大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

我々はとレトロOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc（OSKM）をコードするベクターとライブ染色により正しく再プログラムhiPSCの識別を用いたヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）TRA-にヒト体細胞の効率的なリプログラミングのためのプロトコルを提示1から81抗体。

このビデオ記事では、ヒトの成体線維芽細胞がレトロウイルスベクターを使用して多能性幹細胞を生成するように再プログラムされています。まず、ヒト線維芽細胞に転写因子をコードするレトロウイルスベクターを形質導入します。T 3 4、SOX 2、KLF 4、および cmic.

感染した線維芽細胞をマウス胚フィーダー細胞上で14〜28日間培養します。得られた培養物をTRA 180 1抗体で染色し、再プログラムされた細胞のコロニーを同定します。その後、陽性コロニーはMEF含有プレートに移され、拡大されます。

免疫細胞化学染色は、多能性マーカーの発現と多能性幹細胞株の確立を確認します。その後、ラインをさらに特徴付けるために、追加の研究を実施する必要があります。一般に、体細胞細胞プログラミングやヒト誘導多能性幹細胞培養に不慣れな個人は、正しいIPSCコロニーを特定するのが難しいため、苦労するでしょう。

手順を実演するのは、私の研究室のドクターOフェロー後のDr.Sula Pollakです。この手順は、インキュベーター内の10ミリリットルの高グルコースDMEMに10cmプレートあたり約7〜800万個の細胞を密度でPhoenix AM FO細胞をプレーティングし、一晩培養することから始めます。翌日、T、3、4、SOX、2、klf、4、cmicまたはGFP遺伝子のいずれかをコードするベクター12マイクログラム、および総量500マイクロリットルの無血清高グルコースDMEMとLグルタミンを含む6つの遺伝子6からなるトランスフェクションミックスを調製します。

混合物を20分間インキュベートします。次に、フェニックス細胞をトランスフェクションするために、DNA複合体をフェニックス細胞を含むプレートに穏やかにピペットで入れます(70〜80%のコンフルエントである必要があります)。6〜8時間後に細胞を摂氏37度でインキュベートします。

培地を吸引し、抗生物質を含む8ミリリットルの高グルコースDMEMと交換します。その後、インキュベーション後12時間、プレートをインキュベーターに戻します。ピペットを使用して、ウイルスを含む培地を吸引して収集します。

次に、培地を交換し、培地が4回収集されるまで、このプロセスを12時間ごとに繰り返します。メディウムは摂氏4度で保管してください。すべての培地が収集されたら、すべての部分を結合し、0.45マイクロメートルのチューブトップフィルターを介して50ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、剥離した細胞や破片を取り除きます。

ウイルス粒子を含むろ過された培地は、感染活性を失うことなく冷蔵庫に2週間保存できます。凍結はお勧めしません。形質導入手順の前日に、成体ヒト線維芽細胞の凍結ストックを解凍し、6つのウェルゼラチンコーティングプレートの各ウェルごとに5番目の細胞に1回10を追加します。

翌日、50ミリリットルのコニカルチューブに、T 4、SOX 2、klf 4、およびcmicウイルス培地をそれぞれ3.5ミリリットルずつ組み合わせ、ポリブレインを最終濃度6マイクログラム/リットルに増やして対照とします。1ミリリットルのGFPウイルス培地、3ミリリットルの培養、培地およびポリブレインを、1ミリリットルあたり6マイクログラムの最終濃度で調製します。ヒト線維芽細胞を含むプレートから培地を吸引します。

次に、4ミリリットルの混合ウイルス培地を添加するか、遠心分離後、20°Cで1時間、プレートを遠心分離します。プレートを約12時間インキュベートします。次に、ウイルス培地を線維芽細胞培養培地に交換し、さらに12時間インキュベートします。

感染から線維芽細胞培地での培養まで、このプロセスを繰り返し、最後の感染からさらに2回繰り返します。DMEMで線維芽細胞を48時間培養します。次に、GFPレトロウイルス培地によるパラレル形質導入の感染効率を確認します。

次に、体細胞から多能性細胞へのリプログラミングを開始します。感染した線維芽細胞は、ヒト胚性幹細胞培地またはHES培地種子マウス胚、線維芽細胞またはMEFで、処理したゼラチンのウェルあたり約2×10〜5番目の細胞の密度で培養する。翌日、線維芽細胞増殖培地に6ウェルプレートを装着した。

感染したヒト線維芽細胞を0.05%tripsin EDTAを用いて分割し、線維芽細胞増殖培地中のウェルあたり約1.2×10〜4の密度で播種します。翌日。リプログラミングの最初の7日間は、培地を0.5ミリモルの酪酸ナトリウムを含むHES培地と交換します。

媒体は毎日交換してください。メディアを酪酸ナトリウムを含まないHESメディアと交換し、さらに7〜21日間再プログラミングを続けます。毎日媒体を交換してください。

形質導入細胞の形態変化を確認します。細胞のコロニーは、形質導入された線維芽細胞をフィーダー細胞に移してから約10日後に出現し始めます。再プログラムされた細胞を含むコロニーは、現在、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトIPS細胞と呼ばれています。

ヒトIPS細胞コロニーは、MEFフィーダー細胞に播種してから14〜28日で単離する準備が整います。この段階では、ヒトIPS細胞コロニーをMEF含有プレートまたはマトリゲル被覆プレートのいずれかに転写することができます。MEF含有プレートへの移し替えは、ヒトIPS細胞コロニーSeed 24ウェルプレートを採取する前日に、線維芽細胞増殖培地中のガンマ線照射MEFフィーダー細胞を含有

ヒトIPS細胞コロニーを選別する日に、摂氏37度で5%CO2でインキュベートします。ME Fsから線維芽細胞増殖培地を吸引し、PBSですすいでFBSの痕跡を取り除きます。続いて、0.5ミリリットルのヒト胚性幹細胞または10マイクロモル岩石阻害剤Y 2 7 6 3 2を含むHES培地を各ウェルに加え、次に、層流フードに取り付けられた顕微鏡を使用して、ヒトIPS細胞コロニー形成のためのリプログラミングプレートを調べる。

必要に応じて、ヒトIPS細胞コロニーを囲む線維芽細胞を21ゲージ針で除去します。プレートをPBSですすぎ、TRA 180 1ステインアライブ特異的抗体を含む新しいHES培地を加えます。細胞を摂氏37度でインキュベーターに戻し、CO2を5%にします。

30分後、培地を10マイクロモルの岩石阻害剤を補充した新しいHES培地と交換します。次に、蛍光顕微鏡でコロニーを観察します。TRA 1 から 81 の陽性コロニーをマークします。

21ゲージの針を使用した対物マーカーを使用します。TRA 180 1陽性ヒトIPS細胞コロニーをいくつかの小片に切断します。次に、自動ピペットを使用して、ヒトIPS細胞コロニーの断片をME Fsで24ウェルプレートの個々のウェルに移します。

プレートをインキュベーターに置き、ヒトIPS細胞コロニーを24〜36時間付着させます(毎日培地を交換します)。正しいHE様形態のヒトIPS細胞コロニーは、21ゲージのニードルプレートで切断することにより、6〜8日ごとに手動でヒトIPS細胞コロニーを継代する24ウェルプレートへの最初の移し替えから48時間後に見えるようになります。培養物を12ウェル上に拡大し、クローン増殖後に6ウェルプレート上に培養します。

そして、ヒトIPS細胞株を樹立すると、多能性マーカーTRA one、60 SSEA four、T three、T three、4 SOX two、およびnanogの発現を免疫化学を用いて解析します。詳細な特性評価には、in vitroおよびin vivoが含まれる場合があります。分化解析、核型解析、導入遺伝子サイレンシングメチル化研究および遺伝子発現研究の解析。

レトロウイルス含有培地による効率的な形質導入は、ウイルス形質導入の有効性を判断するためのリプログラミングを成功させるために重要です。フリードリッヒ運動失調症患者に由来するヒト成体線維芽細胞は、GFPレトロウイルス培地による2回連続感染後に可視化され、線維芽細胞がウイルス培地との単純なインキュベーションによって感染した場合、細胞の20%未満が形質導入されました。しかし、GFPレトロウイルス培地を添加した直後に形質導入の効率が飛躍的に向上しました。

ここでは、細胞の80%以上を形質導入して、単離されたヒトIPS細胞コロニーの初期特性評価を行います。ヒトES細胞に特徴的な多能性マーカーの発現を、ここに示すように免疫化学によって評価しました。単離されたヒトIPS細胞コロニーは、多能性マーカーに対して陽性であった。

T 3 4 SOX 2 nano SSEA 4 および TRA 1 60 DNA上パネルに示されているDPIによるCos染色は、ヒトIPS細胞コロニーとフィーダー細胞の両方で検出されます。これらの結果は、このリプログラミングプロトコルを用いて得られたヒトIPS細胞が、未分化のヒト多能性幹細胞に特徴的な適切な多能性マーカーを発現することを示しています。

このビデオを見た後、レトロウイルストランザクションを使用してヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に正常に再プログラムする方法、および正しいヒト誘導性多能性幹細胞コロニーを同定し、HI PCの初期特性評価を行う方法を十分に理解できるはずです。