マウス脳微小血管系のIn vivoイメージングのための2光子顕微鏡

外科的に準備された薄い頭蓋骨皮質窓の上にヘッドプレートを固定した麻酔をかけたマウスから始めます。

マウスを仰臥位に置きます。大腿静脈を露出させるために、太ももの内側の皮膚を取り除きます。

蛍光色素複合体を静脈に注入して血漿を標識し、血管の視覚化を可能にします。

切開部を縫合します。

マウスを裏返し、ヘッドプレートをハーネスに固定してマウスを安定させます。

セットアップを2光子顕微鏡ステージに移します。

皮質窓に生理食塩水を追加します。生理食塩水に接触するまで対物レンズを下げます。

明視野照明を使用して、イメージング領域を特定します。

2光子イメージングに切り替えます。

顕微鏡のレーザーは、低エネルギーの近赤外光を脳に集束させます。

レーザーの焦点では、2 つの光子がエネルギーを結合して色素を励起し、血管を蛍光させます。

細血管床(動脈と静脈をつなぐ小さな血管のネットワーク)を特定し、それを拡大します。

画像を取得して脳の微小血管系を解析します。

この手順では、マウスの左太ももの内側の皮膚を取り除きます。次に、大腿静脈を見つけます。1ミリリットルの注射器と30ゲージの針を使用して、130マイクロリットルの蛍光染料溶液を引き上げます。100マイクロリットルの染料を大腿静脈にゆっくりと注入します。

針を抜いた後、注射部位に安定した穏やかな圧力を加えて出血を止め、染料を 5 分間循環させます。次に、縫合糸で手術部位を閉じます。マウスを慎重にうつ伏せにして、マウスヘッドプレートハーネスに置きます。in vivo 二光子イメージングの場合は、手術器具を二光子顕微鏡に移動し、動物の麻酔レベルを維持するようにしてください。

次に、少量の0.9%生理食塩水をヘッドプレートリザーバーに入れ、顕微鏡対物レンズを下げて生理食塩水に接触させます。次に、明視野表示対物レンズを使用して、関心のある領域を見つけます。その後、2光子イメージングを開始します。ビュー画面で毛細管床を見つけ、光学ズーム2を使用してこの領域を拡大します。2光子イメージングソフトウェアを使用して毛細血管の画像を取得します。