質含有試料の液滴とR - 2（図2、フレーム1）から沈殿剤の液滴を分注する。 two滴をマージして組み合わせて液滴がPRの降水量で、その結果、5分間インキュベートすることができます表面にoteins（図2、フレーム2-3）。廃液溜め、R - 3（図2、フレーム4）に離れて沈殿したタンパク質から上清を作動させる。 </li><li> R - 4から洗浄緩衝液の三液滴を分注し、廃液溜めに沈殿したタンパク質を介してそれらを駆動する、R - 3（図2、フレーム5）。 </li><li>沈殿物を乾燥することができます、そしてR - 5からタンパク質へresolubilizingバッファーの液滴を分注する。沈殿物は（図2、フレーム6）に溶解するまで、バッファが20分間インキュベートすることができます。 </li><li> R - 6から還元剤の液滴を分注し、サンプル液滴にマージ。円形のパターンで6電極間にそれを作動させることによって結合された液滴を混ぜる。液滴は、加湿チャンバー（図3、フレーム1-2）で、室温で1時間インキュベートすることができます。 </li><li> （4.5のように）混合して、R - 7からアルキル化剤の液滴を分注し、サンプル液滴にマージ。光（図3、フレーム2-3）から保護され、液滴は、加湿チャンバー中、室温で15分間インキュベートすることができます。 </li><li> R - 8からトリプシンの液滴を分注し、と（4.5のように）混合し、サンプル液滴にマージ。液滴は、37℃で3時間インキュベートする° Cのホットプレート上で加湿チャンバー（図3、フレーム3-4）に許可する。 </li></ol>第5部：ポストプロセッシングサンプル調製<ol><li>水中では2.5％トリフルオロ酢酸0.6 mLを加えることによって上部基板とクエンチの消化反応を取り外します。 </li><li>製造元の指示に従ってC18 ZipTipsを（ミリポア、ビルリカ、MA）を使用して急冷反応生成物を精製する。 </li><li> 100mlの最終容量に純水で試料を精製希釈する。 </li></ol>第6部：質量分析<ol><li>タンデム型質量分析計に交尾ナノHPLC上で処理されたサンプルを評価。 HPLCシステムは、Eksigent Technologies社からのものであり、トラップカラム（3mmの直径。C18ビーズ、150μmのID × 2.5センチ）と逆相分離カラム（3μmの径。C18ビーズ、75μmの内径xが装備されてここで使用15cm）に。ここで使用される質量分析装置は、サーモフィッシャーサイエンティフィックからLTQです。 </li><li>水中に5％のアセトニトリルを構成する移動相で5μL/minでトラップカラムに2μLのサンプルをロードします。 20％アセトニトリルから25分以上80％アセトニトリルの直線勾配を用いて0.5μL/minで逆相カラムでサンプルを分離。さらに10分間80％アセトニトリルで実行を継続。 </li><li>タンデム質量分析法によってカラムをオフに溶出するバンドを分析する。仕事でここに報告された、溶離液はNewObjectiveからナノエレクトロスプレーエミッタ（10μmのIDにテーパー20μmのID）を介して質量分析計にサンプリングされます。 </li><li> SEQUESTなどのデータベース検索プログラムを使用してサンプル中のタンパク質を識別する。本研究では、我々はBioworks 3.01（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に組み込まSEQUESTのバージョンを使用し、同定されたタンパク質は、1.0E - 03未満の確率のスコア（99.9％信頼区間に相当）、および時のシーケンスカバレッジを持っていた少なくとも30％（図4）。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> 図1（a）の画像が自動化された液滴の作動のための40ピンコネクタにDMFのデバイスを交配。 （b）デバイスの回路図は、サンプルやプロテオミクス精密検査に必要な試薬のポジショニングを描いた。 <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> 映画から図2。フレームは、20％TCA（沈殿剤）と30分の70％のクロロホルム/アセトニトリル（溶液をリンス）の自動抽出とBSAの精製を描いた。フレーム6で、沈殿したタンパク質は100 mM重炭酸アンモニウムの液滴に再溶解されています。 <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> 図3。逐次還元、アルキル化、およびresolubilizedタンパク質の液滴の消化を示す映画のフレーム。この図では、試薬は、わかりやすくするために染料で着色され、実際には、試薬の色ではありません。 <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> デジタルマイクロフルイディクスで処理されたウシ血清アルブミンのサンプルの図4。MSのクロマトグラム。 25種類のペプチド（99.9％信頼区間）は44％の対応するシーケンスの範囲を同定した。

<ol><li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+Revolution%3A+A+New+Paradigm+for+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mat%22%5BJournal%5D)">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li>
<li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li>
</ol>

プロテオミクスにおける標準化されたサンプルの取り扱いと処理の欠如は、フィールドのための主要な制限です。さらに、従来のマクロスケールのサンプルの処理は、サンプルの損失や汚染につながることができる複数のコンテナおよびソリューションの移転を伴います。これらの問題に対する潜在的な解決策は、デジタルマイクロ流体1（DMF）に依存するサンプルの処理のための統合システムを形成することである。前作では、DMFは異種蛋白質含有溶液中の不要な汚染物を効率的に除去するために有用であることが示された2同様に、DMFは、統合に多段階の液相処理の統合（還元、アルキル化および消化）と互換であることが示されたデバイス。ここでは3、我々は、液相処理に続く沈殿によるタンパク質抽出のための自動化された液滴の制御を完全に統合されたシステムを実証している。我々はこのような方法が広く採用されている場合、プロテオミクスサンプルの処理に内在する人間のエラーの大部分はより良い再現性を分析、その結果、除去できると推測している。要するに、我々は条件が正確に世界のどの研究室に重複することができるようにDMFは、アプリケーション...

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断と予後に有用となるバイオマーカーの発見を約束し、重要な新しい学問分野として浮上している。臨床プロテオミクスの手法が広く異なりますが、一般的な特徴は、非常に不均質流体（すなわち血清、全血、等）と分析に先立って（ⅱ）大規模な生化学的な処理からのタンパク質の抽出（I）が必要です。ここで、我々は臨床プロテオミクスで使用されているいくつかの処理ステップを統合した新しいデジタルマイクロフルイディクス（DMF）ベースの方法を報告する。これは、タンパク質抽出、溶化、還元、アルキル化および酵素消化を含みます。デジタルマイクロ流体は、ナノリットルマイクロリットルサイズの液滴を開いて表面上で操作されているマイクロ流体処理技術です。液滴は、誘電体層によって被覆されている電極の配列の上に配置されています - 電位が液滴に印加されると、電荷は誘電体の両側に蓄積する。料金は、液滴の位置を制御するために使用できる静電ハンドルとして機能し、シリーズ内の電極のシーケンスをバイアスすることで、液滴は、ディスペンス移動、マージ、ミックス、そして表面上に分割させることができます。従って、DMFは急速な、シーケンシャル、多段階、小型自動生化学的アッセイを行うための自然なフィット感です。これは、従来の方法（手動ピペッティングまたはロボットに依存する）よりも大幅に進歩を表しており、臨床プロテオミクスに有用な新たなツールとなる可能性があります。 玉蜀黍J. Jebrail、ヴィヴィアンN.ルック、そしてスティーブCCシーズーは、この作品にも同様に貢献した。 セルジオLSフレイレの現在のアドレスは600サウス43rdストリートに位置するフィラデルフィア科学大学、フィラデルフィア、PA 19104にあります。

電界印加による電極のアレイに - デジタルマイクロ流体は離散液滴の操作（ML〜NL）によって特徴付けられる技術です。それは急速な、シーケンシャル、小型自動生化学的アッセイを行うために非常に適しています。ここで、我々はいくつかのプロテオミクス処理ステップを自動化することのできるプラットフォームを報告する。

臨床プロテオミクスは重要な新しい学問分野として台頭しており、早期診断に有用なバイオマーカーの発見を約束するものである。

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断や予後予測に有用なバイオマーカーの発見が期待される重要な新領域です。本稿では、タンパク質抽出、再溶解、還元、アルキル化、および酵素消化を含む、臨床プロテオミクスで用いられる複数の処理工程を統合した新しいデジタルマイクロフルイディクス（DMF）法について報告します。DMFは、電極アレイ上の不連続なタンパク質試料マイクロドロップレットを利用し、室温で動作させることができるため、試料の自動並列解析が可能です。この手法は従来の方法を大幅に改善したものであり、臨床プロテオミクスにおける有用な新しいツールとなる可能性があります。こんにちは、トロント大学化学科およびバイオマテリアル・バイオメディカル工学研究所のErin Wheeler教授の研究室に所属しているSteve Scheです。こんにちは、トロント大学のWheeler研究室のGabrielです。私はヴィヴィアン・ルークです。トロント大学の Wheeler 研究室に所属しています。私はエリン・ホイラーです。スティーブ・メイスとヴィヴィアンと一緒に研究できることを幸運に思っています。本日は、デジタルマイクロフルイディクスを用いたプロテオーム解析の処理手順をご紹介します。当研究室では、タンパク質や生物学的試料の研究にこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。ドラフトチャンバー内で、ピラニア溶液を用いてガラス基板を洗浄し、手順を開始します。適切な保護具を着用してください。ピラニア溶液は、濃硫酸と30%過酸化水素を3:1の割合で混合して調製するため、取り扱いには十分注意してください。ガラス基板をピラニア溶液に10分間浸漬し、洗浄後、脱イオン水でリンスし、窒素ガスで乾燥させます。基板を電子ビーム蒸着装置に入れ、クロムを250 nanometersの厚さに堆積させます。この厚さに達したら基板を装置から取り出し、イソプロパノールでリンスした後、ホットプレートを用いて115 degrees Celsiusで5分間乾燥させます。ヘキサメチルジシラザン（HMDS）を用いて、30秒間のスピンコートで乾燥させた基材をプライミングします。同様のパラメータを用い、Shipley S 1811フォトレジストで3000 RPMにて再度スピンコートします。基板をホットプレート上で100 °Cで数分間プリベークします。次に、フォトマスクを用いて、5秒間の紫外線（UV）照射によりフォトレジストをパターニングします。続いて、UV照射した基板をShipley MF 3 21現像液に浸し、3分間現像します。基板をDIウォーターで洗浄します。ホットプレートを用いて100 °Cで1分間直接ベークします。基板が完全に浸る程度のクロムエッチング液に30秒間浸し、露出したクロムをエッチングします。基材をDIウォーターで洗浄し、基材が完全に浸かる十分な量のZ 300 Tストリッパーに10分間浸します。これにより、残存しているフォトレジストを除去します。DIウォーターで洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。この堆積に続き、化学気相成長法を用いて2〜5 µmのParaline C絶縁ポリマーを基板上に堆積させます。次に、溶液のスピンコーティングにより、表面を疎水性にするため50 nmのTeflon AFを堆積させます。 fluorinert FC 40を用いた1% w/w溶液を、2000 RPMで60秒間、基板上に塗布します。未処理の酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板を用いて、同様の手順でトッププレートを製作します。デジタルマイクロ流体デバイスを構築するため、両方の基板をホットプレート上で160 °Cで10分間加熱してください。メスを用いて、下層基板のコンタクトパッドからポリマーコーティングを掻き取って除去します。下層基板の露出したパッドを40ピンコネクタで接続し、LabVIEWを実行しているコンピュータの電源を入れます。ここでは、dpadで制御される信号を備えたリレーを搭載した自作のコントロールボックスを使用します。コンピュータ制御ボックスにより、40ピンコネクタを介して18 kHzの信号に対し100 V RMSをデバイスに印加する操作が可能になります。あわせて、関数発生器とアンプの電源を入れます。底面基板のエッジに、合計厚さ140 µmの両面テープ2片を配置してデバイスを組み立てます。4 µLの脱イオン水をリザーバーの1つにピペットで注入し、パターンのない酸化インジウムスズ（ITO）スライドのテフロンコート面を下にしてデバイスの上に配置して密閉します。トッププレートに接地コネクタを取り付けます。LabVIEWで作成した初期化プログラムを実行してフィードバック制御をキャリブレーションすれば、デバイスは実験に使用可能な状態になります。本プロトコルでは、デジタルマイクロフルイディクスの設計と使用法を実証するため、タンパク質サンプルとしてウシ血清アルブミン（BSA）を使用します。BSAは、100 mM Tris-HCl (pH 7.8) に 0.08% (w/v) のonic F1 27 を加えたワーキングバッファー（WB）で希釈します。各サンプルおよび試薬溶液を 1 mL ずつ調製し、それを注入するリザーバーを明記しておきます。試薬の調製後、デバイスからトッププレートを取り外し、指定されたリザーバーに溶液を4 µLずつピペットで分注します。リザーバーへの充填後、トッププレートをデバイスに元に戻します。自作のLabVIEWプログラムを使用して、以下の手順を実行してください。コンピューターインターフェースを使用して、リザーバーから約600 nanoliterの液滴を分注し、電極アレイ上で液滴を操作できることを念頭に置いてください。まず、R1からタンパク質を含む試料の液滴を、R2から沈殿剤の液滴をそれぞれ分注します。2つの液滴を融合させ、タンパク質が表面に沈殿するように、混合液滴を5分間インキュベートします。上清を沈殿したタンパク質から遠ざけるように操作し、廃液リザーバーへ移動させます。次に、沈殿したタンパク質を洗浄するため、R fourから洗浄バッファーを3滴分 dispense し、沈殿したタンパク質の上を通過させて廃液リザーバーへと流します。沈殿物を乾燥させた後、R fiveから再溶解バッファーを1滴、タンパク質の上に dispense します。沈殿物が溶解するまで、バッファーを20分間インキュベートします。次に、R6から還元剤を1滴分分注し、サンプル滴と混合させます。結合した滴を6つの電極上で円状に動作させ、混合してください。液滴を室温で1時間インキュベートします。R7からアルキル化剤の液滴を分注し、サンプル液滴と合流させて混合します。その後、遮光した状態で室温で15分間インキュベートします。最後に、R8からトリプシンを1滴分分注し、サンプル液滴と合流させて混合します。ホットプレート上のペトリ皿内で、37°Cで3時間インキュベートします。反応を終了させるため、トッププレートを取り除き、ピペッティングにより消化反応を停止させます。2.5%トリクロロ酢酸水溶液を0.6 mL、反応液ドロップレットに滴下します。クエンチされた反応生成物を、ボトムプレートからサンプルドロップレットを直接サイフォンで吸い上げることで精製します。C 18 ZipTipを製造元の指示に従って使用し、必要に応じてサンプルを希釈し、質量分析によって評価することで、本システムを用いたサンプル中のタンパク質の同定が可能です。続いて質量分析を行い、1×10⁻³未満の確率スコア（99.9%の信頼区間に相当）および30%以上のシーケンスカバレッジでタンパク質を同定しました。したがって、DMFは自動化されたプロテオミクス試料処理において非常に有用な手法です。本日は、タンパク質の抽出および処理を自動的に行うためにデジタルマイクロフルイディクスをどのように活用するかについて説明しました。この手法は、タンパク質の単離および同定における試料の損失や汚染に対する潜在的な解決策となります。将来的には、この方法をイムノアッセイや細胞ベースのアッセイを含む、他の生物学的応用に適用したいと考えています。この種の実験を行う際に最も重要なことは、楽しむことを忘れないことです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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Research

JoVE Journal

Biology

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