Name: 大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 23 s
Description: 学ぶ大人の線維芽細胞からレトロウイルスベクターを用いてヒト人工多能性幹細胞を再プログラムする方法。TRA-1-81抗体染色でコロニーを同定し、多能性マーカー発現を確認する効率的なプロトコルです。

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この作品は、フリードライヒ失調研究アライアンスとアーノルドファミリー財団とMDアンダーソンがんセンターの幹細胞と再生科学総合研究センターからのパイロット助成金によって支えられている。

1。ウイルスの生産と伝達<ol><li> DMEM培地（DMEM高グルコース、不活化10％FBS、熱、2 mM L-グルタミン、抗生物質なし）10ml中〜7-8×10 6％10 cmのプレートの密度でプレートフェニックス周りに細胞。 37一晩インキュベーターや文化の場所°C、5％CO 2。 </li><li>ベクトル符号化OCT3 / 4、Sox2の、KLF4、c-mycの、またはGFP遺伝子（プラスミドAddgene 17217、17218、17219、17220）、35μlのFuGENE 6トランスのいずれかの12μgを用いて次の日にトランスフェクションフェニックス細胞。 DMEM培地（DMEM高グルコース、2 mM L-グルタミン、無FBSおよび抗生物質）500μlのトランスフェクションミックスを調製する。 20分インキュベートします。穏やかに70から80パーセントコンフルエントフェニックス細胞を含む10 cmのプレートにDNA複合体をピペット。 </li><li> 8時間ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM培地（DMEM高グルコース、不活化10％FBS、熱、2 mM L-グルタミン）のトランスフェクション後 - メディア6を交換してください。 </li><li>その後、ウイル​​スを含む培地に4回12時間で収集間隔は、すべての部分を組み合わせて、剥離した細胞と破片を（ウイルス粒子を含むメディアがしかし凍結が推奨されていない場合は、感染活動を失うことなく2週間冷蔵庫に保管することができます）を削除する0.45μmフィルターを用いて濾過した。 </li><li>レトロウイルスのメディアコレクションの最後の日前に凍結ストックの24時間からレトロウイルス形質導入、プレートヒト成人線維芽細胞（流路10、コーリエル医学研究所）のために。シードは、DMEM高グルコースで、ウェルあたり1×10 5細胞の密度で6ウェルゼラチン覆われたプレート上で細胞を、10％FBS、2mMのL-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸。 </li><li>フェニックスの細胞から得られたウイルス粒子を含有する培地で翌日代替DMEM培地。のために1600グラムで、線維芽細胞の培養と遠心機の6ウェルプレートの各ウェルにポリブレン6μg/ mlのを補充したウイルスのメディア（それぞれのOct4、Sox2の、KLF4、およびc-mycのメディアを1 ml、4 mlの合計）を追加20℃、1hの約12時間AFTER伝達、線維芽細胞培養培地でウイルスのメディアを交換してください。 24時間間隔でウイルス感染し、遠心分離を3回実行します。 </li><li>最後に、感染後48時間DMEM培地で培養線維芽細胞。 GFPを発現するレトロウイルス媒体と並行して伝達経路による感染の効率を確認してください。図1は、ヒト線維芽細胞の遠心分離促進レトロウイルス感染の効率を示しています。 </li></ol> 2。再プログラミング<ol><li>線維芽細胞増殖培地中で〜2×10 5細胞をウェルあたりの処理ゼラチン6ウェルプレートの密度でMEF細胞を播種することによってγ線照射したMEFフィーダー層6ウェルプレートを準備します。次の日は、線維芽細胞の増殖培地中でウェル当たり1.2×10〜4の密度で0.05％トリプシン/ EDTAとシードそれらを使用して、ヒト線維芽細胞に感染し分割します。 </li><li>次の日は、hES培地（DMEM/F12、20％ノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、penicilliを使用してメディアを交換するN /ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、0.1mMのβ-メルカプトエタノール、20 ng / mlの基底繊維芽細胞成長因子（bFGF）、リプログラミングの最初の7日間の0.5 mMの酪酸ナトリウムを添加した。毎日のメディアを変更します。 </li><li>毎日の形質細胞の形態学的変化を監視します。 HIPSのような細胞のコロニーは、約5パッケージをemergeすることを開始します - 10日間のフィーダー細胞に形質導入​​した線維芽細胞を転送した後。 hiPSCコロニーは約14を分離する準備ができました - 28日MEFフィーダー細胞上にめっきした後。 </li></ol> 3。 hiPSCコロニーの単離<ol><li> hiPSCコロニーをピッキング前日は、線維芽細胞の増殖培地中でγ線照射したMEFフィーダー細胞（ウェル当たり〜4×10 4細胞）を24ウェルプレートを準備します。この段階でhiPSCコロニーは、マトリゲルとmTeSR1媒体を使用してフィーダーフリーの培養に転送することができます。 </li><li> hiPSCコロニーの分離前には、線維芽細胞成長mediuを削除することにより、MEFプレートを準備mとFBSの痕跡を削除するには、PBSでMEFSをすすぐ。その後、各ウェルに7,8に10μMのROCK阻害剤Y27632で0.5ミリリットルのhES培地（またはマトリゲル被覆したウェルの場合mTeSR1培地）を追加します。 </li><li>必要に応じて、層流フード（ - C図2A）に搭載された顕微鏡下で21ゲージ針でhiPSCコロニーを周囲の線維芽細胞を削除します。 PBSでプレートをすすぎ、TRA-1から81 StainAlive特異抗体（1:200、Stemgent）を含む新鮮なヒトESメディアを追加します。後30分、10μMROCK阻害剤を添加した新鮮なヒトESメディアで抗体を含有する培地を交換してください。蛍光顕微鏡と客観的なマーカー（図2D）を使用してマークTRA-1から81までの正のコロニーの下に板を調べます。 </li><li>図2E及びFに示すように、21ゲージ針を用いていくつかの小さな部分に層流フードで顕微鏡下でTRA-1から81までの正のhiPSCコロニーを、カット</li><li> INDにhiPSCコロニーの自動ピペット（P200）転送の断片を使用して、MEFのまたはマトリゲルを含む24ウェルプレートのウェルにividual。非HIPSセルを転送することは避けてください。 37℃、5％CO 2インキュベーター内でプレートを置き、hiPSCコロニーが24から36時間アタッチすることができます。 </li><li>ヒトESまたはmTeSR1（マトリゲル上に成長したコロニーのための）メディアを毎日変更します。正しいHES-のような形態を有するhiPSCコロニーは24ウェルプレートへの初期転送した後、48時間表示されます。 </li><li> 6ウェルプレート12ウェル、その後、上に8日 - 手動で通過hiPSCコロニー毎に6。 </li><li>クローン性増殖とhiPSCラインを確立した後、図3に示すように、免疫細胞化学を用いた多能性マーカーTRA-1-60、SSEA-4、OCT3 / 4、Sox2、及びNanogの発現を分析します。核型と奇形腫形成の分析6,9を用いて得られた線のゲノムの完全性と分化能を評価します。 </li></ol> 4。代表的な結果レトロウイルス含有培地iの効率的な伝達の成功したリプログラミングの重要な。これは、図1に示すように、効率性を監視するウイルスごとに、単一のプログラミング実験を発現してGFPを用いて全体のトランスフェクション/感染症の手順を行うことをお勧めします。一般的に0.5の範囲であった非濃縮ウイルスメディアを用いたヒト線維芽細胞の情報伝達を介して、10で説明したようにGFP発現ウイルスの力価は、決定- 5×10ミリリットル（VP / ml）のあたり7ウイルス粒子。 線維芽細胞は2日最後の感染後できるだけ早く形態を変更します。トリプシン処理ヒト線維芽細胞は、慎重にMEFフィーダー細胞上に播種する前にカウントする必要があります。これは、各細胞株以来、3つの異なる密度（6×10 3、1.2×10 4、6ウェルプレートの1ウェルあたり2.5×10 4）で種子細胞に推奨されている別の成長特性および播種密度は、プログラミングの効率化のために重要であるを示しています。使用される酪酸ナトリウム最初の7 - プログラミングの14日間hiPSC形成の約5倍の効率を向上させます。頻繁に、感染した線維芽細胞を高い密度で播種した場合は特に、線維芽細胞様細胞は培養皿の生い茂る、図2Aに示すようにhiPSCコロニーをカバーすることができます。このケースでは、線維芽細胞層は慎重に持ち上げてhiPSCコロニー（図2B）を明らかにするために削除することができます。その後、hiPSCコロニーはヒトESメディアでリンスし、TRA-1から81抗体で染色する必要があります。線維芽細胞に応じて、約20 - IPSCのような形態を実証するコロニーの40％は、TRA-1-81抗体で染色されません。 24 - 識別hiPSCコロニーは、次の12内のプレートから転送することができます。長時間のインキュベーションは、hiPSCsの急速な分化になります。コロニーは、手動でMEFフィーダー細胞またはマトリゲルをコートしたプレートのどちらかに継代することができます。展開が確立した後hiPSCクローンpluripotenの発現のための免疫細胞化学（ICC）を使用してテストする必要がありますCYマーカーは、図3に示した。さらに、生成されたiPS細胞の詳細な分子特性を含める必要があります：RT-PCR、9サイレンシングの導入遺伝子の多能性遺伝子および分析のプロモーターのDNAメチル化のデモを使用して多能性遺伝子発現の解析を。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。 GFPを発現するレトロウイルスを用いて決定し、ウイルス形質導入の効率が向上します。（A、B）がフリードライヒ失調症患者（GM03665、コーリエル医学リポジトリ）由来のヒト成人線維芽細胞は、GFPレトロウイルスメディアを持つ2つの連続した感染症の後に可視化した。 （C、D）ヒト線維芽細胞は、1600グラムで直接1hの6ウェルプレート上での細胞の遠心分離に続いてGFPレトロウイルス媒体の同じバッチで感染させた。画像は、感染後48時間捕獲された。 <img alt='"図2"' src='"/' files> 図2。 hiPSCコロニーの同定および単離（A）線維芽細胞に囲まれたhiPSCsを含むプレートの位相コントラスト画像。細胞はヒトESメディアで21日間培養した。周囲の線維芽細胞層を除去した後（B、C）と同じhiPSCコロニー。 （D）が正しく書き換えhiPSCコロニーはTRA-1から81の表面マーカー抗体を用いたライブ染色により識別され、無菌の注射針（E、F）を使用してカットし、24ウェルプレートの個々のウェルに移した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。多能性特異的なマーカーOCT3 / 4、Nanogの、レトロウイルスベクター、SSEA4とhiPSCsでTRA-1-60の発現は、免疫細胞化学によって決定された。

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

特に神経系と神経ヒトの疾患、勉強、特に十分なヒト細胞モデルの到達不能に起因する困難されています。多様な種類の細胞にそれらを区別するために誘導多能性幹細胞および潜在的に容易に得られる体細胞を再プログラムする能力は、遺伝性疾患の細胞モデルを作成する可能性を開いた。さらに、性IPSCは、再生医療の将来非常に有望なものである。したがって、多能性に体細胞を再プログラミングの信頼性の高い効率的で安全な方法を開発し、最適化することが不可欠です。 治療への応用の観点から、それが宿主ゲノムにフットプリントの変異を欠いているIPSC世代の安全なアプローチを開発することが重要です。そのようなエピソームベクトルのトランスフェクションとして再プログラム細胞のゲノムに恒久的な変化を導入することなくプログラミング体細胞の方法は、切除可能TRAの使用nsposons、アデノウイルス感染症、およびmRNAまたはタンパク質の直接配信は、すでに11-15確立されている。これまでのところ、これらの遺伝子フリーの方法を使用してプログラミング効率が低く、再プログラム体細胞の性質、種類、年齢に依存していま...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11330 </td></tr><tr><td> KSR </td><td>インビトロジェン</td><td> 10828 </td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140 </td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04から0012 </td></tr><tr><td> bFGFの</td><td> Stemgent </td><td> 03から0002 </td></tr><tr><td> TRA-1-81抗体</td><td> Stemgent </td><td> 09から0069 </td></tr><tr><td> Oct3 / 4の抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-8628 </td></tr><tr><td> NANOG抗体</td><td>に：Cell Signaling Technology </td><td> 4903S &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> TRA-1-60抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB4360 </td></tr><tr><td> Sox2の抗体</td><td>に：Cell Signaling Technology </td><td> 3579S </td></tr><tr><td> SSEA4 </td><td>ミリポア</td><td> MAB4304 </td></tr><tr><td> CF1のMEF </td><td> Globalstem </td><td> GSC-6201G </td></tr><tr><td>客観的マーカー</td><td>ニコン</td><td> MBW10010 </td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354277 </td></tr><tr><td> mTeSR1 </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 05850 </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M7522 </td></tr><tr><td> FuGENE 6トランスフェ</td><td>ロシュ社</td><td> 11814443001 </td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td> H9268 </td></tr><tr><td>オブジェクトマーカー</td><td>ニコン</td><td> MBW10010 </td></tr></tbody></table>

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

ここに我々は1-3ナトリウム、酪酸の存在下でOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc（OSKM）をコードするレトロウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）にヒト成人線維芽細胞を再プログラミングのプロトコルを提示します。我々は、フリードライヒ失調症患者（GM03665、コーリエル医学リポジトリ）から派生した遅く通路（&gt; P10）ヒト成人線維芽細胞を再プログラムするためにこのメソッドを使用していました。プログラミングのアプローチは、ウイルス含有培地の存在下で線維芽細胞の反復的な遠心分離を用いた高効率伝達プロトコルが含まれています。書き換えhiPSCコロニーがTRA-1-81、多能性細胞の表面マーカーのライブ免疫染色を用いて同定した、非書き換え線維芽細胞から分離し、手動で4,5継代。これらのhiPSCその後、マトリゲルプレートに移し、直接プログラミングプレートから、フィーダーフリーの条件下で増殖させた。最初の通過から始めて、hiPSCのコロニーは、hES-L特性を実証IKE形態。このプロトコルを使用して、選択したコロニーの70％以上が正常に拡大し、細胞株に確立することができます。確立されhiPSC行は表面マーカーTRA-1-60及びSSEA-4と同様に、核のマーカーOCT3 / 4、Sox2、及びNanogの特徴を含む多能性マーカーを表示されます。ここで紹介するプロトコルが確立され、フリードライヒ失調症患者と対照個体6、人間の新生児線維芽細胞と同様に、ヒトケラチノサイトから得られた成人の繊維芽細胞を用いてテストされています。

我々はとレトロOCT3 / 4、Sox2の、KLF4およびc-myc（OSKM）をコードするベクターとライブ染色により正しく再プログラムhiPSCの識別を用いたヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）TRA-にヒト体細胞の効率的なリプログラミングのためのプロトコルを提示1から81抗体。

本稿では、…をコードするレトロウイルスベクターを用いて、ヒト成人線維芽細胞をヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）へとリプログラミングするプロトコルを提示します。

このビデオ論文では、レトロウイルスベクターを用いてヒト成人の線維芽細胞をリプログラミングし、多能性幹細胞を作製します。まず、転写因子T three four、SOX two、KLF four、およびcmicをコードするレトロウイルスベクターをヒト線維芽細胞に導入（トランスダクション）します。感染させた線維芽細胞を、マウス胚性フィーダー細胞上で14〜28日間培養します。得られた培養物をTRA 180 1抗体で染色し、リプログラミングされた細胞のコロニーを同定します。陽性コロニーを、増殖させるためにMEFを含むプレートに移植します。免疫細胞化学染色は、多能性マーカーの発現および多能性幹細胞株の樹立を確認するために行われます。その後、これらの細胞株をさらに詳細に特性解析するための追加研究を実施する必要があります。一般的に、体細胞リプログラミングやヒト人工多能性幹細胞（iPSC）培養に不慣れな方は、適切なiPSCコロニーを同定することが困難であるため、苦労することがあります。本手順の実演は、当研究室のポストドクターであるSula Pollak博士が行います。まず、Phoenix AM FO細胞を、10 cmプレートあたり約700万〜800万個の密度で、10 mLの高グルコースDMEMを用いて播種し、インキュベーター内で一晩培養します。翌日、T34SOX、2klf、4cmic、またはGFP遺伝子をコードするベクター12 µgとFuGENE 6 35 µLを含むトランスフェクションミックスを、L-グルタミン含有の無血清高グルコースDMEMで全量を500 µLとして調製します。混合物を20分間インキュベートします。次に、Phoenix細胞にトランスフェクションさせるため、コンフルエンシーが70〜80%に達したPhoenix細胞を含むプレートに、DNA複合体を緩やかにピペッティングします。6〜8時間後、細胞を37 °Cでインキュベートします。培地を吸引して除去し、抗生物質を含む高グルコースDMEM 8 mLに交換します。その後、プレートをインキュベーターに戻し、12時間インキュベートします。ピペットを用いて、ウイルスを含む培地を吸引し回収します。その後、培地を交換し、培地の回収が4回完了するまで12時間ごとにこの操作を繰り返します。回収した培地は4 °Cで保存してください。すべての培地を回収した後、全量を合わせてから、0.45 µmのチューブトップフィルターを用いて50 mLコニカルチューブにろ過し、剥離細胞やデブリを除去します。ウイルス粒子を含むろ過済み培地は、感染活性を維持したまま冷蔵庫で2週間保存可能です。凍結は推奨されません。導入操作の前日に、凍結保存した成人ヒト線維芽細胞を融解し、ゼラチンコートした6ウェルプレートの各ウェルに 1×10⁵ cells を分注します

selecting-isolating-colonies-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。...

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。...

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

このビデオは、成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞(iNPC)を単離する技術を示しています。本稿では、iNPCコロニーを単離し、iNPC集団の継続的な増殖と拡大を促進する適切な培地の存在下で、ラミニン被覆マルチウェルプレートウェルで培養する手順を概説しています。...

成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞コロニーの単離

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。...

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

学ぶ大人の線維芽細胞からレトロウイルスベクターを用いてヒト人工多能性幹細胞を再プログラムする方法。TRA-1-81抗体染色でコロニーを同定し、多能性マーカー発現を確認する効率的なプロトコルです。

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

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