原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

このプロトコルの全体的な目標は、雲母上の脳ポリリボソームの正確な精製と沈着のための詳細なパイプラインを提供し、重い後処理や3D再構成分析を必要とせずにナノスケールの解像度で数千の画像を取得することです。この方法は、遺伝子発現の再配線におけるポリソーム内のリボソーム組織の影響の理解など、翻訳および翻訳制御の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、サンプルの固定や標識が不要であることと、生理学的に近い条件で測定を行い、リボソームと裸のRNAスタンドを簡単に同定できることです。

この方法は、哺乳類のポリリボソームの組織化に関する洞察を提供するだけでなく、酵母、細菌、昆虫などの他の微生物にも適用でき、遺伝子発現の翻訳制御に関与する状況にも適用できます。マイカの吸収と洗浄ステップのためのポリソームサンプルの取り扱いは非常に難しく、取り扱いスキルと経験が必要なため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。手順を実演するのは、パオラ・ベルナーボとロレンツォ・ルネッリです。

まず、付属のテキストプロトコルに記載されているように、脳組織を収集して凍結します。次に、冷凍ティッシュを冷凍庫から取り出してベンチに持ってきます。凍結した脳組織と液体窒素を予冷した乳鉢に入れ、乳棒で粉末になるまで粉砕します。

約25ミリグラムの脳粉を冷たい微量遠心チューブに移し、すぐに0.8ミリリットルの溶解緩衝液を追加します。混合物を25回すばやく上下にピペットで動かし、細胞を破壊します。次に、チューブを12, 000 x gで摂氏4度で1分間遠心分離し、細胞の破片をペレット化します。

上清を新しい微量遠心チューブに移し、チューブを氷上に15分間保持します。次に、チューブを5分間遠心分離して、核とミトコンドリアをペレット化します。次に、事前に準備したショ糖勾配の上部から1ミリリットルを慎重に取り出します。

スクロースを細胞質溶解物の上清で一滴ずつ重ねます。グラジエントの上にサンプルをロードした状態で、チューブとカウンターバランスチューブをスイングバケットローターのバケットに慎重に下げます。グラジエントを100分間遠心分離します。

超遠心分離後、チューブをバケツに入れて摂氏4度で20分間放置し、グラジエントを安定させます。次に、サンプルチューブを慎重に取り外し、密度勾配分画システムのコレクターデバイスに取り付けます。260ナノメートルの核酸の吸光度をUV可視光検出器でモニタリングしながら1ミリリットルの画分を採取し、氷上に置きます。

次に、目的の画分の30〜40マイクロリットルのアリコートを準備し、それらを氷の上に保ちます。サンプルをすぐに使用しない場合は、80°Cで保存し、凍結融解サイクルの数を制限するための措置を講じてください。AFMイメージング用のサンプルを調製するには、まず洗浄したマイカシートに200マイクロリットルの1ミリモルニッケルii硫酸塩を含ませ、室温で3分間インキュベートします。

次に、溶液を取り出し、圧縮空気で表面を乾燥させ、ペトリ皿を氷の上に置きます。次に、関心のある部分から全体のアリコートを雲母に一滴ずつゆっくりと加えます。100 μLまたは200 μLのチップを使用して、サンプルをマイカの表面全体に広げ、サンプルを氷上で3分間インキュベートします。

次に、マイカシートを200マイクロリットルのコールドバッファーAFMで一滴ずつ覆い、サンプルを氷上で1時間インキュベートします。サンプルを40度に維持し、RNaseフリー水で調製した冷たいバッファーを使用することは、ポリリボソーム組織を維持するために重要です。インキュベーション後、バッファーを慎重に取り出し、200マイクロリットルのコールドバッファーAFMでマイカを3〜4回洗浄して、余分なスクロースを除去します。

その後、マイカを冷水で3回洗い、紙でマイカの余分な水分を排出します。ポリソーム内のリボソームとネイキッドRNAの両方を切断した今、吸収剤サンプルからスクロースを完全に除去することは非常に重要です。サンプルを化学フードの下で乾燥させ、ペトリ皿の上部を部分的に開いた状態で乾燥させます。

2時間後、ペトリ皿を閉じます。これで、サンプルを室温で保存できるようになりました。調製したサンプルをAFMのサンプルホルダーに両面テープで貼り付けます。

次に、製造元の指示に従って、サンプルホルダーをAFMステージに挿入します。キャリブレーション後、カンチレバーの先端が表面にかみ合うまでサンプルに近づきます。2 x 2ミクロンのスキャン領域、少なくとも512 x 512ピクセルの解像度を選択し、ライブバックグラウンド減算モードを選択し、20〜25ナノメートルのZスケールを選択します。

次に、画像取得を開始します。空中で画像を取得するときに、10〜15ナノメートルの高さを特徴とする丸い物体の存在を探して、画像を検査します。次に、シャープな物体が視覚化されるまで、設定値とフィードバックパラメータを調整します。

背景は、高さが約2〜4ナノメートルの物体を含む良好なサンプルでは比較的平坦に見えるはずです。画像が良好に見えたら、異なるサンプル領域で2×2ミクロンのスキャンを数回取得します。雲母上にスクロースアリコートを沈着させた後、AFMは、密集したリボソームのクラスターとして現れる単一のポリソームの正確なサイズ記述を提供します。

断面解析を使用してリボソームのピークの1つを詳しく見ると、リボソームのピークの高さは約14ナノメートルであることがわかります。これは、空気乾燥後にヒトのリボソームとポリソームについて以前に観察されたものと一致します。右の画像では、マクロを使用してリボソームの位置を特定し、各リボソームを赤い円でマークしています。

この情報を用いて、ポリソーム当たりのリボソーム数の度数分布を解析することができる。この実験分布は、ポリソームあたり 5.8 リボソームを中心とするガウス曲線で適合され、標準偏差は 1.3 でした。一度習得すると、脳の粉砕からポリリボソーム画像取得までのこの技術は、適切に実行すれば8時間未満で行うことができます。

この手順を試行する際は、サンプルを氷上に保持し、マイカへのサンプル堆積にコールドバッファーを使用することを忘れないでください。この手順に従い、開発者のImageJプラグインを使用して論文で利用できるようにすると、ポリソームあたりのリボソームの数を正確に数えることができます。各開発の後、この技術は、ポリソーム形成の動力学を理解し、ポリソーム組織の変化とそれらの異なる細胞または組織の状態を特定する道を開きます。

このビデオを見た後、組織を体系的に分析および研究するために何千ものポリソーム画像を取得する方法をよく理解しているはずです。