Name: 機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶ機能的相補分析法による生化学的経路の酵素活性評価。変異細胞への遺伝子導入で野生型表現型を回復し、DapL・MurE・RSHなどの代謝酵素のin vivo機能を解明する教育用実験手法です。

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AOHとMASは、サポートのための科学技術のロチェスター研究所の生命科学のトーマスH. Gosnell学校の大学を認めています。この作品は、AOH MCB-1120541に米国国立科学財団（NSF）賞によって部分的にサポートされていました。

注：著者は興味を持っている個人のための教育目的のための機能的相補性分析の組み込みを容易にするために、細菌株および組換えプラスミドを提供するために喜んでいます。機能的相補性実験を容易にするために使用したプラスミドは、表1に記載されています。 1.機能補完のためのプラスミドの構築を<ol><li>機能的相補性のためのジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）のクローニング。 <ol><li> V.からDAPLオープンリーディングフレーム（ORF）を増幅A.から有棘とのcDNA シロイヌナズナとC. PCRによるラインハーディ 。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4デオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれと、鋳型DNAの0.5 ngのとのPfxの1単位を含めますDNAポリメラーゼ。 注：工場Aから3 DAPLオルソログの組換えクローニングに関連する完全な説明シロイヌナズナ （-dapL 時 ）、細菌Verrucomicrobium有棘 （Vsを -dapL）および藻類クラミドモナス（Crを -dapL）は、以前に公開されました。2,18-20 注：次のようにDAPLオルソログのクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。 DAPL F- 対 5&#39;-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 &#39; DAPL R 対 5&#39;CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 &#39; DAPL F- での 5&#39;-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 &#39; DAPL R-5&#39;- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 &#39; で Crの DAPL F-5&#39;- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 &#39; Crの DAPL R -5&#39;- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 &#39; </li><li>トンにPCR断片のクローンを作成彼たpET30a組換えプラスミドを産生するためにプラスミドのpET30a :: 対 DAPL、たpET30a :: DAPLプライマー、制限酵素およびT4 DNAリガーゼを用いたpET30a :: クロム DAPL ました 。 <ol><li>簡単に言うと、17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。18-20 </li></ol></li><li>制限のpET30a :: Crの DAPLのためのXbaIおよびSalIおよびXbaIおよびHindIII酵素で機能的相補用プラスミドを作成するには、DAPLプラスミドでのpET30a :: Vsの DAPLとのpET30aを::ダイジェスト。プラスミドpBAD33 :: 対 DAPLを生成するためにT4 DNAリガーゼを用いてプラスミドpBAD33にインサートを連結。 pBAD33 :: DAPLとpBAD33 :: Crの DAPL で 。 <ol><li>インサート50ngのおよび20 ngをインキュベート1×リガーゼ緩衝液中でベクター、一晩17℃でT4 DNAリガーゼ1単位。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることにより34μgの/ mlの-1カナマイシンを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。20 </li></ol></li></ol></li><li> A.からのチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）のクローニング機能的相補性のためのシロイヌナズナ 。 注：A.からのcDNAのクローニングに関する完全な詳細At5g36160は、以前に記載されている遺伝子座タグによって注釈さシロイヌナズナ 4 <ol><li> PCRによりcDNAを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、および鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。 注：CLのために使用されるプライマー次のようにAt5g36160のoningは、次のとおりです。 なtyrB F- での 5&#39;-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; AttyrB R- 5&#39;- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; </li><li> EcoR1とのSal1でPCR断片を消化することによって、組換えプラスミドのpET30a :: At5g36160を生成するために、プラスミドのpET30aへの断片のクローンを作成。後述のようにT4 DNAリガーゼを用いたpET30a中にフラグメントにライゲーション4 </li><li> 、機能的相補性プラスミドの作成制限をXbaIおよびHindIII酵素でたpET30a :: At5g36160を消化し、T4 DNAリガーゼを用いて組換えプラスミドpBAD33 :: At5g3160を生成するために同じ制限酵素部位を用いてpBAD33にインサートを連結します。 <ol><li> 17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換LBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面が34 / mlの-1 chloを補っ24時間37℃でインキュベートすることによってラムフェニコール4 </li></ol></li></ol></li><li> V.からUDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）のクローニング機能的相補性のための有棘 。 注：V.から牟礼ORFのクローニング有棘は、以前に記載されている。18 <ol><li> PCRによるオープンリーディングフレームを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後、プラスミドpET100D :: Vsのむれを生成するために、プラスミドpET100Dにクローニングします。 注：以下のように対牟礼のクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。 MurE F-5&#39;- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT 対 -3 &#39; 対MurE R- 5&#39;- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 &#39; </li><li>機能的相補性のためのプラスミドを作製するために、pET100D :: 対牟礼ダイジェスト 制限XbaIとのSal1酵素およびT4 DNAリガーゼを用いて組換えプラスミドpBAD33 :: Vsのむれを生成するためにpBAD33への挿入を連結。 <ol><li>一晩17℃で、T4 DNAリガーゼの1単位と一緒に、1×リガーゼ緩衝液中で、インサートの50 ngのベクターの20 ngのをインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることにより34 / mlの-1のクロラムフェニコールを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。8 </li></ol></li></ol></li><li>機能的相補性のためのNovosphingobium属からRELA / sのポット（RSH）のクローニング。 注：Novosphingobium属からのrshのクローニングは、以前に記載されている17。 <ol><li> 599ヌクレオチドupstに加えてのrsh ORFを増幅PCRによる終結部位で下流の開始部位と46ヌクレオチドの連。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとTaq DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後のpCR2.1 :: のNSPにrshを生成するために、プラスミドpCR2.1にクローニングします。 <ol><li>増幅されたPCR断片の1μlを、pCR2.1ベクターの1μlを、塩溶液1μlおよび水の1μLをインキュベートします。 5分間25℃でインキュベートし、ライゲーションの2μlのE.へ大腸菌細胞、および37をインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための画面が 24時間Cを°。 注：以下のようにrshのクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。 rshのF-5&#39;- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 &#39; rshのR- 5&#39;- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 &#39; </li><li>機能的相補のために、プラスミドpCR2.1を消化:: NSPは EcoR1でrshと組換えプラスミドpRK290を生産するために広い宿主範囲pRK290への挿入を連結:: NSPは 、T4 DNAリガーゼを用いてrshを実行。 <ol><li> 17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換37をインキュベートすることにより、10μg/ mlの-1テトラサイクリンを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面 24時間°C。17 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>形質転換を容易にするためのエレクトロコンピテント細菌細胞の調製注：エレクトロコンピテント細胞の調製は、少量（ すなわち、250ml）中に縮小することができる培養物の1.0 Lのプロトコル26に基づいています。このプロトコルをbすることができますのでご注意くださいeはFCAを容易にするために、本 ​​稿に記載されている有能なすべての株を作製するために使用される。22 <ol><li>フラスコ内に単一コロニーを液体培地50mlに接種し、一晩成長し、この工程（ 表2）を開始する前に、変異体の遺伝子型を確認してくださいとなっています。 </li><li> 2日目に、一晩培養物50mlで適切な培地（ 大腸菌変異株とNovosphingobium属のためのPDのためのLB）の1.0 Lに接種し、30℃で（対数期）0.4から0.6へのOD 600に成長C. </li><li> 4℃で15分間5000×gで遠心分離することによって収穫の細胞は、上清をデカントし、滅菌氷冷純粋なH 2 O 500ml中にペレットを再懸濁します</li><li>遠心分離し、細胞を4℃で20分間、5000×gで、上清を除去し、無菌の氷冷10％グリセロールの250ミリリットル中にペレットを再懸濁します。 </li><li> 4で20分間5,000×gで細胞を遠心 °C、スーパーをデカント浮遊性の、および10％グリセロールの2.0ミリリットルでペレットを再懸濁。 </li><li>ドライアイス - エタノール浴中に管を配置することによって、凍結直ちにマイクロ遠心チューブに50μlのを転送することにより、細胞をアリコートし、。エレクトロポレーションのために-80℃でコンピテント細胞を保管してください。 </li></ol>相補プラスミドを持つ細菌細胞の3エレクトロポレーション<ol><li>エレクトロポレーションのために、コンピテント細胞のアリコート（50μl）をへの組換えプラスミドの1.0μlの（10-50 ngの）を追加し、5分間氷上に置きます。 </li><li>エレクトロポレーションキュベットにピペッティングを介して混合物を移し、以下の設定にエレクトロポレーション装置を設定：25μFの容量、2.5 kVで、200オームの抵抗とパルスを提供します。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブにピペットを用いてエレクトロポレーションキュベットと転送にリカバリメディア（LB）の1.0ミリリットルを追加します。振とう培養器で60分間穏やかに回転して回復します。 </li><li> RECOから培養物100μlをプレート非常にピペッティングすることにより形質転換体を選択するために、寒天プレート上にステップし、滅菌スプレッダーを使用して拡散します。 注記：適切な寒天プレートを作るために抗生物質や遺伝子型を確認するには、この手順を開始する前に、表1と表2を確認してください。 </li></ol> Lを使用した機能的相補性を容易にするために、AOH1の4形質転換、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL） <ol><li>相補性解析のために、空のベクター（pBAD33）とし、セクション3.0で概説したエレクトロポレーションプロトコルを使用して、別々の形質転換事象でDAPL発現ベクターでAOH1を変換します。 </li><li> 50μg/ mlの-1 DAPおよび34 / mlの-1のクロラムフェニコールおよび50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLB寒天培地上にプレーティングすることによって、形質転換体を選択します。 </li><li> LB私にストリーキングによってレプリカメッキコロニーによる機能補完のためのテスト0.2％及び50μg/ mlの-1 DAPおよび34 / mlの-1カナマイシンなし（w / v）のアラビノースとdium。 </li><li> 24時間、30℃でプレートをインキュベートし、その結果を観察します。 注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合、変異体は、唯一のDAPL遺伝子が変異体バックグラウンドで表現されている唯一のDAPを含まない培地上で生育することが可能であることを示す必要があります。 </li></ol> UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-グルタミル-2,6- メソ -diaminopimelateリガーゼ（むれ）を使用して機能的相補性を容易にするために、TKL-11の5変容<ol><li>空のベクター（pBAD33）とし、セクション3.0で概説したプロトコルを使用してのMurE発現するベクター（pBAD33 :: VsmurE）と変異型を変換します。 </li><li> LB寒天培地上でプレートを選択した形質転換体は、/ ml -1のクロラムフェニコール50μg/ mlの-1チミンおよび34μgのを補充し、24時間、30℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>コントロールと2 LB培地+ 0.2％（w / v）でアラビノースおよび50μg/ ml -1のチミンへの実験的な変換の両方からコロニーをストリーキングやメッキによって補完のためのテスト。 </li><li>視覚的に増殖表現型を評価するために24時間、42℃で30℃、他に一つのプレートをインキュベートします。 注：結果は、変異体はむれ遺伝子がベクターのみの対照と比較して、変異体バックグラウンドで表現されている場合にのみ、42℃で増殖することが可能であることを示す必要があります。 </li></ol>チロシンアミノトランスフェラーゼを使用した機能的相補性を容易にするために、DL39の6.変換（なtyrB） <ol><li> LB寒天プレート上pBAD33もしくはpBAD33 :: At5g36160のいずれかとDL39を変換して、選択した形質転換体は、セクションで概説した50μg/ mlの-1チロシン、50μg/ mlの-1フェニルアラニン、およびプロトコルを使用して、34 / mlの-1クロラムフェニコールを補っ3.0。 </li><li>レプリカ50μg/ mlの-1フェニルアラニンおよび50μg/ ml -1のチロシン、50μg/ mlの-1アスパラギン酸、50μg/ mlの-1ロイシン、を50μg/ ml -1のバリンと最小限（M9）メディア上の-plateコロニー、 50μg/ mlの-1イソロイシン、を10μg/ ml -1のウラシル0.5％（w / v）のグリセロール、0.2％（w / v）でアラビノース。両方のプレートの同じコロニーを画線することによってフェニルアラニンおよびチロシンを欠くプレート上でもレプリカプレートコロニー。 </li><li>増殖表現型を観察するために48時間、30℃でプレートをインキュベートします。 注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合、変異体は、唯一の変異体バックグラウンドでなtyrB遺伝子が発現されている場合にのみ、フェニルアラニンおよびチロシンを含まない培地上で生育することが可能であることを示す必要があります。 </li></ol> Novosphingobium属のHypomucoid表現型の機能的相補を容易にするために、Hx699の7変容。ひずみHx699 </P&gt; <ol><li>野生型株Novosphingobium 属 。（Rr2-17）とpRK290とpRK290した変異Hx699 :: rshの NSPはセクション3.0で概説した形質転換プロトコルを使用して、2つの独立した形質転換イベントに変換します。 </li><li>ポテトデキストロースに変換をプレート（PD）寒天を10μg/ ml -1のテトラサイクリンを補足し、少なくとも24時間、または形質転換体が現れるまでインキュベートします。 </li><li>ストリーク両方の変換新鮮PD寒天プレート上の「X」のパターンで、30でインキュベート 少なくとも4日間、Cを°。視覚的に両プレートの増殖表現型を調べることによってのみ、ベクター、および実験の表現型を観察します。 注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合にrshが変異体バックグラウンドで発現される場合ハイポムコイド表現型が補完されていることを示すべきです。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ロチェスター工科大学でバイオテクノロジーおよび分子バイオサイエンスのカリキュラムに不可欠なコースの多くは、当然の講義部分に加えて、研究室のコンポーネントを持っています。学年2014-2015ためのカリキュラムは、約60％を占める研究室のコンポーネントが含まれている29そのうち48コースの合計が含まれています。そのようなコースは、植物生化学・病理学（FPBP）、ブレンド講義/実験室のコースとバイオセパレーションの基礎です：原則と実践（BPP）、実験室ベースのコース。 各コースの実験室の成分は、講義資料を強化するように設計されています。例えば、生化学的経路および代謝が重くFPBPとBPPで強調されています。トピックのいくつかは、アミノ酸代謝、ペプチドグリカン生合成、植物二次代謝、とりわけ環境ニッチに細菌の応答が含まれています。著者は、機能complemを統合しています講義およびまたはプレ実験室のプレゼンテーションで議論されている代謝経路の理解を強化する両コースでの実験室での演習としてentation。リジン、PG、Tyrを、Pheおよび細菌の緊縮応答の生化学的経路に関与する遺伝子の機能...

遺伝子の機能を解明するの文脈で機能的相補性（S）/役割（複数可）は、相同野生型状態を観察可能な表現型を有する特定の変異体を回復するために特定の相同またはオーソロガス遺伝子の能力として定義されますまたはオルソロガス遺伝子変異バックグラウンドにシスまたはトランスで導入されます。この技術は、広く分離し、機能（複数可）は、多くの遺伝子/役割（複数可）を識別するために使用されてきました。 1つの特定の例は、SのURA3変異体を使用して、 カンジダ・アルビカンスからオロチジン-5-リン酸脱炭酸酵素の単離および同定でありますcerevisiaeおよびE.ののpyrF変異体大腸菌 。1著者は、アミノ酸、ペプチドグリカンとその研究プログラムにおける緊縮応答の代謝に関与し、Bでの教育プログラムにこの技術を組み込んだ遺伝子の機能を解明するために、この技術を使用していますiotechnologyおよび分子バイオサイエンス（BMB）ロチェスター工科大学（RIT）でのプログラム。 原則と慣行（BPP）（ハドソン/ Savka）、RITでBMBのプログラムで2つの上部の分割選択科目の研究室ベースのコース：著者らは、植物生化学/病理学（FPBP）（ハドソン）とバイオセパレーションの基礎を教えます。コー​​スで議論されたトピックのいくつかは、彼らの研​​究分野で提携しているので、著者らは、これらの2実験室ベースのコースに、それぞれの研究プログラムで使用されている技術と実験的なツールの多くが組み込まれています。その一例は、植物、ペプチドグリカンや細菌からの緊縮応答代謝から酸代謝をアミノ酸に関連する講義資料を強化するために、実験室の練習として機能的相補性です。 FPBBコースで議論されている植物由来のアミノ酸経路のうちの3つがあることリシン（リジン）の、チロシン（tyrで）とフェニルアラニン（Pheで）。動物がLys デノボを合成する遺伝子機構を欠いているため、Lysの経路があるため、すべての動物、特にヒトのための必須アミノ酸などのアミノ酸の重要性のコースで強調表示されます。また、最近、植物は細菌のものとは大きく異なるリジンの合成経路を用いることが発見されました。この発見は、部分的にEの機能的相補性によって促進されましたコリジアミノピメリン酸（DAP）のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの酵素L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）をコードする遺伝子を用いて、変異体2、中間ジアミノピメリン介してリジンの合成のための変形経路は、 図1に示されている。また、リジンの合成は、高度に調節されているアミノ酸のアスパラギン酸由来のファミリーを介して容易にする。3タンパク質SYNTにおけるそれらの重要性に加えてhesisは、TyrおよびPheのための経路はフェニル化合物の同化作用のための前駆体化合物のような植物の防御化合物の合成関与となる中で、その重要性を考慮強調表示されています：アルカロイド、リグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、とりわけヒドロキシ酸を4 TyrでおよびPhe経路は、植物や細菌の同化経路の違いを示すために強調されています。植物において、酵素は、TyrおよびPheへの異化作用における主に関与し、これらのアミノ酸の同化に関与していないのに対し、細菌は、酵素チロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）は、両方のアミノ酸の同化作用に関与しています。 （ 図2）。4 ペプチドグリカンの構造に関するグラム陽性およびグラム陰性菌（PG）との相違点は、FPBPコースで強調表示されます。グラム陰性菌のPGは、そのほとんど事実にに基づいて、植物病理学に関する関心があります植物病原体は、グラム陰性です。トップ10の細菌フィト病原体に関する最近のレビューは、すべてのグラム陰性であることを明らかにしました。細菌は属からのものであった： シュードモナス 、 ラルストニア 、 アグロバクテリウム 、 キサントモナス 、 エルウィニア 、Xylella、DickeyaとPectobacterium化学違いの5つのグラム陰性およびグラム陽性菌のPGステムを比較する架橋アミノ酸の差があります両方のタイプの酸です。 PGの異なる架橋のための最初のステップは、PG同化の細胞質工程で起こり、酵素UDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（のMurE）によって促進されます（ 図3A）。 MurEはペプチドステムの3番目の位置における特定のジアミン化合物の付加を触媒する大部分のグラム陰性細菌で6、最後から二番目のLysの前駆体、 メソ -diaminopimelate（ <e架橋アミノ酸およびLysは、ほとんどのグラム陽性菌のPG（ 図3B）で同じ役割を果たすようメートル&gt;メートルの-dap）が提供しています。7これが原因メートルの -dapおよびLys両方が2つのアミンを保有するという事実によるものであり、グループとは、ペプチド幹架橋のための2つのペプチド結合を形成することができます。 バイオセパレーションの場合：原則と実践（BPP）もちろん、細菌の培養のためのオープンとクローズドシステムの違いとどのように栄養のレベルは、環境の変化が議論されていると、両方のシステムで大幅に変更されます。これらのイベントは、「シフトダウン」や飢餓やアミノ酸やエネルギーの十分な供給を契機「シフトアップ」と呼ばれる規制の変更にリンクされています。細菌培養物を単一炭素源と化学的に定義された培地に豊かで複雑な媒体から転送されたときに、「シフトダウン」応答が発生する可能性があります。環境の変化が急速cessaにつながりますtRNAとrRNAの合成化。アミノ酸の生合成をアップレギュレートされていてもリボソーム、タンパク質およびDNA合成の欠如でこの停止をもたらします。 「ダウンシフト」の応答に続いて、既存のリボソーム培地または環境で利用できなくなったアミノ酸を合成する新しい酵素を生成するために使用されます。一定期間後、rRNAの合成と新しいリボソームが組み立てられ、細菌細胞の集団を減少した速度であるが成長し始めます。イベントのコースは「 緊縮応答」または「 ストコントロール」と呼ばれ 、世界的な細胞制御の一例であり、必要な基質およびエネルギー需要の利用可能性を補償するために、細胞の生合成機構を調整する機構と考えることができますされています8緊縮応答は、このような環境での栄養素のフラックスに迅速に対応するために、細菌を可能にし、貢献し、ENH栄養素およびまたは基板の可用性に関して迅速に変更することができる環境で競争する細菌の能力をances。8-9 緊縮応答は、アミノ酸、炭素、窒素、リン酸、および脂肪酸の利用が制限されている遺伝子発現において重要な役割を持っている。8,10-14この緊縮応答は、2個のヌクレオチド、グアノシン四リン酸（ppGpp）とグアノシンによって調整されています五（pppGpp）は、一般的にalarmone（P）ppGppとして一緒に呼ばれます。例えば、アミノ酸が限ら-れているタンパク質合成-alarmone、グアノシンのボトルネックにつながる可能性が3,5-（ビス）グアノシンの同化由来ピロリン酸（ppGpp）、3-二リン酸5 - 三リン酸（pppGpp）が蓄積セルインチ（p）ppGppレベルの変化は、直接、細胞増殖及びdevelopmenに関与している環境での基質の不足を克服するために応答を調​​節する遺伝子の発現に関与しますトン。このプロセスに関与する遺伝子のうちの2つがRELAとスポットと呼ばれています。 RelAのアミノ酸の制限の結果である非荷電tRNAの蓄積に応答に関与するリボソーム関連（p）ppGpp合成酵素です。二官能性（P）ppGpp合成酵素と加水分解酵素などのスポット機能します。スポットの合成酵素活性は、炭素および脂肪酸飢餓の欠如に応答に関与している。8のRelA /スポットホモログは、植物や細菌に広く分布しており、R ELA / Sポット時間 omologsのためのrshと呼ばれている。8,10 -12,16最近の原稿は、細菌Novosphingobium属 Rrを2月17日からこれらのalarmonesの合成に関与する特定のrshタンパク質が存在することを示した。17 ここでは、機能的相補アッセイにつなが4生化学的経路を提示します。この原稿で概説相補アッセイは正しくありませんするための手段を提供します鉱石は識別し、または生化学的経路の授業を補完するために、未知/推定機能（複数可）または教育ツールとしてを有することが予測される酵素を特徴づけるための手段として、このインビボアッセイを使用します。

<table><tbody><tr><td>E. coli変異体</td><td>Hudson/Savka labまたはCGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>Biorad-USA</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>Biorad-USA</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>温度制御インキュベーター</td><td>ジェネリック</td> マイクロ遠心分離機 ジェネ<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>リック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルリア寒天</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12795084</td><td></td></tr><tr><td>M9ミディアム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>63011</td><td></td></tr><tr><td>ポテトデキストロースミディアム</td><td>フィッシャーサイエントフィック&nbsp;</td><td>DF0013-15-8</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Diaminopimelate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92591</td><td></td></tr><tr><td>チミン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Σ-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>チロシン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>フェンリララニン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>バリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>ロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>イソロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Gylcerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>アラビノース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>テトラシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10342-020</td><td></td></tr><tr><td>プラチナpfx DNAポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11708-013</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 Dh5-α</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Top10</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>C4040-03</td><td></td></tr><tr><td>pET100D/トポ ベクター</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>K100-01</td><td></td></tr><tr><td>pCR2.1 ベクター</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>K2030-01</td><td></td></tr></tbody></table>

機能的相補性分析（fca）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

機能的相補性アッセイ（FCA）が広く遺伝子/酵素の機能/役割を解明するために使用されるin vivoアッセイです。この技術は、生化学、遺伝学および他の多くの分野で非常に一般的です。酸、ペプチドグリカンや細菌の緊縮応答は、この原稿で報告されたアミノ酸に関連する生化学的経路の教育を補完する技術の包括的な概観。リジン（L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）およびチロシンとフェニルアラニンの代謝に関与するチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）の代謝に関与しているモデル植物生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの2つのcDNAが強調されている。また、細菌のペプチドグリカン同化経路は、クロスに関与する細菌Verrucomicrobium有棘からUDP-N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）遺伝子を解析して強調表示されていますペプチドグリカンの-linking。細菌の緊縮応答はまた、RSH（R ELA / sのポット時間 omolog）細菌Novosphingobium属におけるハイパームコイド表現型の原因二官能性遺伝子の解析を通じて報告される。FCAの4つの例が提示されています。ビデオは、それらの3、すなわちリジン、ペプチドグリカンと緊縮応答に焦点を当てます。

様々な機能相補分析に使用される菌株は、 表2に記載されています。 機能的相補性解析：L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL） E.大腸菌二重変異体AOH1（ΔDAPD :: Kan2、dapE6）は DAPE遺伝子の変異とDAPD遺伝子の完全な欠失（ 図1）を保有します。このように、変異体​​は、DAPが提供されていない限り、成長することができません。これらの突然変異に、AOH1が栄養要求性であると考えられる。DAPLはPGおよびLys合成（ 図を容易にするために、THDPから直接L、L-ジアミノピメリン酸の合成を触媒としてAOH...

生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。

機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Functional Complementation Essayの全体的な目標は、対応する遺伝子の機能的コピーを突然変異細胞に導入して酵素の活性を解明し、突然変異の背景に野生型の表現型が回復するかどうかを確認することです。この方法は、生化学、微生物学、遺伝学、植物生物学、進化など、さまざまな分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、通常は人工的な性質のin vitro条件とは対照的に、通常は生理学的な性質のin vivo条件下で、酵素の機能、活性、および/または役割を評価することです。この技術の意味するところは、未評価の酵素、および推定または予測可能な機能を持つ酵素の機能の同定および/または解明にまで及びます。この機能補完の手順を実証しているのが、私の研究室の学生であるバイオテクノロジーと分子生物科学専攻のTaylor Harknessです。テキストプロトコルに従ってDapL、TarB、MurE、およびRSH遺伝子をクローニングした後、50ミリリットルの液体培地に変異細菌細胞の単一コロニーを接種し、目的の遺伝子で形質転換し、一晩で成長させます。2日目に、50ミリリットルの一晩培養を使用して、適切な培地1リットルを接種し、摂氏30度でロックフェーズまで、またはOD600を0.4〜0.6に成長させます。5, 000倍のGおよび4°Cで15分間遠心分離することにより細胞を回収する。次に、上清をデカントし、500ミリリットルの滅菌済みの氷冷蒸留水を使用してペレットを再懸濁します。細胞を再度遠心分離し、上清をデカントした後、250ミリリットルの滅菌氷冷10%グリセロールを使用してペレットを再懸濁します。細胞を最後に回転させた後、2ミリリットルの10%グリセロールを使用して細胞を再懸濁します。50マイクロリットルのアリコートをマイクロ遠心チューブに移し、チューブをドライアイスエタノール浴に入れてすぐに凍結します。エレクトロポレーションのために細胞を摂氏マイナス80度で保存します。エレクトロポレーションを行うには、1マイクロリットルの組換えプラスミドを50マイクロリットルのコンピテントセルに添加し、氷上に5分間置きます。セルをエレクトロポレーションキュベットに移し、エレクトロポレーション装置を次の設定に設定します:華氏25度、静電容量2.5キロボルト、および抵抗200オーム。次に、キュベットを装置に入れた状態で、パルスを送達します。キュベットに1ミリリットルの回収培地を加え、細胞を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。変異体が必要とする適切な温度で60分間穏やかに回転させる振とうインキュベーターで培養物をインキュベートすることにより、細胞を回復させます。形質転換体を選択するには、100マイクロリットルの培養物を寒天プレート付きの培地にピペットで移し、滅菌スプレッダーを使用して溶液を広げます。その後、適切な温度で一晩インキュベートします。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。相補解析を実行するには、先ほど示したように、AOH1をエンプティベクトルpBAD33またはエレクトロポレーションを使用してdapL発現ベクトルで変換します。形質転換混合物をLB寒天培地にプレートし、Dapの1ミリリットルあたり50マイクログラム、クロラムフェニコールの1ミリリットルあたり34マイクログラム、およびカナマイシンのミリリットルあたり50マイクログラムを補充します。プレートを摂氏30度で24時間インキュベートしてから、結果を観察します。エンプティベクターpBAD33またはmurE発現ベクターを使用して、このビデオの前半で示したように、エレクトロポレーションを使用してTKL-11変異体を変換します。LB寒天に形質転換体をプレートし、50マイクログラム/ミリリットルのチアミンと34マイクログラム/ミリリットルのクロラムフェニコールを補給し、プレートを摂氏30度で24時間インキュベートしてから、形質転換体を確認します。対照形質転換と実験的形質転換の両方から、LB培地の2つのプレートに加えて、0.2%アラビノース、およびチアミンのミリリットルあたり50マイクログラムにコロニーをストリーキングまたはプレーティングすることにより、相補性をテストします。1つのプレートを摂氏30度でインキュベートし、もう1つのプレートを摂氏42度で24時間インキュベートしてから、成長表現型を評価します。このビデオで前述したように、変異型Hx699株とノボスフィンゴビウム種の野生型Rr217株をpRK290エンプティベクター、またはネイティブrshNsp遺伝子を含むベクターでそれぞれ2つの別々の形質転換イベントで形質転換します。テトラサイクリン1ミリリットルあたり10マイクログラムを補給したジャガイモデキストロースまたはPD寒天に形質転換剤をプレートし、少なくとも72時間、または形質転換剤が現れるまでインキュベートします。次に、テトラサイクリンを使用して、新しいPD寒天プレート上にXパターンで形質転換体をスリークします。摂氏30度で少なくとも4日間インキュベートした後、両方のプレートの成長表現型を視覚的に調べます。大腸菌の二重変異体AOH1は、DapE遺伝子に変異があり、DapD遺伝子の欠失を抱えており、Dapが提供されない限り増殖しません。ここに見られるように、DapLを発現するAOH1変異体は、Dap溶解経路でTHDPをLLDapに変換することにより、LLDapフリー培地で増殖することができます。MurE酵素は、グラム陰性菌のペプチドグリカンへのm-DAPの添加を促進します。大腸菌MurE変異体TKL-11は、摂氏42度では成長できません。この実験では、MurEで形質転換したTKL-11細胞のみが摂氏42度で増殖しました。TyrB遺伝子の突然変異は、チロシンとフェニルアラニンの合成を防ぎます。しかし、このように、TyrB変異体DL39株がA.thaliana At5g36160遺伝子を発現すると、チロシンとフェニルアラニンを欠くM9培地で増殖し、この酵素がチロシンを合成できることが示されました。ノボスフィンゴビウム種のHx699変異体は、機能しないRSHタンパク質を保有し、低ムコイド表現型を産生します。しかし、天然のRSH遺伝子による形質転換は、多細胞X線条である高ムコイドでより溶解性の細胞外多糖を生成します。対照的に、Hx699変異体を空のベクターで形質転換すると、低粘液型の表現型が生成されます。このテクニックを習得すると、約24時間から48時間で完了します。適切に実施された場合、クローニング、調製および形質転換ステップの能力を除く、使用するモデル生物の成長に応じて。この手順を試みる際には、機能補完解析に用いる変異体の成長条件要件を覚えておくことが重要です。この手順に続いて、従来の in-vitro 公理特性評価などの他の方法を実行して、基質特異性、温度、pH 最適、体細胞速度などの追加の質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、生物学の分野や微生物学などの多くの細分化分野の研究者が、さまざまな生物由来の酵素の生体内機能または役割を解明する道を開きます。このビデオを見れば、エレクトロコンピテントな細菌細胞の作り方、エレクトロポレーションを使って細菌を形質転換する方法、機能補完性を使って遺伝子/酵素の機能を評価する方法について、よく理解できるはずです。病原性生物を扱うことは非常に危険である可能性があり、必要な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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生物学

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タンパク質は互いに相互作用し、これらの相互作用が彼らの機能の大部分を決定します。タンパク質相互作用パートナーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメント相補アッセイ(DHFR-PCA)に基づく酵母適応度アッセイを使用して、in...

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質のフマリアルセトー酢酸水素の発現および精製は、例(大腸菌、FPLCにおける発現)と記載されている。精製タンパク質は、結晶化および抗体産生に使用され、酵素アッセイに使用されます。選択されたフォトメトリックアッセイは、オキサロアセテートデカルボキシラーゼおよびアシルピルベートヒドロラーゼとしてFAHD1の多機能性を表示するために提示される。...

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

新しい遺伝子回路の設計には、十分に特徴付けられた遺伝的部分が必要です。ここでは、遺伝子部分を迅速に特性評価するための費用対効果の高いハイスループットの方法について説明します。私たちの方法は、無細胞溶解物、クローニングを回避するための線状DNA、およびスループットを向上させ、反応量を減らすための音響液体処理を組み合わせることにより、コストと時間を削減します。...

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

適応性のある分子クローニングコースベースの学部研究経験による学生の成果の向上

学ぶ機能的相補分析法による生化学的経路の酵素活性評価。変異細胞への遺伝子導入で野生型表現型を回復し、DapL・MurE・RSHなどの代謝酵素のin vivo機能を解明する教育用実験手法です。

機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

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