自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

臨床プロテオミクスは、疾患の早期診断や予後の判定に有用なバイオマーカーの発見が期待される重要な新分野です。本稿では、タンパク質の抽出、再溶解、還元、アルキル化、および酵素消化を含む、臨床プロテオミクスで用いられる複数の処理工程を統合した新しいデジタルマイクロフルイディクス（DMF）法について報告します。DMFは、電極アレイ上の不連続な微小液滴としてサンプルタンパク質を扱い、室温で動作させることができるため、サンプルの自動的な並列解析が可能です。

本手法は従来法を大幅に改善したものであり、臨床プロテオミクスにおける有用な新しいツールとなる可能性があります。こんにちは、トロント大学化学科および生体材料・生体医学工学研究所のErin Wheeler教授の研究室のSteve Scheです。こんにちは、トロント大学Wheeler研究室のGabrielです。

私はトロント大学のWheeler研究室のVivian Lukeです。そして私はErin Wheelerです。Steve Mace、そしてVivianと一緒に研究できていることを幸運に思います。

本日は、デジタルマイクロフルイディクスを用いたプロテオミクス処理の手順をご紹介します。当研究室では、タンパク質や生物学的試料の研究にこの手順を用いています。それでは始めましょう。

ドラフトチャンバー内で、ピラニア溶液を用いてガラス基板を洗浄し、手順を開始します。適切な保護具を着用してください。ピラニア溶液は、濃硫酸と30%過酸化水素を3:1の比率で混合して調製するため、取り扱いには十分な注意が必要です。

ガラス基板をピラニア溶液で10分間インキュベートし、洗浄後、脱イオン水でリンスして窒素ガスで乾燥させます。基板を電子ビーム蒸着装置に入れ、クロムを厚さ250 nanometersで蒸着します。この厚さに達した後、基板を装置から取り出してイソプロパノールでリンスし、ホットプレートを用いて115 degrees Celsiusで5分間乾燥させます。

乾燥させた基板にヘキサメチルジシラザン（HMDS）をスピンコーティングし、30秒間プライミングします。同様のパラメータを用いて、Shipley S 1811フォトレジストを3000 RPMで再度スピンコートします。

基板をホットプレート上で100 °Cで数分間プリベークします。次に、フォトマスクを用いて紫外（UV）照射を5秒間行い、フォトレジストをパターニングします。続いて、基板が十分に浸かる量のShipley MF 3 21現像液中で、UV露光した基板を3分間現像します。

基板を脱イオン水でリンスします。その後、ホットプレート上で100 °Cで1分間直接ベークします。基板が完全に浸かる程度のクロムエッチング液に30秒間浸し、露出したクロムをエッチングします。

基板をDI水で洗浄し、基板が完全に浸かる量のZ 300 Tストリッパーに10分間浸します。これにより、残ったフォトレジストを除去します。その後、DI水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。

この堆積の後、化学気相成長法により2〜5 µmの絶縁ポリマーであるParaline Cを基板上に堆積させます。次に、Florinert FC 40中の1 wt%溶液を2000 RPMで60秒間スピンコートし、50 nmのTeflon AFを基板上に堆積させて表面を疎水化します。

未処理の酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板を用いて同様の操作を行い、上部プレートを作成します。デジタルマイクロ流体デバイスを構成するため、両方の基板をホットプレートにて160 °Cで10分間加熱します。

メスで掻き取ることで、ボトム基板のコンタクトパッドからポリマーコーティングを除去します。ボトム基板の露出したパッドを40ピンコネクタで接続し、LabVIEWが動作しているコンピュータの電源を入れます。ここでは、dpadで制御される信号を備えたリレーを含む自作のコントロールボックスを使用します。

コンピュータ制御ボックスを使用することで、40ピンコネクタを介して18 kHzあたり100 V RMSの信号をデバイスに印加するためのユーザー制御が可能になります。また、ファンクションジェネレータとアンプの電源を入れます。合計厚さが140 µmの両面テープ2片を底部基板の端に配置し、デバイスを組み立てます。

4 µLの超純水をリザーバーの1つにピペットで分注し、パターンのない酸化インジウムスズ（ITO）スライドのテフロンコーティング面を下にしてデバイスの上に配置して密閉します。トッププレートの端子に接地コネクタを取り付けます。LabVIEWで作成した初期化プログラムを実行してフィードバック制御を校正すれば、デバイスは実験に使用可能な状態になります。

本プロトコルでは、デジタルマイクロフルイディクスの設計と使用法を実演するため、タンパク質サンプルとしてウシ血清アルブミン（BSA）を使用します。BSAは、100 millimolar tris HCL pH 7.8に0.08%onic F1 27 weight per volumeを含むワーキングバッファー（WB）で希釈します。各サンプルおよび試薬溶液を1 milliliterずつ調製し、それを注入するリザーバーを指定してください。

試薬の調製後、デバイスからトッププレートを取り外し、指定されたリザーバーに溶液を 4 µL ピペッティングします。リザーバーへの充填が完了したら、デバイスにトッププレートを戻します。自社製の LabVIEW プログラムを使用して、以下の手順を実行してください。

コンピュータインターフェースを使用すると、リザーバーから約600 nanoliterの液滴を分注し、電極アレイ上で液滴を操作できます。まず、R1からタンパク質を含むサンプルの液滴を、R2から沈殿剤の液滴を分注します。2つの液滴を融合させ、タンパク質が表面に沈殿するように、結合した液滴を5分間インキュベートします。

上澄み液を沈殿させたタンパク質から遠ざけるように動かし、廃棄リザーバーへ移動させます。次に、沈殿したタンパク質を洗浄するため、R 4から洗浄バッファーを3滴分 dispense し、それを沈殿したタンパク質の上を通らせて廃棄リザーバーへと流し込みます。沈殿物を乾燥させた後、R 5から再溶解バッファーを1滴分タンパク質の上に dispense します。

沈殿物が溶解するまで、バッファーを20分間インキュベートします。次に、R6から還元剤を1ドロップ分分注し、試料ドロップと融合させます。融合したドロップを6つの電極間で円を描くように動作させ、混合します。

液滴を室温で1時間インキュベートします。R7からアルキル化剤の液滴を分注してサンプル液滴と統合させ、混合します。その後、遮光条件下で室温にて15分間インキュベートします。

最後に、R 8からトリプシンの液滴を分注し、サンプル液滴と合わせて混合します。ホットプレート上のペトリ皿に入れ、37 °Cで3時間インキュベートします。反応を停止させるには、上部プレートを取り除き、ピペッティングによって消化をクエンチ（停止）させます。

2.5%トリクロロ酢酸水溶液0.6 mLを反応液滴に滴下します。クエンチされた反応生成物を、ボトムプレートからサンプル液滴を直接サイフォンで吸い上げることで精製します。メーカーの指示に従いC 18 zip tipを用いることで、サンプルを必要に応じて希釈し、質量分析によって本システムにおけるサンプル中のタンパク質を同定することが可能です。

続いて質量分析を行い、1 × 10⁻³未満の確率スコア（99.9%の信頼区間に相当）および30%以上の配列カバー率に基づきタンパク質を同定しました。したがって、DMFは自動化されたプロテオミクス試料処理において非常に有用な手法です。本日は、デジタルマイクロ流体を用いてタンパク質を自動的に抽出および処理する方法について説明しました。この手法は、タンパク質の単離および同定における試料の損失や汚染に対する潜在的な解決策となります。

将来的には、この手法をイムノアッセイや細胞ベースのアッセイを含む、他の生物学的アプリケーションに応用したいと考えています。この種の実験を行う際に最も重要なことは、楽しむことを忘れないことです。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。