原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

本プロトコルの総合的な目的は、脳のポリリボソームをマイカ上に正確に精製および担持させ、大規模な後処理や3D再構成解析を必要とせずに、ナノスケールの解像度で数千枚の画像を取得するための詳細なパイプラインを提供することです。この手法は、遺伝子発現の再編成におけるポリソーム内のリボソーム組織化の影響を理解するなど、翻訳および翻訳制御の分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、サンプルの固定や標識が不要であること、および生理的条件に近い状態で測定が行えるため、リボソームと裸のRNA鎖を容易に識別できることです。

この手法は哺乳類のポリリボソームの組織化に関する知見を提供できるだけでなく、酵母、細菌、昆虫などの他の微生物や、遺伝子発現の翻訳制御が関与する状態にも適用可能です。ポリソームサンプルのマイカへの吸着や洗浄ステップの操作は非常に繊細であり、熟練した技術と経験を要するため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。手順のデモンストレーションは、Paola BernaboとLorenzo Lunelliが行います。

まず、付随するテキストプロトコルに従って脳組織を回収し、凍結させます。次に、凍結組織をフリーザーから取り出し、作業台に置きます。あらかじめ冷却しておいた乳鉢に凍結脳組織と液体窒素を入れ、乳棒を用いて粉末状になるまで粉砕します。

約25 milligramsの脳パウダーを冷えたマイクロ遠心チューブに移し、直ちに0.8 millilitersの溶解バッファーを加えます。混合液をピペットで25回素早く上下に吸引・吐出させ、細胞を破砕します。次に、チューブを4 °Cで12,000 x g、1分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。

上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、氷上で15分間保持します。次に、チューブを5分間遠心分離し、核とミトコンドリアをペレット化します。続いて、あらかじめ調製しておいたショ糖密度勾配の上部から1 mLを慎重に取り除きます。

細胞質溶解液の上清を、ショ糖層の上に1滴ずつ静かに重ねます。サンプルがグラジエントの上にロードされた状態で、チューブと釣り合いチューブをスイングローターのバケットに慎重に設置します。グラジエントを100分間遠心分離します。

超遠心分離後、勾配を安定させるため、チューブをバケットに入れたまま4°Cで20分間静置します。その後、サンプルチューブを慎重に取り出し、密度勾配分画システムの回収装置にセットします。UV可視光検出器を用いて260 nmにおける核酸の吸光度をモニタリングしながら、1 mLずつ分画し、氷上に置きます。

次に、目的の分画を30-40 µLずつ分注し、氷上で保持します。サンプルをすぐに使用しない場合は-80 °Cで保存し、凍結融解サイクルの回数を制限するようにしてください。AFMイメージング用のサンプルを調製するには、まず洗浄したマイカシートに1 mMの硫酸ニッケル(II) 200 µLを滴下し、室温で3分間インキュベートします。

その後、溶液を取り除き、圧縮空気で表面を乾燥させ、ペトリ皿を氷上に置きます。次に、目的の分画のアリコート全量を、マイカ上に一滴ずつゆっくりと滴下します。100 µLまたは200 µLのチップを用いて、サンプルをマイカの表面全体に広げ、氷上で3分間インキュベートします。

次に、マイカシートに冷えたAFMバッファーを200 µLずつ滴下して覆い、サンプルを氷上で1時間インキュベートします。ポリリボソームの構造を維持するためには、サンプルを40度以下に保つこと、およびRNaseフリー水で調製した冷たいバッファーを使用することが重要です。インキュベーション後、バッファーを慎重に取り除き、冷えたAFMバッファー200 µLでマイカを3〜4回洗浄して、余分なスクロースを除去します。

次に、マイカを冷たい洗浄液で3回洗浄し、紙を用いてマイカから余分な水分を取り除きます。ポリソーム内のリボソームと裸のRNAの両方を切り離したため、吸着サンプルからショ糖を完全に除去することが極めて重要です。シャーレの蓋を部分的に開けた状態で、サンプルを化学薬品用フード内で乾燥させてください。

2時間後、シャーレに蓋をします。サンプルは室温で保存可能です。準備したサンプルを、両面テープを用いてAFMのサンプルホルダーに固定します。

次に、製造元の指示に従って、サンプルホルダーをAFMステージに挿入します。キャリブレーション後、カンチレバーのチップが表面に接触するまでサンプルに近づけます。スキャン領域を2 x 2 µmに、解像度を512 x 512ピクセル以上に設定し、ライブ背景減算モードを選択して、Zスケールを20-25 nmに設定します。

次に、画像取得を開始します。空気中で画像を取得する際、高さが10から15 nanometersである球状の物体が存在するか画像を確認してください。次に、鋭利な物体が可視化されるまで、セットポイントとフィードバックパラメータを調整します。

良好なサンプルでは、背景は比較的平坦で、2〜4 nmの高さの物体がいくつか見られるはずです。画像の状態が良いことが確認できたら、サンプルの異なる領域で2 $\mu$m $\times$ 2 $\mu$mのスキャンを数回行います。マイカ上にスクロース分注液を滴下した後、AFMを用いることで、密に凝集したリボソームのクラスターとして観察される単一ポリソームの正確なサイズ記述が可能になります。

断面解析を用いてリボソームのピークの一つを詳細に観察すると、リボソームピークの高さは約14 nanometersであることがわかります。これは、空気乾燥後のヒトリボソームおよびポリソームで以前に観察された結果と一致しています。右側の画像では、マクロを使用してリボソームの位置を特定し、各リボソームを赤色の円でマークしています。

これらの情報を用いて、ポリソームあたりのリボソーム数の頻度分布を解析することができます。この実験的分布をガウス曲線でフィッティングしたところ、ポリソームあたり5.8個のリボソームを中心とし、標準偏差は1.3となりました。熟練すれば、脳の粉砕からポリリボソーム画像の取得に至るまでの一連の技術は、適切に行えば8時間以内に完了させることが可能です。

この手順を実施する際は、サンプルを氷上で保持し、マイカへのサンプル滴下には冷やしたバッファーを使用することが重要です。本手順に従い、論文で公開可能な開発者のImageJプラグインを使用することで、ポリソームあたりのリボソーム数を正確に計数できます。この手法を確立することで、ポリソーム形成のキネティクスの理解や、異なる細胞または組織条件下におけるポリソーム構造の変化の特定への道が開かれます。

このビデオを視聴することで、ポリソームの組織化を体系的に分析・研究するために、数千枚のポリソーム画像を取得する方法について十分に理解することができます。