ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

化学的に固定された野生型およびトランスジェニックショウジョウバエの胸部から始めて、緩衝液に入れます。

トランスジェニック胸部では、背側縦筋の神経筋接合部には、神経変性を誘発する変異タンパク質を発現するニューロンが含まれています。

バッファーを取り除き、胸部を瞬間凍結して、二等分中の組織損傷を防ぎます。

新しいバッファーを加え、胸部を解剖皿に移します。

胸部腹側を上にして配置し、神経細胞クラスターを取り除いて正中線を露出させます。

正中線に沿って二等分して、半血を得ます。

余分な組織を取り除きます。

ヘミソレースをブロッキングバッファーでインキュベートして、膜を透過性化し、非特異的抗体結合を防ぎます。

NMJニューロンおよび筋アクチンフィラメントで発現する糖タンパク質を標的とする蛍光色素結合抗体を追加します。

結合していない抗体を除去します。

ブリッジスライドにヘミソレースを配置し、取り付け媒体を追加して、ティッシュを取り付けます。

顕微鏡で可視化します。

野生型と比較して、変異体は神経変性を示す神経染色の減少を示し、筋肉は無傷の蛍光を示します。

二等分を開始する前に、凍結保護手袋と安全メガネを着用し、デュワーフラスコに液体窒素を入れます。ブレードブレーカーを使用してフェザーブレードを斜めにつかみ、ブレードを曲げて小さな破片を折ります。ブレードブレーカーを使用してブレードを所定の位置にロックし、ガラス製パスツールピペットを使用してサンプルチューブからすべてのPBSを取り除きます。

極低温ピンセットを使用して、液体窒素のフラスコにチューブを沈めます。10秒後、パスツールピペットを使用して、氷上の各チューブに約300マイクロリットルの氷冷PBSを加え、氷冷PBSを含む10センチメートルのシリコーンエラストマーコーティング解剖皿に胸部腹側を上にして置きます。鈍い鉗子を使用して胸部を配置し、細い鉗子を使用して胸部神経節の一部を取り除き、胸部の正中線を露出させます。

胸部の正中線をガイドとして使用し、ブレードを使用して胸部の3分の1を浅く切り込み、鈍い鉗子を使用して胸部を45度の角度で配置します。ブレードを使用して胸部の正中線をまっすぐに切り、2つの血胸を取得し、背側縦筋を損傷することなく余分な組織を除去するために慎重に1つまたは2つの切り込みを行います。次に、筋肉組織サンプルを適切に標識されたPBSチューブに入れます。

すべての胸部サンプルが二等分されたら、ブロッキングバッファーで組織を摂氏4度で少なくとも1時間透過処理します。インキュベーションの最後に、新たに調製した構造染色液をボルテックスし、各サンプルに150マイクロリットルの染色剤を加えて、暗所で室温で回転子上で2時間インキュベートします。染色後、サンプルをPBSTで洗浄し、5つの強化ラベルを1枚のガラス顕微鏡スライドに15ミリリットル間隔で半分に重ねてカットします。

改造されたマイクロピペットチップを使用して胸部を各スライドに移し、実験室用ワイプを使用して余分なPBSTを除去します。鉗子を使用して、胸部が筋肉側を上に向くようにサンプルを配置します。サンプルの向きが正しいら、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、各スライドに70マイクロリットルの封入剤を塗布し、各スライドをカバーガラスで覆います。次に、マニキュアを使用してカバーガラスの外側の端をたっぷりとコーティングし、各組織の周囲を完全に密閉します。