機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

Functional Complementation Essayの全体的な目標は、対応する遺伝子の機能的コピーを突然変異細胞に導入して酵素の活性を解明し、突然変異の背景に野生型の表現型が回復するかどうかを確認することです。この方法は、生化学、微生物学、遺伝学、植物生物学、進化など、さまざまな分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、通常は人工的な性質のin vitro条件とは対照的に、通常は生理学的な性質のin vivo条件下で、酵素の機能、活性、および/または役割を評価することです。

この技術の意味するところは、未評価の酵素、および推定または予測可能な機能を持つ酵素の機能の同定および/または解明にまで及びます。この機能補完の手順を実証しているのが、私の研究室の学生であるバイオテクノロジーと分子生物科学専攻のTaylor Harknessです。テキストプロトコルに従ってDapL、TarB、MurE、およびRSH遺伝子をクローニングした後、50ミリリットルの液体培地に変異細菌細胞の単一コロニーを接種し、目的の遺伝子で形質転換し、一晩で成長させます。

2日目に、50ミリリットルの一晩培養を使用して、適切な培地1リットルを接種し、摂氏30度でロックフェーズまで、またはOD600を0.4〜0.6に成長させます。5, 000倍のGおよび4°Cで15分間遠心分離することにより細胞を回収する。次に、上清をデカントし、500ミリリットルの滅菌済みの氷冷蒸留水を使用してペレットを再懸濁します。

細胞を再度遠心分離し、上清をデカントした後、250ミリリットルの滅菌氷冷10%グリセロールを使用してペレットを再懸濁します。細胞を最後に回転させた後、2ミリリットルの10%グリセロールを使用して細胞を再懸濁します。50マイクロリットルのアリコートをマイクロ遠心チューブに移し、チューブをドライアイスエタノール浴に入れてすぐに凍結します。

エレクトロポレーションのために細胞を摂氏マイナス80度で保存します。エレクトロポレーションを行うには、1マイクロリットルの組換えプラスミドを50マイクロリットルのコンピテントセルに添加し、氷上に5分間置きます。セルをエレクトロポレーションキュベットに移し、エレクトロポレーション装置を次の設定に設定します:華氏25度、静電容量2.5キロボルト、および抵抗200オーム。

次に、キュベットを装置に入れた状態で、パルスを送達します。キュベットに1ミリリットルの回収培地を加え、細胞を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。変異体が必要とする適切な温度で60分間穏やかに回転させる振とうインキュベーターで培養物をインキュベートすることにより、細胞を回復させます。

形質転換体を選択するには、100マイクロリットルの培養物を寒天プレート付きの培地にピペットで移し、滅菌スプレッダーを使用して溶液を広げます。その後、適切な温度で一晩インキュベートします。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。

相補解析を実行するには、先ほど示したように、AOH1をエンプティベクトルpBAD33またはエレクトロポレーションを使用してdapL発現ベクトルで変換します。形質転換混合物をLB寒天培地にプレートし、Dapの1ミリリットルあたり50マイクログラム、クロラムフェニコールの1ミリリットルあたり34マイクログラム、およびカナマイシンのミリリットルあたり50マイクログラムを補充します。プレートを摂氏30度で24時間インキュベートしてから、結果を観察します。

エンプティベクターpBAD33またはmurE発現ベクターを使用して、このビデオの前半で示したように、エレクトロポレーションを使用してTKL-11変異体を変換します。LB寒天に形質転換体をプレートし、50マイクログラム/ミリリットルのチアミンと34マイクログラム/ミリリットルのクロラムフェニコールを補給し、プレートを摂氏30度で24時間インキュベートしてから、形質転換体を確認します。対照形質転換と実験的形質転換の両方から、LB培地の2つのプレートに加えて、0.2%アラビノース、およびチアミンのミリリットルあたり50マイクログラムにコロニーをストリーキングまたはプレーティングすることにより、相補性をテストします。

1つのプレートを摂氏30度でインキュベートし、もう1つのプレートを摂氏42度で24時間インキュベートしてから、成長表現型を評価します。このビデオで前述したように、変異型Hx699株とノボスフィンゴビウム種の野生型Rr217株をpRK290エンプティベクター、またはネイティブrshNsp遺伝子を含むベクターでそれぞれ2つの別々の形質転換イベントで形質転換します。テトラサイクリン1ミリリットルあたり10マイクログラムを補給したジャガイモデキストロースまたはPD寒天に形質転換剤をプレートし、少なくとも72時間、または形質転換剤が現れるまでインキュベー

次に、テトラサイクリンを使用して、新しいPD寒天プレート上にXパターンで形質転換体をスリークします。摂氏30度で少なくとも4日間インキュベートした後、両方のプレートの成長表現型を視覚的に調べます。大腸菌の二重変異体AOH1は、DapE遺伝子に変異があり、DapD遺伝子の欠失を抱えており、Dapが提供されない限り増殖しません。

ここに見られるように、DapLを発現するAOH1変異体は、Dap溶解経路でTHDPをLLDapに変換することにより、LLDapフリー培地で増殖することができます。MurE酵素は、グラム陰性菌のペプチドグリカンへのm-DAPの添加を促進します。大腸菌MurE変異体TKL-11は、摂氏42度では成長できません。

この実験では、MurEで形質転換したTKL-11細胞のみが摂氏42度で増殖しました。TyrB遺伝子の突然変異は、チロシンとフェニルアラニンの合成を防ぎます。しかし、このように、TyrB変異体DL39株がA.thaliana At5g36160遺伝子を発現すると、チロシンとフェニルアラニンを欠くM9培地で増殖し、この酵素がチロシンを合成できることが示されました。

ノボスフィンゴビウム種のHx699変異体は、機能しないRSHタンパク質を保有し、低ムコイド表現型を産生します。しかし、天然のRSH遺伝子による形質転換は、多細胞X線条である高ムコイドでより溶解性の細胞外多糖を生成します。対照的に、Hx699変異体を空のベクターで形質転換すると、低粘液型の表現型が生成されます。

このテクニックを習得すると、約24時間から48時間で完了します。適切に実施された場合、クローニング、調製および形質転換ステップの能力を除く、使用するモデル生物の成長に応じて。この手順を試みる際には、機能補完解析に用いる変異体の成長条件要件を覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、従来の in-vitro 公理特性評価などの他の方法を実行して、基質特異性、温度、pH 最適、体細胞速度などの追加の質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、生物学の分野や微生物学などの多くの細分化分野の研究者が、さまざまな生物由来の酵素の生体内機能または役割を解明する道を開きます。このビデオを見れば、エレクトロコンピテントな細菌細胞の作り方、エレクトロポレーションを使って細菌を形質転換する方法、機能補完性を使って遺伝子/酵素の機能を評価する方法について、よく理解できるはずです。

病原性生物を扱うことは非常に危険である可能性があり、必要な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。