HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

この手順の全体的な目的は、HIVバイロトキシンであるtatへの長期曝露後における皮質毛細血管ネットワークの変化を定量化することです。この手法は、HIV関連神経認知障害の病態に関与していると考えられる皮質毛細血管形態の主要な変化を調べるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複数の毛細血管形態パラメータを生理学的に正確に定量化できることです。

この手法は、HIVに関連する神経認知機能障害の病態解明に有用であるだけでなく、アルツハイマー病など血管変化を伴う他の疾患にも適用可能です。まず、麻酔をかけたマウスの眼に人工涙液ゲルを塗布することから手順を開始します。

次に、バリカンを用いて頭部の除毛を行います。その後、ポビドンヨード溶液を塗布して頭皮を滅菌し、乾燥させます。光学顕微鏡下で動物の頭皮を除去し、頂骨、前頭骨後部、およびブレグマを完全に露出させます。

膜を乾燥させて除去しやすくするため、10%塩化鉄溶液を少 amount 少量、頭蓋骨に塗布します。続いて、ピンセットで頭蓋骨を軽く掻き出すようにして、乾燥した膜を取り除きます。その後、ヘッドプレートウィンドウの周囲に接着剤を薄く塗布します。

マウスの頭蓋骨にヘッドプレートをそっと押し当て、関心領域がウィンドウの中央にくるように固定します。その後、ヘッドプレートに歯科用セメントを1滴滴下し、接着剤を重合させます。次に、ヘッドプレートのウィンドウの縁に沿って接着剤を薄く塗り、生理食塩水を保持するためのリザーバーを作成します。

接着剤が乾燥したら、ヘッドプレートをマウス用ヘッドプレートハーネスにねじ込みます。マイクロタープドリルに装着したドリルビットを用い、回転数を6,000 rpmに設定して、ヘッドプレートの窓から接着剤を取り除きます。マウスの頭蓋骨の過熱を防ぐため、10〜15秒ごとに停止させてください。

その後、新しいドリルビットを使用し、4,000 rpmに設定したマイクロタープドリルで頭蓋骨を薄くし始めます。下方向に直接圧力をかけず、ドリルを頭蓋骨上でゆっくりと動かしてください。頭蓋骨が完全に薄くなったら、マウスをホルダーから外し、仰向けにしてください。

両後肢を優しくテープで固定し、大腿内側を明確に露出させます。次に、両大腿内側の除毛を行い、ポビドンヨードで大腿部を覆って手術部位を消毒します。続いて、大腿静脈および大腿動脈の上の、右大腿内側の皮膚を慎重に除去します。

手術部位に0.9%生理食塩水を約3〜5滴滴下します。次に、大腿神経血管束を鈍的に剥離し、大腿静脈を大腿動脈から分離します。その後、大腿動脈の下に、約1cmの間隔で3cmの手術用縫合糸を2本配置します。

上部の縫合糸を時計回りにねじって血管止血帯を作り、カテーテル挿入中の過剰な出血を防ぎます。続いて、スプリングシザーを用いて大腿動脈に小さな切開を加え、ここにマウスの生理学的パラメータをモニタリングするためのカテーテルを挿入します。この手順では、マウスの左大腿内側の皮膚を除去します。

次に、大腿静脈を確認します。1 mLシリンジと30G針を用いて、蛍光染料溶液を130 µL吸い取ります。その後、100 µLの染料を大腿静脈にゆっくりと注入します。

針を抜いた後、注射部位を優しく一定の強さで圧迫して止血し、染料が循環するまで5分間待ちます。その後、手術部位を縫合して閉じます。マウスを慎重に腹向きにひっくり返し、マウス用ヘッドプレートハーネスに固定します。

in vivo 2光子イメージングを行うため、手術器具を2光子顕微鏡へ移動させ、動物の麻酔レベルを維持していることを確認します。次に、ヘッドプレートのリザーバーに少量の0.9% 生理食塩水を注入し、顕微鏡対物レンズを下げて生理食塩水に接触させます。その後、明視野観察用対物レンズを使用して、目的の領域を特定します。

その後、二光子イメージングを開始します。ビュースクリーン上で毛細血管床を特定し、光学ズームを用いてこの領域を拡大します。二光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の画像を取得します。

ex vivoでの2光子イメージングを行うために、安楽死させたマウスの頭皮を、頭頂骨から前頭骨にかけて切開します。人差し指と親指で皮膚を頭蓋骨の両側に固定し、極細剪刀を正中線上の頭頂骨の下に配置し、ブレグマ点から約3 mm後まで矢状縫合に沿って頭蓋骨を切断します。次に、頭蓋骨を脳から分離し、ピンセットを用いて脳表面から髄膜を慎重に除去します。

ピンセットを脳の下にそっと滑り込ませ、頭蓋骨から脳を切り離します。その後、マウス専用の脳マトリックスに脳を配置し、ACSFを滴下して洗浄します。次に、1 mm厚の脳冠状断切片を採取します。

脳切片の最も前方の部分を上に向けて、ACSFを含む凹面ガラススライド上に置きます。次に、ガラスカバーガラスで脳切片をそっと覆います。スライドを顕微鏡ステージに移し、カバーガラス上に少量の0.9% salineを滴下します。

顕微鏡対物レンズを saline に接触するまで下げます。次に、明視野対物レンズを用いて脳の中心線を確認します。その後、2光子イメージングを開始し、25x 対物レンズを用いて再び中心線を確認します。

冠状断面の皮質表面にある正中裂を探して、これを達成します。次に、イメージングスクリーンの右端を正中線に合わせ、ビューアースクリーンを外側へ3フレーム分移動させます。ビューアースクリーン上で毛細血管がわずかに見え始める深さを特定してください。

次に、フォーカス面をさらに20 µm下げて、z-stackの上端を決定します。画像厚を1 µmに設定します。ビュースクリーンを100 µm下げ、画素の飽和度が1%未満になるようにレーザー出力を調整します。

最後に、zスタックを取得します。この図では、脳スライスの調製後、正中線から約1.5 mmの位置にイメージング領域を設定しています。100 µmのzスタックを作成することで、Amira分析ソフトウェアでの解析に使用する3次元画像が得られます。

次に、毛細血管の始点と終点、または毛細血管が分枝している箇所にノードを配置することで、毛細血管ネットワークを手動でトレースします。これにより、完全にスケルトン化された画像が作成され、そこから形態学的パラメータが自動的に抽出されます。マウス脳切片の2光子系ex vivoイメージングを用いることで、毛細血管のノード数、セグメント数、平均セグメント長、および総セグメント長を抽出することができます。

ここでは、in vivoイメージングによって毛細血管ネットワークの二次元画像を作成し、そこから毛細血管径を抽出します。そして、ex vivoイメージングから得られた毛細血管径と総セグメント長を用いて、総毛細血管容積を算出します。この手順に習熟し、適切に実施すれば、3時間半で完了させることができます。本手順の実施にあたっては、イソフルランが皮質毛細血管の血管拡張を引き起こし、データを歪ませる可能性があるため、一定レベルの麻酔状態を維持しながら迅速に操作することが重要です。

この手順を通じて、赤血球速度や赤血球フラックスなどの他の毛細血管パラメータを得ることができ、これによりHIV関連神経認知障害やその他の神経変性疾患に見られる病理学的変化について、より深い理解を得ることが可能です。実験の成功をお祈りします。