Name: HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶ二光子顕微鏡を用いた脳血管アーキテクチャの定量化法。HIV virotoxin tatへの長期曝露後のマウス大脳皮質毛細血管ネットワークの変化を測定し、HIV関連神経認知症の病態理解に貢献します。

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>jove_content<このプロトコルの完了を通じて技術的なアドバイスを提供してくださったロチェスター大学マルチフォトンコアのマリア・ジェプソン博士、パイヴィ・ジョーダン博士、リンダ・キャラハン博士に感謝します。また、統計に関する専門的なアドバイスを提供してくださったChangyong Feng博士と、この論文で使用したヘッドプレートのデザインについて、ロチェスター大学医療センターのMaiken Nedergaard博士にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金T32GM007356とR01DA026325によって部分的に支援されました。ロチェスター大学エイズ研究センター助成金P30AI078498(NIH)による。

動物資源上ロチェスター大学の大学の委員会は、本論文で実行されたすべての手順を承認しました。 1.手術前の準備（およびマウス） <ol><li>必要なすべての機器と手術領域を準備します。事前に70％エタノールを使用して、手順の間に使用されるすべてのツールを滅菌します。必要に応じて、ツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器やオートクレーブを使用します。 </li><li>イソフルラン気化器に接続されたイソフルラン誘導チャンバー内にマウスを置きます。 1リットル/分の速度で4％イソフルランレベルを設定します。 注意：アストロサイト固有のグリア線維性タンパク質（GFAP）プロモーター（HIVのTat-Tgマウス）で駆動ドキシサイクリン（DOX）誘導性HIV-1 Tatの導入遺伝子とここで報告された実験では、マウスで10 HIVの影響を調べるために使用されました以前に7,10に記載されているように -1、脳血管構造の神経炎症を誘導しました。 </li><li>静かにマウスを観察するために、誘導室にチップ＆＃39; sの立ち直り反射。立ち直り反射が抑制された後、2％にイソフルランレベルを設定し、外科的なベンチでノーズコーンに誘導室からの空気流の方向を変えます。 </li><li>すぐに水注入された加熱パッドに誘導室からマウスを移動します。ノーズコーンを介してイソフルラン（1.5から2パーセント）を適用し続けます。呼吸数（RR）モニタリングによって評価個々のマウスの許容範囲に応じて麻酔を調整します。 注：RRのうつ病は脳の血流および血管径の評価を変更するガスの生理学的パラメータを乱すことができます。毎分55〜65呼吸の間RRを維持しようとしました。心拍数（HR）は、麻酔の深さを評価に使用することができます。血管径の生理学的変化を防止するために、毎分300〜450拍の間で人事を保ちます。一般的に、麻酔を与えられたマウスでは1リットル/分で1.5から2.0パーセントのイソフルランの間で十分です。 </li><li>さらに、麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを実行します。マウスは、COMMが応答しない場合外科手術レンス。 </li></ol>薄頭蓋骨頭蓋窓の調製<ol><li>マウスの目に人工涙ゲルを適用します。完全にハサミや電気かみそりを使用して、マウスの頭皮から髪を削除します。 </li><li>ポビドンヨード溶液を適用することによって頭皮の殺菌。乾燥させます。その後、光学顕微鏡下で、完全にマーキング頭頂骨、尾正面の骨、およびブレグマを露出させ、マウスの頭皮から皮膚を除去。 </li><li>簡単に除去するための膜を乾燥させるために頭蓋骨に10％塩化第二鉄溶液の少量を適用します。静かに頭蓋骨をこすることによって＃45分の5鉗子で乾燥した膜を除去します。 </li><li>ヘッドプレートウィンドウの周りに接着剤の薄層を適用します。静かにウィンドウの中央に関心領域を保ち、マウスの頭蓋骨に対してヘッドプレートを押してください。接着剤を重合するヘッドプレートに歯科用セメントの低下を適用します。 </li><li>薄く塗りますヘッドプレートウィンドウの端に沿って接着剤の生理食塩水を保持するリザーバを作成することができます。接着剤が乾燥した後、マウスのヘッドプレートハーネスにヘッドプレートをネジ止めします。 注：この手順で使用したマウスのヘッドプレートハーネスは、金属ベースと二つの金属柱を持つ構造体です。各列の1春と1蝶ナットがあります。ヘッドプレートは、バネの上に配置され、ヘッドが水平であり、移動しなくなるまで蝶ナットが締め付けられます。 </li><li> 6,000 rpmで設定microtorqueドリルに取り付けられたドリルビットを使用してヘッドプレートウィンドウから任意の接着剤を除去します。血管への構造的な損傷を与えることができ、マウスの頭蓋の過熱を防止するために、すべての10〜15秒を停止します。 <ol><li>新しいドリルビットを使用して、正中線（ヘッドプレートウィンドウの直径の三分の一）から横方向にmicrotorqueドリル1.5ミリメートルを配置します。 4,000 rpmで、この場所の周りに薄い頭蓋骨に開始します。直接的な下向きの圧力で頭蓋骨をそっとドリルを移動します。 </li><li> drilを中止マウスの頭蓋の過熱を防ぐために、玲ごとに10〜15秒。この時間の間に、圧縮空気の缶を使用して、蓄積された頭蓋骨のほこりを取り除きます。 </li><li> 5-10秒間頭蓋骨を冷却するためにRT生理食塩水の滴を使用してください。静かに頭蓋骨間伐を継続するために、軟組織とすべての液体を除去します。 </li></ol></li><li>頭蓋骨の最終薄化のために、ヘッドプレートリザーバ内に生理食塩水の小さなボリュームを置き、軽く小さな血管がはっきりと見えるようになるまで関心のある領域にわたって歯科マイクロブレードを掃引。 </li></ol>生理的パラメータの3モニタリング<ol><li>頭蓋骨が完全に薄くされた後、ホルダーからマウスをデタッチし、その背中の上に置きます。ゆっくりはっきりと内側の太ももを露出するために、両方の後ろ足を下にテープで固定します。 </li><li>ハサミや電気シェーバーで両方の内側の太ももの上に髪を削除します。ポビドンヨードで太ももを覆うことにより、手術部位を消毒します。 </li><li>大腿静脈上記内側右腿の皮膚をつまんで＃5ピンセットを使用して動脈。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。 注：左大腿は、外科的合併症（血管奇形、破裂した血管）のイベントに予約されています。 </li><li>手術部位に0.9％生理食塩水の約3〜5滴を適用します。これは、血管のより大きな倍率だけでなく、血管のしっとりサイトを保ち、乾燥防止することができます。ぶっきらぼう2＃45分の5ピンセットを用いて大腿神経血管束に解剖することにより、動脈から大腿静脈を分離します。 </li><li>約1cm離れて大腿動脈の下手術用縫合糸の2、3センチメートルピースを置きます。カテーテル挿入時に過度の血液の損失を防ぐのに役立ちます血管止血帯を作成するために、上部の縫合糸を時計回りに回します。 </li><li>春のはさみを使用して大腿動脈に小さな切開を行います。カテーテルが動脈内に確実になるまで切開し、事前を通じて動脈にカテーテルを配置します。 </li><li&gt;が漏れ、適切なカテーテル留置のために評価するために、上部の縫合糸（止血帯を）のねじれを広げ。縫合糸を使用して血管内にカテーテルの周りに2ノットを結ぶことにより、大腿動脈にカテーテルを固定します。 </li><li>血液凝固を防ぐために、カテーテルを介してヘパリンを10μl（100 IU / ml）を注入します。次に、外科的に単純な中断パターンで4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、右腿を閉じます。 </li><li>腹腔内に右下腹部にウレタンを50μl（1.2ミリグラム/ g）を注入します。五分後に腹腔内ウレタン100μlの合計左下腹部に別の50μlの注入を繰り返します。同時に、麻酔の深さのために、マウスを再確認しながら、ゆっくりと約0.25％にイソフルランレベルを減少させます。 注：それは腸を穿孔しないように後部腹壁に沿って腹腔内表面的な針を保管してください。これは、腹部直筋ムーをつまんで達成することができます離れて内臓から、その後注入scles。 </li><li>毛細管を使用して、カテーテルから動脈血の40μlのサンプルを収集します。生理食塩水で満たされた、四方コックとヘパリンを充填した注射器を装着し、血圧トランスデューサにカテーテルを取り付けます。 </li><li>カテーテルの意図しない取り外しを防止するための外科用装置に血圧トランスデューサをテープ。平均動脈圧の監視を開始します。 </li><li>血液ガス分析装置の入口ポートへの血液充填したキャピラリーチューブを挿入します。すべての血液が抽出されると、入口から毛細管を削除します。 O 2、CO 2、血液ガスレベルは、血液ガス分析装置から印刷された紙の上に表示されます。 </li></ol>蛍光色素の4注入<ol><li> ＃5ピンセットを用いて、内側左太ももの皮膚をつまんで。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。デキストラン共役赤色発光ローダミン色素を準備（70キロダルトン）（生理食塩水に溶解した10mg / kgの）。 </li><li>付属の30 G針で1mlシリンジをvein.Using大腿骨を見つけ、シリンジの130μlのラインへのイメージングのための適切な蛍光色素の先に調製した溶液を描画します。注射器に完全に染料を描画し、しっかりとシリンジ壁をフリックして、すべての気泡を除去します。 <ol><li>ベンド硬質表面ベベル面を上に押し付けることで約30度の角度で30 G針。染料で針を記入し、余分な液体を捨て、100μlのサンプルを残します。 </li></ol></li><li>ゆっくりと大腿静脈に色素の100μlのサンプルを注入します。針を除去した後、任意の出血を止めるために注射部位に安定し、静かに圧力をかけます。色素が5分間循環させます。 注意：代替的に、右大腿静脈に別の手術部位の創出を通じてさらなる血液損失を防止するために、蛍光色素の注入のために代わりに使用することができます。加えて、もし動物は、これはあまりにも多くのヘパリンは、カテーテルをフラッシュするために与えられたことを示している可能性があり、手術部位から制御不能出血しています。そこには凝固が10〜15分以内でないとマウスがまだ出血している場合は、新しいマウスを用いた実験を再開することを検討してください。 </li><li>その胃の上にマウスを反転し、マウスのヘッドプレートハーネスにそれを置き、慎重に、その後、4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、左太ももを閉じます。 </li></ol> 生体内二光子イメージング5. <ol><li>連続麻酔レベルを維持するために確認して、二光子顕微鏡に手術装置を移動します。ヘッドプレートのリザーバに0.9％生理食塩水の少量を置き、生理食塩水と接触するように、顕微鏡対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて、関心領域の位置を確認します</li><li>蛍光色素のために適切な波長の二光子レーザー励起を設定します。 25X Oを用いた2光子イメージングを開始しますbjective。 これらの実験で、我々は波長780nmで励起した赤色発光ローダミン色素に結合させたデキストランを使用することに注意してください。色素からの蛍光を検出するための発光フィルタをバンドパス、および20分の480バンドパス放射フィルタは、動脈自己蛍光を検出するために使用した36分の607 </li><li>ビュー画面上の毛細血管床を見つけて、光学ズームを2光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の2獲得画像を使用して、このエリアを拡大。 </li><li>イメージングが完了した後、断頭続いて頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol> 6. エクスビボ二光子イメージング<ol><li>極細ハサミを使用して、マウスの正面骨に壁間の骨から頭皮に切開を行います。ポインタ指と親指で頭蓋骨の側面に皮膚を保護します。 </li><li>内側頭頂間骨の下極細ハサミを置き、矢状縫合に沿って頭蓋骨をカット。ブレグマをマーキングした後、約3mmの頭蓋骨を切断停止します。 注：脳を切断しないようにする頭蓋骨を切断する際に上向きの圧力を適用します。 </li><li> ＃5鉗子を使用して、脳から頭蓋骨を分離し、慎重に脳の表面から髄膜を除去します。残りの髄膜は、誤って脳を切ることができます。細心の注意は、これを避けるために注意すべきです。脳が頭蓋骨から外れるまで静かに前方にゆっくりと進行する脳の下の＃5鉗子をスライドさせます。 注意：下向きの圧力が脳を刺さないようにするために使用されるべきであること。 </li><li>マウスのための特定の脳切片ツールで脳を置きます。脳の上に人工脳脊髄液の液滴を適用することにより、脳を洗ってください。 </li><li>ブレグマにブレグマ0から脳の2ミリメートル冠状断面を取り外し-2。上を向い0ブレグマと人工脳脊髄液を含む凹状のスライドガラス上に冠状断面（断面の最も頭側の部分）を配置します。静かに脳SLをカバーガラスカバースリップと氷。 注：これは、血管アーキテクチャを変形させることのように一度脳部に配置されたガラスを押す避けてください。 </li><li>顕微鏡ステージにスライドを移し、カバースリップ上の0.9％生理食塩水を少量入れます。それは生理食塩水に接触するまで、顕微鏡の対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて脳の正中線の位置を確認します。 </li><li>二光子イメージングを開始し、再び25倍対物レンズを用いて正中線を探します。冠状断面の皮質表面に縦亀裂を探して、これを達成します。正中線の撮影画面の右端を置き、横方向に3完全なフレーム（正中線から約1.5 mm）をビューア画面を上に移動。 これらの実験では、撮像パラメータは、ステップ5.2でノートに記載されたものと同一であったことに注意してください。 </li><li>毛細血管がビュー画面上でかろうじて見えるれる深さの位置を確認します。焦点さらに20の平面を下げますμmでは、zスタックの先頭を決定します。 </li><li> 1μmの画像の厚さを設定します。 100ミクロンのビュー画面を下げて、各画素の1％未満が過飽和となるように全体にレーザーパワーを調整します。 注意：zスタック画像は100の連続した​​500x500x1ミクロン一連の画像からコンパイルされます。より正確な後処理の計算がされるzスタック大きいです。一般的には、100μm以上のzスタックを収集しようとします。 </li><li>隣接するX-Yのアイコンが続くXYリピートアイコンを押します。 zスタックが完了すると、 シリーズ完了アイコンを押して、ファイルを保存します。 </li></ol> 7.データ処理<ol><li> ImageJソフトウェアにおける in vivo毛細血管画像を開きます。手動で二光子ソフトウェアから得られた値に基づいて距離比のピクセルを設定します。 <ol><li> [ツール]メニューから*ストレート*アイコンを選択します。親しい同僚に1毛細血管壁から伸びる線を引きサイトの毛細血管壁、とのImageJで提供さ長さを記録します。 それは明らかに毛細血管壁のエッジを可視化するために、画像にズームインする必要があるかもしれないことに注意してください。 </li><li>繰り返しキャピラリーに沿った異なる位置でのステップ7.1.1と同様に、画像内の複数のキャピラリ。 </li></ol></li><li>そのようなアミラなどの分析ソフトウェアにzスタックファイルを開きます。サブアプリケーションツールバーからフィラメントエディタのアイコンを選択 <ol><li>約20に、視聴者の厚さを設定zスタックの上部または下部のいずれかにビューアを移動します。 </li><li> トレースアイコンを選択し、ロードされた画像の上にカーソルを移動します。 図2Cに記載された場所での毛細血管上のノードを配置します。セグメントは自動的に隣接するノード間で表示されます。全体zスタック全体に毛細血管をトレースします。 注：これは毛細血管を追跡するために、エンドポイントと分岐点との間のノードを配置する必要があるTHRzスタックoughout。 </li><li>これらのノードを削除するには、 中間のアイコンを削除]をクリックします 。 注：これは、 選択1つのアイコンを使用してループを選択することにより、手動で削除する必要があり、誤ったループセグメントを作成し、[削除選択アイコンを選択することができます。ループがトレース中に同じ領域に表示し続ける場合は、ノードが別の毛細血管に配置した可能性があります。 </li><li>トレースが完了すると、自動的に抽出された血管のパラメータを含むスプレッドシートを開くために、グラフ情報]アイコンを選択します。ノードとセグメントの数は、メインビュー画面で利用可能です。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここに記載された方法は、実験モデル/設定の広範囲の脳微小血管構造を分析するために適用することができます。この方法の成功のために、3つの重要なステップを習得する必要があります。まず、薄頭蓋骨窓は、頭蓋骨または基礎脳に損傷を与えてはなりません。それは間伐時に頭蓋骨に穴を開け、または熱誘導性の血管漏出を引き起こすことは容易です。蛍光色素は、焦点面に漏出し、毛細血管を不明瞭になりますので、これは画像に干渉することがあります。頭蓋骨が頻繁に薄い頭蓋骨の準備中に壊れた場合は、最も可能性の高い大きすぎる下向きの圧力によって引き起こされます。バリにできるだけ近いmicrotorqueドリルを保持することは頭蓋骨に下向きの圧力を低下させる大きな触覚制御を可能にします。 第二に、動脈カテーテル法は、可能な限り迅速に動脈が切断された後に発生する必要があります。すぐにカテーテルを挿入しないと、コンプます過度の血液損失を引き起こす可能性がありますマウスの生理的な整合性をromise。カテーテルを挿入する難しさは、大腿動脈に比べて、通常、カテーテルの比較的大きなサイズに起因しています。それは、その直径を減少さ...

ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）ウイルス感染の急性期の間に脳に侵入し、かつ生産両方ミクログリア及び脳の常在マクロファージ、それらの活性化につながる感染 - 及び両方宿主由来の炎症性メディエーターおよび可溶性HIV-1の放出をそのような（1,2に見直さ）Tatおよびgp120のようvirotoxins。その結果、慢性神経炎症状態は、HIV-1関連神経認知障害（手）3-5の病因に寄与していると考えられるCNS、に設立されてしまいます。 HIV-1のTatまたはマウスのCNS ​​内のインターロイキン（IL）-17Aの慢性的過剰発現は、微小血管希薄6,7をもたらすことが示されています。これには、慢性神経炎症が脳血管系への影響を介して手の病因に貢献するかもしれないという可能性を提起します。さらに、この問題を調べるために、我々は、脳血管STRUCを定量化する方法を開発しましたトゥーレス。 この論文では、セグメント長、総セグメントの長さを意味する毛細管の直径、及び薄い頭骨皮質窓を通して毛細管ネットワークのインビボイメージングに用いて全毛細管容積平均、毛細管ノード、キャピラリーセグメントの数を定量化するための方法を記載して（前述の修飾されましたプロトコル）8,9、ならびに二光子顕微鏡を用いて脳切片の ex vivoイメージング。脳スライス内の毛細血管網の ex vivoイメージングは、三次元、完全な再構築を可能にしながら、in vivoでの薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、脳環境の保全を可能にするので、この組み合わせアプローチは、脳血管のパラメータの全体的な定量を提供します毛細血管ネットワーク - 次に、市販のソフトウェアを用いて定量することができます。

<table><tbody><tr><td>ライカ顕微鏡</td><td>ライカ株式会社</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>高輝度イルミネーター</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングパッド</td><td>ストライカー&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/PUMP</td><td>ゲイマー・インダストリーズ(株)</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 イソフルラン気化器</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>バトラー AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素溶液&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファインボンはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5/45 フォーセプス</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>塩化第二鉄溶液</td><td>リッカケミカルカンパニー</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>ロックタイト 454 プリズムインスタント接着ゲル</td><td>ヘンケル</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>ストールティング</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>マイクロトルケIIハンドピースキット</td><td>ピアソンデンタル</td><td>R14-0002</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>ドリル用005バリ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>ノーランドブレード(歯科用マイクロブレード)</td><td>サルビンデンタル</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>ウレタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>U2500</td><td>グループ2B 発がん性物質</td></tr><tr><td>編組縫合</td><td>糸エチコン</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>ヴァンナス春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;動脈カテーテル</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>カテーテルの直径を小さくするために、カテーテルの端を手動で伸ばしました。&nbsp;</td></tr><tr><td>血圧モニター</td><td>ワールド精密機器</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>血圧トランスデューサーとケーブル</td><td>ワールド精密機器</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab 血液ガス分析装置&nbsp;</td><td>シーメンス&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &MU;l 毛細管</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>テキサス レッドデキストラン (70,000 MW, 10 mg/kg 生理食塩水溶解)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>成体マウス脳スライサー マトリックス</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子顕微鏡</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Saレーザー</td><td>スペクトル-物理学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>は、</td></tr><tr><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Amira Software</td><td>Visage Imagingで入手可能&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hiv誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) 感染は、頻繁にHIV-1関連神経認知障害 (HAND) を引き起こし、中枢神経系 (CNS) 内の慢性神経炎症状態を特徴とし、主にウイルスを介したミクログリアと脳内マクロファージの活性化によって引き起こされると考えられています。 HIV-1感染は脳血管血流(CBF)の変化も伴うため、HIV関連の慢性神経炎症がCBFや脳血管構造の変化につながる可能性が高まっている。この問題を解決するために、HIV誘発性神経炎症のマウスモデルを使用し、この炎症環境に長期間さらされると脳血管系が損傷し、毛細血管網の希薄化を引き起こすかどうかをテストしました。本稿では、神経炎症性疾患モデルマウス(HIV-1 Tat transgenic mics)における皮質毛細血管密度の変化を定量化する方法について述べる。 この一般化可能なアプローチは、薄い頭蓋骨皮質窓を介した皮質毛細血管のin vivo 2光子イメージングと、マウス脳切片の皮質毛細血管のex vivo 2光子イメージングを採用しています。これらの手順により、毛細血管ネットワークの画像とzスタックファイルがそれぞれ作成され、脳血管構造の変化を評価するために定量分析を行うことができます。

薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、皮質毛細血管の in vivo二光子イメージング（ 図1）を可能にします。画像に適した領域は、多数の、明確な毛細血管（ 図1A）を示しています 。同じ視野において、いかなる動脈細胞壁の自己蛍光が存在しない、第二高調波11（ 図1B）によって誘導されるコラーゲンの蛍光などの他の蛍光信号があってもよいです。 脳切片の準備が完了すると、約1.5ミリメートル正中線からが配置されている撮影領域（ 図2A）。100μmのzスタックは、アミラ解析ソフト（ 図2B）での分析のために使用される三次元画像を生成します。毛細血管網は、手動で開始し、毛細血管の終わり、または任意の場所1キャピラリーbにノードを配置することによって追跡されます他に...

この論文は、in vivoおよびex vivoの2光子顕微鏡を使用して脳内の血管構造を定量化する方法について説明しています。

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

この手順の全体的な目的は、HIVバイロトキシンであるtatへの長期曝露後における皮質毛細血管ネットワークの変化を定量化することです。この手法は、HIV関連神経認知障害の病態に関与していると考えられる皮質毛細血管形態の主要な変化を調べるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複数の毛細血管形態パラメータを生理学的に正確に定量化できることです。この手法は、HIVに関連する神経認知機能障害の病態解明に有用であるだけでなく、アルツハイマー病など血管変化を伴う他の疾患にも適用可能です。まず、麻酔をかけたマウスの眼に人工涙液ゲルを塗布することから手順を開始します。次に、バリカンを用いて頭部の除毛を行います。その後、ポビドンヨード溶液を塗布して頭皮を滅菌し、乾燥させます。光学顕微鏡下で動物の頭皮を除去し、頂骨、前頭骨後部、およびブレグマを完全に露出させます。膜を乾燥させて除去しやすくするため、10%塩化鉄溶液を少 amount 少量、頭蓋骨に塗布します。続いて、ピンセットで頭蓋骨を軽く掻き出すようにして、乾燥した膜を取り除きます。その後、ヘッドプレートウィンドウの周囲に接着剤を薄く塗布します。マウスの頭蓋骨にヘッドプレートをそっと押し当て、関心領域がウィンドウの中央にくるように固定します。その後、ヘッドプレートに歯科用セメントを1滴滴下し、接着剤を重合させます。次に、ヘッドプレートのウィンドウの縁に沿って接着剤を薄く塗り、生理食塩水を保持するためのリザーバーを作成します。接着剤が乾燥したら、ヘッドプレートをマウス用ヘッドプレートハーネスにねじ込みます。マイクロタープドリルに装着したドリルビットを用い、回転数を6,000 rpmに設定して、ヘッドプレートの窓から接着剤を取り除きます。マウスの頭蓋骨の過熱を防ぐため、10〜15秒ごとに停止させてください。その後、新しいドリルビットを使用し、4,000 rpmに設定したマイクロタープドリルで頭蓋骨を薄くし始めます。下方向に直接圧力をかけず、ドリルを頭蓋骨上でゆっくりと動かしてください。頭蓋骨が完全に薄くなったら、マウスをホルダーから外し、仰向けにしてください。両後肢を優しくテープで固定し、大腿内側を明確に露出させます。次に、両大腿内側の除毛を行い、ポビドンヨードで大腿部を覆って手術部位を消毒します。続いて、大腿静脈および大腿動脈の上の、右大腿内側の皮膚を慎重に除去します。手術部位に0.9%生理食塩水を約3〜5滴滴下します。次に、大腿神経血管束を鈍的に剥離し、大腿静脈を大腿動脈から分離します。その後、大腿動脈の下に、約1cmの間隔で3cmの手術用縫合糸を2本配置します。上部の縫合糸を時計回りにねじって血管止血帯を作り、カテーテル挿入中の過剰な出血を防ぎます。続いて、スプリングシザーを用いて大腿動脈に小さな切開を加え、ここにマウスの生理学的パラメータをモニタリングするためのカテーテルを挿入します。この手順では、マウスの左大腿内側の皮膚を除去します。次に、大腿静脈を確認します。1 mLシリンジと30G針を用いて、蛍光染料溶液を130 µL吸い取ります。その後、100 µLの染料を大腿静脈にゆっくりと注入します。針を抜いた後、注射部位を優しく一定の強さで圧迫して止血し、染料が循環するまで5分間待ちます。その後、手術部位を縫合して閉じます。マウスを慎重に腹向きにひっくり返し、マウス用ヘッドプレートハーネスに固定します。in vivo 2光子イメージングを行うため、手術器具を2光子顕微鏡へ移動させ、動物の麻酔レベルを維持していることを確認します。次に、ヘッドプレートのリザーバーに少量の0.9% 生理食塩水を注入し、顕微鏡対物レンズを下げて生理食塩水に接触させます。その後、明視野観察用対物レンズを使用して、目的の領域を特定します。その後、二光子イメージングを開始します。ビュースクリーン上で毛細血管床を特定し、光学ズームを用いてこの領域を拡大します。二光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の画像を取得します。ex vivoでの2光子イメージングを行うために、安楽死させたマウスの頭皮を、頭頂骨から前頭骨にかけて切開します。人差し指と親指で皮膚を頭蓋骨の両側に固定し、極細剪刀を正中線上の頭頂骨の下に配置し、ブレグマ点から約3 mm後まで矢状縫合に沿って頭蓋骨を切断します。次に、頭蓋骨を脳から分離し、ピンセットを用いて脳表面から髄膜を慎重に除去します。ピンセットを脳の下にそっと滑り込ませ、頭蓋骨から脳を切り離します。その後、マウス専用の脳マトリックスに脳を配置し、ACSFを滴下して洗浄します。次に、1 mm厚の脳冠状断切片を採取します。脳切片の最も前方の部分を上に向けて、ACSFを含む凹面ガラススライド上に置きます。次に、ガラスカバーガラスで脳切片をそっと覆います。スライドを顕微鏡ステージに移し、カバーガラス上に少量の0.9% salineを滴下します。顕微鏡対物レンズを saline に接触するまで下げます。次に、明視野対物レンズを用いて脳の中心線を確認します。その後、2光子イメージングを開始し、25x 対物レンズを用いて再び中心線を確認します。冠状断面の皮質表面にある正中裂を探して、これを達成します。次に、イメージングスクリーンの右端を正中線に合わせ、ビューアースクリーンを外側へ3フレーム分移動させます。ビューアースクリーン上で毛細血管がわずかに見え始める深さを特定してください。次に、フォーカス面をさらに20 µm下げて、z-stackの上端を決定します。画像厚を1 µmに設定します。ビュースクリーンを100 µm下げ、画素の飽和度が1%未満になるようにレーザー出力を調整します。最後に、zスタックを取得します。この図では、脳スライスの調製後、正中線から約1.5 mmの位置にイメージング領域を設定しています。100 µmのzスタックを作成することで、Amira分析ソフトウェアでの解析に使用する3次元画像が得られます。次に、毛細血管の始点と終点、または毛細血管が分枝している箇所にノードを配置することで、毛細血管ネットワークを手動でトレースします。これにより、完全にスケルトン化された画像が作成され、そこから形態学的パラメータが自動的に抽出されます。マウス脳切片の2光子系ex vivoイメージングを用いることで、毛細血管のノード数、セグメント数、平均セグメント長、および総セグメント長を抽出することができます。ここでは、in vivoイメージングによって毛細血管ネットワークの二次元画像を作成し、そこから毛細血管径を抽出します。そして、ex vivoイメージングから得られた毛細血管径と総セグメント長を用いて、総毛細血管容積を算出します。この手順に習熟し、適切に実施すれば、3時間半で完了させることができます。本手順の実施にあたっては、イソフルランが皮質毛細血管の血管拡張を引き起こし、データを歪ませる可能性があるため、一定レベルの麻酔状態を維持しながら迅速に操作することが重要です。この手順を通じて、赤血球速度や赤血球フラックスなどの他の毛細血管パラメータを得ることができ、これによりHIV関連神経認知障害やその他の神経変性疾患に見られる病理学的変化について、より深い理解を得ることが可能です。実験の成功をお祈りします。

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神経科学

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慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

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内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

Source: Nishimura, C. ら。 HIV誘発性神経炎症のマウスモデルにおける2光子顕微鏡を用いた脳血管構造の定量化。 J. Vis. Exp. (2016).

マウス脳微小血管系のIn vivoイメージングのための2光子顕微鏡

出典:Arango-Lievano, M. et.al., Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases(脳血管系の縦断的In vivoイメージング:中枢神経系疾患との関連性)。J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、蛍光標識されたアミロイドプラークと脳血管系を視覚化するためのin vivo...

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HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

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