マウスにおけるGPCRヘテロマーの行動機能を研究するためのキメラ構築物のHSV媒介導入遺伝子発現

この手法の全体的な目的は、マウスモデルにおいて、ウイルス媒介性遺伝子導入が、Gタンパク質共役受容体のヘテロ二量体化を必要とする行動表現型にどのように影響するかを観察することです。この手法は、神経薬理学および精神薬理学の分野における重要な問い、具体的には、Gタンパク質共役受容体が分子レベルでどのように相互作用しているかという問いへの回答に役立ちます。

本手法を用いることで、統合失調症やうつ病などの精神疾患モデルにおいて、この相互作用が行動にどのように影響するかを理解することができます。ここでは特に、セロトニン2a受容体と代謝性グルタミン酸受容体2に注目します。これらはいずれも、統合失調症の治療薬の作用機序に関与していることが示されています。まず、承認された方法に従ってマウスを適切に麻酔してください。

足指をつまみ、反応がないことを確認して、外科的麻酔レベルに達していることを確かめます。次に、眼を保護するために眼科用ジェルを塗布します。マウスをステレオタキシス固定装置に取り付け、頭蓋骨が水平かつ平坦になるように頭部の傾きを調整します。

露出した頭皮にポビドンヨードを塗布します。メスを使用して、露出した剃毛部位の頭蓋骨正中線に沿って正中切開を行います。次に、頭蓋骨が露出したままになるよう、切開部位の皮膚にPureitクランプを装着します。

過酸化水素を塗布して骨膜を溶解させ、頭蓋骨の縫合線を露出させます。ブレグマと縫合線が見えたら、頭蓋骨が水平になるように定位固定装置を調整してください。シリンジの針先をブレグマに合わせ、ブレグマの座標を記録します。

前頭皮質に両側注入する場合、記録されたブレグマからの吻側・尾側座標に1.6 mmを、正中線からの内側・外側座標に2.6 mmを加えます。頭蓋骨上の注入部位をマークし、注入部位に小さな穴を開けます。綿棒を使用して、過剰な血液や骨片を拭き取ります。

針を脳表面まで移動させ、背腹座標の深さまで下げます。次に、プランジャーをゆっくりと回してシリンジの内容物を注入し、0.1 µL/minの速度で5分間投与し、計0.5 µLを注入します。注入後、シリンジを5分間そのまま保持します。

規定の時間が経過した後、動物を脳定位固定装置から取り出し、切開部を縫合して、ウォーミングパッドの上に置きます。承認済みの動物実験プロトコルに従い、術後の鎮痛剤を投与してください。ウイルス粒子の定位注入から2〜3日後に、行動テストを実施します。

実験開始の少なくとも4時間前に、マウスを室内に慣らしておく。まず、DOIを0.9%生理食塩水に溶解し、2 mg/kgの濃度にする。敷材のないホームケージを用意し、三脚を用いてカメラをホームケージの真上に調整して設置する。

ホームケージ全体が視野に入るようにカメラを調整します。マウスの体重を測定し、0.9%生理食塩水またはDOIの適切な用量を腹腔内投与します。その後、マウスをホームケージに戻し、10分間待機させます。

10分後、マウスを空のホームケージの中央に配置し、カメラの視野に死角がないことを確認します。カムコーダーの録画ボタンを押し、室外へ出ます。30分後、録画を停止し、マウスを元のホームケージに戻します。

次のマウスで行動テストを繰り返します。実験条件を伏せた状態で、査読者にビデオを確認させてください。ビデオ全体を通して、すべてのヘッドツイッチを手動で記録します。

ヘッドトゥイッチ（頭部振戦）は、マウスによって行われる急速な頭部の揺すぶり動作と定義されます。プロトコルの記述部分に概説されている手順に従ってデータを処理してください。ここに、前頭皮質におけるHSV介在性のトランスジーン発現の代表的な画像を示します。

HSV mGlu2 GFPを前頭前皮質に注入し、免疫細胞化学染色によりGFPの発現を確認した。このスケールバーは200 micronsを示す。この画像は、mGlu2ノックアウトマウスの前頭前皮質におけるHSV介在性トランスジェーン発現および抗mGlu2反応性をウェスタンブロットで示したものである。

ここでは、モノマーとしてのmGlu2の免疫反応性を測定しました。このヒストグラムは、mGlu2ノックアウトマウスの前頭皮質において、ウイルス媒介によるmGlu2の発現は、キメラmGlu2の発現とは異なり、幻覚剤であるセロトニン2a受容体アゴニストDOIによって誘発されるヘッドツイッチ反応を有意に回復させることを示しています。この実験において最も重要なステップは、ウイルス注入、ヘッドツイッチ反応の測定、およびマウスの屠殺の間のタイミングです。

いかなる遅延も実験結果を変化させたり、データに曖昧さを導入したりする可能性があります。習熟すれば、マウスの手術におけるウイルス注入には約30分かかります。また、ヘッドトゥイッチ実験（頭部振戦実験）には、マウス1匹あたり約35分かかります。

複数のマウスを同時に、あるいは時間をずらして手術することを推奨します。これにより、ウイルス構築物の発現がピークとなる手術後3～4日以内に頭部twitch実験を行えるタイムスケジュールを維持することができます。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。