Name: 原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いた脳ポリソームの高分解能イメージング法。固定や標識を必要とせず、生理的状態に近い条件下でリボソームとRNAの構造を可視化し、翻訳制御と遺伝子発現の研究に活用できます。

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この研究は、イタリアのトレント自治州が資金提供したAXonomIX研究プロジェクトの支援を受けました。

マウス組織を得るために使用される慣行は、トレント大学（イタリア）の動物の保護（OPBA）、プロトコルがないためにボディによって承認されました。 art.31政令に従って、04から2015まで、ありません。 2014分の26。全てのマウスを統合生物学センター（CIBIO）、トレント大学、イタリアのモデル生物の施設で維持しました。 注意：サンプルの任意のRNA分解を避けるためのRNaseの混入を最小限にするためにDEPC処理水を使用してすべてのバッファを準備します。 脳全体からポリソームの調製<ol><li>脳組織収集（15分） <ol><li> 5分36 CO 2窒息と野生型マウス株C57BL / 6を安楽死させます。慎重に、頭蓋骨36から脳を解剖1.5mlチューブに組織を配置し、直ちに液体窒素中に入れてください。使用するまで-80℃で保管してください。 </li></ol></li><li>溶解液の調製（30分） <ol><li>使用した全脳組織を粉砕液体窒素下で乳鉢と乳棒。 </li><li>冷たいマイクロ遠心チューブに約25mgの粉末を移し、すぐにすぐに上下にピペッティング25回溶解バッファー（ 表1参照）の0.8ミリリットルを追加し、細胞を崩壊させる（粉砕組織の融解を避けるため）。 </li><li>細胞破片をペレット化し、4℃で1分間、12,000×gでチューブを遠心。 </li><li>新しいマイクロチューブに上清を移し、15分間氷上でチューブを保持します。 </li><li>核とミトコンドリアをペレット化し、4℃で5分間、12,000×gでチューブを遠心。 </li><li>新しいマイクロチューブに上清を移します。 </li><li> 6ヶ月の最大のために-80℃で上清を保存したり、すぐにそれを使用しています。 </li></ol></li><li>スクロース勾配調製し、遠心分離（2時間30分） <ol><li> RNaseフリー水（ジエチル処理水（DEPC-水）または商業）ANと広範囲に洗浄超遠心管D 3％H 2 O 2 / DEPC H 2 O溶液。 </li><li>氷の上にチューブを入れて、（スクロース溶液については表1を参照）を各チューブの底の冷たい50％ショ糖溶液の5.5ミリリットルを追加します。慎重にチューブが完全に満たされるまで、鋭い相間を維持するために、中間相に近い滞在し、ドロップすることにより、15％ショ糖溶液のドロップを追加します。チューブが完全に満たされると、気泡の形成を回避するために、ゴム栓で閉じます。 </li><li>寒い部屋で静かに水平管を敷設し、2時間、この位置に保管してください。この時間の後、ゆっくりとバック垂直位置にチューブをまっすぐにし、氷の上に置きます。グラデーションは現在、使用される準備ができています。また、前者の従来の勾配を使用して、百分の15から50までのショ糖勾配を準備します。 </li><li> すなわち、上清をSTEで得られた（低温室で勾配の上部から慎重に1.0ミリリットルを除去し、細胞質ゾル溶解物とのドロップによりショ糖降下をオーバーレイP 1.2）。 </li><li>慎重スイングバケットローターのバケットにチューブを下げます。超遠心機を用いて、4℃で18万×gで100分間の勾配を遠心分離します。 </li><li>遠心分離後、勾配は安定化させるために4℃で20分間、彼らのバケットにチューブを残します。 </li></ol></li><li>スクロース勾配分画（2時間） <ol><li>慎重に超遠心ローターから1超遠心管を削除し、密度勾配分画システムのコレクタ装置にマウントします。 （ 図1上パネルを参照してください）UV / VIS検出器を用いて260 nmの吸光度を監視する1ミリリットルの画分を収集します。氷の上で集めた画分を保管してください。 </li><li> 、関心の画分の30-40μlのアリコートを準備し、使用するまで-80℃で保管する前に、氷の上に保管してください。二つ以上の凍結融解サイクルを受けたアリコートまたはショ糖画分を使用しないでください（ 図1下のパネルを参照）。 </li></ol> &lt;/李&gt; </ol>原子間力顕微鏡（3時間）2.サンプル調製<ol><li>マイカシートをはがし、テープを使用しました。 </li><li> DEPC水でマイカシートを3〜4回​​洗浄し、小さなペトリ皿に入れてください。その後、空気を用いて表面を乾燥させます。 </li><li> 1 mMののNiSO 4200μlでマイカをカバーし、室温で3分間インキュベートします。 </li><li>ニッケル溶液を外し、空気を用いて表面を乾燥。氷の上に雲母とペトリ皿を置くことによって4℃で将来のすべてのステップを実行してください。 </li><li>氷の上に1.4.2で得られた一定分量を解凍し、軽く雲母のドロップにより試料滴のすべてを追加します。 100~200μlのチップを使用して、雲母の表面全体にサンプルを広げ。 3分間氷上でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 200μlの冷緩衝液-AFM（ 表1参照）でドロップすることによりマイカシートの低下をカバーし、氷上で1時間インキュベートします。 </li><li>液体中のイメージング<ol><li>慎重にバッファ-AFMを削除し、マイカシート3-4時間を洗います200μlの冷緩衝液-AFMでのsが過剰ショ糖を除去しました。次いで、溶液のいくつかのマイクロリットルで覆われた雲母表面を残し、（ 表1参照）冷洗浄液でマイカシートを3回洗浄します。 </li><li> 3（画像取得）を指すように移動します。 </li></ol></li><li>空気中のイメージング<ol><li>慎重にバッファ-AFMを削除し、過剰ショ糖を除去するために、200μlの冷緩衝液-AFMでマイカ3-4回洗浄します。そして、マイカを冷洗浄溶液で3回洗浄する（ 表1参照 ）、紙を使用して余分な水分を排出します。 </li><li>部分的に開いたペトリ皿の上部との化学フード下で乾燥させるためにサンプルを残します。 2時間後、室温でペトリ皿と店を閉じます。彼らは何年も安定しているように2〜3時間後のサンプルを測定します。 </li></ol></li></ol> 3.画像取得（熱安定化後の画像あたり15分） 注：雲母上に固定化されたポリソームがACモードを使用して、空気中または液体中で画像化することができます。 <ol><li>両面テープを使用して、サンプルホルダーに雲母を取り付けます。 </li><li>製造元の指示に従ってAFMステージにおけるサンプルホルダーを挿入します。可能な場合、撮像は、液体中に、時間的にポリソーム安定性を高めるためより低い温度25℃でサンプルを維持しようとします。 </li><li> ACイメージングに適したカンチレバーを選択して、チップホルダ以下のメーカーの指示にマウントします。ここでは、空気のイメージングのための2-20 N / mおよび液体イメージングのための周りに0.1 N / mの間に一定の力で使用カンチレバー。 </li><li>カンチレバー上のレーザスポットを調整し、象限検出器信号をゼロ。 </li><li>時宜を得た駆動周波数を選択して、10から20ナノメートルの振幅でカンチレバーを駆動します。 </li><li>先端が表面に係合するまでサンプルに近づきます。 </li><li> 2×2ミクロンのスキャン領域を選択し、少なくとも512×512ピクセルの画像を取得する（ピクセル幅&lt;4 nm）を、ライブバックグラウンド減算モードと20〜25ナノメートルのZスケールを選択します。 </li><li>トンを点検彼は、画像範囲25から30ナノメートルの空気と25と液体中の30nmの幅で取得する際の10と15nmの間の高さによって特徴づけラウンド物体の存在を探しています。鋭利なものを可視化されるまで、設定値とフィードバックのパラメーターを調整します。背景には、いくつかの2-4 nmの高さのオブジェクト（ 図2AおよびBを参照）で、良好な試料中の比較的平坦な表示されます。 </li><li> （ポイント3.8で示されるように）画像が良く見える場合は、別のサンプル領域におけるいくつかの（少なくとも10）2×2ミクロンのスキャンを取得します。 </li><li> （任意）。必要であれば、選択されたポリソームの高解像度の画像を取得する（ 図2C参照 ）。 </li><li> AFM像の任意の傾きを除去し、効果を漂流を修正するためにソフトウェアの修正（平面減算およびライン・バイ・ライン補正アルゴリズム）を適用します。 </li></ol> 4.データ解析（画像あたり30分） <ol><li> ImageJの中のエクスポート画像（オプション：スケールファクタを適用）preferentially 例えば 、可逆圧縮フォーマットを使用して、TIFF形式（ 図3A参照 ）。 </li><li> （ 図3Cを参照）ポリソームでリボソームをカウントする（ 図3Bを参照）、サンプルの統計的特性を計算するために（ImageJのマクロ/ツールセットのサブディレクトリにコピーする）ImageJのマクロツールセットRiboPick.ijmを使用してください。 <ol><li>プログラムの初期化&lt;読み取り画像&gt;ツールを使用して画像をロードを開始。 </li><li>標準ImageJの&lt;ポイント選択&gt;ツール（シフト+左クリックは、リボソームの複数選択を可能にする）とリボソームセンターを選択してください。 &lt;マークリボソーム&gt;ツールで選択されたリボソームをマークします。リボソーム座標は、カスタムテキストウィンドウに表示されます。 </li><li>ポイント4.2.2で示す手順を繰り返す同じポリソームへのより多くのリボソームを追加します。 </li><li>第1に最後に追加されたリボソームから取り外す開始する（&lt;最後のピックを元に戻す&gt;ツールを使用して、誤ってマークされたリボソームを削除します212;現在のポリソーム中のみ）。 </li><li>ポリソームが完了すると、&lt;新規ポリソーム&gt;ツールを使用します。ポリソーム数は画像のオーバーレイとして追加されるように、テキストウィンドウが更新されます。 </li><li>リボソームを書くために、&lt;結果を保存して閉じを&gt;使用して、ファイル（画像のデフォルトの単位が使用されている）と、選んだリボソームおよびポリソームをまとめたPNG画像を調整します。元の画像は保存されずに閉じられています。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li>
<li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+bacterial+growth%3A+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400(2010).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220(2012).</li>
<li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li>
<li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6(2014).</li>
<li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li>
<li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li>
<li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li>
<li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis%3A+characterization+of+the+ergosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li>
<li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li>
<li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li>
<li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li>
<li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294(2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly%28A%29-tail%3A+a+cryo+electron+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li>
<li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li>
<li>Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li>
<li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li>
<li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li>
<li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li>
<li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li>
<li>Bernabò, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboAbacus%3A+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

著者らは、この論文に競合する金銭的利益を持っておらず、開示するものも何もありません。

DNAの構造は転写およびクロマチンの組織化は、遺伝子発現の転写制御の我々の理解を進めたようなプロセスを記述するために最も重要であることが証明されたように、真実の理解を向上させるためにポリソームの組織構造を分析することが不可欠です翻訳とその調節の。 記載されたプロトコルを用いて、穏やかに平坦な表面上に固定化されたポリソームの最適密度は、AFM画像化に適したが得られます。好都合に調製したサンプルでこれらの条件を使用して、毎時約50ポリソームは、さらなる分析および特徴付けのための準備ができて取得することができます。また、室温で保存された乾燥した試料を、一年以上後のイメージングに適していることが証明されています。 成功した私たちのプロトコルでポリソーム画像を得るために、いくつかの重要なステップがあります：適切dissectio直後に瞬間凍結された組織を使用しますnおよびRNA分解を最小限に抑えるために-80℃で保存しました。 mRNAからリボソーム解離を避けるために、シクロヘキシミドおよびRNase阻害剤を含む溶解緩衝液を使用します...

タンパク質の合成は、細胞1,2の中で最もエネルギーを消費するプロセスです。したがって、タンパク質の存在量は、主に翻訳なく転写レベル3,4,5で制御されることではない驚くべきことです。ポリソームは、機能的なタンパク質性の読み出しへのmRNAの情報を変換する基本的な高分子成分です。ポリソームは、これまでいくつかの翻訳のコントロールが6-13を収束高分子複合体として認識されています。リボソーム構造14〜16に関する研究の数百にもかかわらず、翻訳のダイナミクスへの詳細な分子洞察やポリソームのトポロジーは、限られた関心が発生しました。その結果、ネイティブポリソームリボ核タンパク質複合体の組織や翻訳に対する潜在的な効果はまだとても曖昧な問題です。ポリソームは、潜在的にどのようなヌクレオソームとエピジェネティック制御をミラーリング、まだ不明注文し、機能的な組織を非表示にすることができますlsコマンドは、転写フィールドに表されています。実際、この魅力的な仮説の調査は、さらなる研究と新しい技術的なアプローチが必要です。この行では、構造的な技術や原子間力顕微鏡は、実り同様にヌクレオソーム17,18のために達成されたものに、遺伝子発現を制御するための新しいメカニズムを解明するために協力することができます。 リボソーム14-16の発見以来、その構造は、広範囲のタンパク質合成のベースにメカニズムの分子の説明を提供する、原核生物19,20、より最近のヒト22における酵母21とで特徴付けられています。ポリソームは、最初は、一般的な2D幾何学的な組織14を形成し 、小胞体の膜に認められました。前に述べたように、ポリソームアセンブリは、リボソーム構造などの一定の関心の対象ではなかったです。過去には、ポリソームはTRによって、本質的に研究されてきましたansmission EMベースの技術。ごく最近になって、クライオEM技術は、人間の細胞溶解物27またはセル28で、23-26 インビトロ翻訳系から精製されたポリソームの3D再構成を可能にしました。これらの技術はポリソーム23、26-28と小麦胚芽ポリソーム24内の隣接するリボソームの接触面の予備的分子の説明ではリボソームリボソーム組織に関するより多くの洗練された情報を提供しました。したがって、クライオEM断層撮影法は、分子の詳細とリボソームリボソーム相互作用の開示を可能にするが、それはデータ処理のために重い計算リソースを必要とする大規模なポスト処理及び再構成の分析によって負担されます。また、リボソームリボソーム相互作用の分子の詳細を得るために、リボソームの高解像度のマップが必要とされ、基準リボソームのこの種のは、ほんの数種のために利用可能です。重要なことは、低温電子顕微鏡断層撮影法では、無料RNAを検出することができません。 Theref鉱石は、新しい技術が完全に翻訳機構の組織を理解する必要があります。 クライオEMのほかに、AFMはまた、下等真核生物29-33と人間27にポリソームの直接画像化のための有用なツールとして採用されています。 EMと比較すると、AFMには、サンプルの固定または標識化を必要としません。また、測定は、近くの生理学的条件下で、はっきりとリボソームと裸のRNA鎖27の両方を特定するユニークな可能性を用いて行うことができます。単一ポリソームのイメージングは​​、広範かつ重いポスト処理及び再構成に比べて少し後処理の労力でナノ分解能で数千ものイメージを取得し、比較的迅速に行うことができるクライオEM顕微鏡で必要とされる分析。その結果、AFMデータハンドリング及び分析は、高価なワークステーションと高い演算能力を必要としません。このように、この技術は、ポリソームの形状に関する情報を収集し、形態学的特性（例えば高さ、長さと幅）、リボソーム密度、自由なRNAの存在とクライオEMよりも高いスループットでポリソーム27あたりのリボソームの数。このように、AFMはポリソーム27を描写するためにEM技術に強力かつ補完的なアプローチを示します。 ここでは、AFMが画像に適用し、マウス脳ポリソームを分析されたデータの分析に精製からの完全なパイプラインを提示します。提案されたプロトコルは、精製の問題にとAFMイメージングのために使用されているマイカ基板上のポリソームの正確な堆積に焦点を当てています。簡単にAFMコミュニティで使用される一般的なソフトウェアを用いて行うことができる従来の粒子の分析に加えて、RiboPick呼ばImageJの34プラグインは、ポリソーム27、35当たりのリボソームの数をカウントするために提示されています。

<table><tbody><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>リボロック RNAse阻害剤</td><td>ライフテクノロジー</td><td>EO-0381</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>D6750</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>微量遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5417R</td><td>ライセートの調製</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>ショ糖勾配調製</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ LE-80K</td><td>ショ糖勾配遠心分離機</td></tr><tr><td>超遠心分離機 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>SW 41 Ti</td><td>ショ糖勾配遠心分離</td></tr><tr><td>ポリアロマーチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td>ショ糖勾配遠心分離</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td>ショ<td>糖勾配分画</td></tr><tr><td>AFM</td><td>アサイラム研究</td><td>サイファー</td><td>ポリソームの視覚化</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

翻訳機構は、 すなわち、ポリソームまたはポリリボソームは、細胞内で最大かつ最も複雑な細胞質機械の一つです。リボソーム、mRNAを、いくつかのタンパク質非コードRNAによって形成されたポリソームは、翻訳制御が行われるプラットフォームを統合表します。リボソームは、広く研究されているがしかし、ポリソームの組織はまだ包括的に理解を欠いています。このように多くの努力がポリソーム組織と埋め込まれていてもよい翻訳制御のいずれかの新たなメカニズムを解明するために必要とされます。原子間力顕微鏡（AFM）は、ナノスケールの解像度で3D画像の取得を可能にする走査型プローブ顕微鏡の一種です。電子顕微鏡（EM）の技術に比べて、AFMの主な利点の一つは、それが染色およびプロ固定を必要とせずに近くの生理学的条件下で維持されるべきサンプルを可能に空気中で、溶液中に両方の画像の数千を取得することができるということですcedures。ここでは、マウス脳及びマイカ基板上での堆積からポリソームの正確な精製のための詳細なプロトコールが記載されています。このプロトコルは、AFMと3次元物体としての復興と空気や液体中でポリソームイメージングを可能にします。低温電子顕微鏡（クライオEM）に相補的な、提案された方法は、好都合に系統的ポリソームを分析し、それらの組織を研究するために使用することができます。

全マウス脳のショ糖勾配ポリソームプロファイリング 彼らの重量とサイズに合わせて巨大分子を分離ポリソームプロファイリングによって、細胞溶解物からポリソームを精製することが可能です。ポリソームプロファイリングでは、このような本例のように培養した細胞または組織から得られた細胞質溶解物は、（その沈降係数に従って40Sおよび60Sサブユニット、80Sリボソームおよびポリソームから無料でRNAを分離するために超遠心分離することにより、線形ショ糖勾配上にロードされ、処理されます図1上パネル）。 254 nmでサンプルの吸光度とフラクションコレクションは、転写物あたりのリボソームの数が異なるリボソームやポリソームに富むショ糖画分の分離を可能にします。画分を集め、AFM画像化のために等分し、-80℃で保存することができる（ 図1下のパネル）。 <p class...

リボソームの構造は広範囲に特徴付けられていますが、ポリソームの組織化はまだ十分に研究されていません。この知識不足を克服するために、ここでは、空気中および液体中の原子間力顕微鏡(AFM)による哺乳類のポリソームの正確なイメージングのための詳細な準備プロトコルを示します。

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

本プロトコルの総合的な目的は、脳のポリリボソームをマイカ上に正確に精製および担持させ、大規模な後処理や3D再構成解析を必要とせずに、ナノスケールの解像度で数千枚の画像を取得するための詳細なパイプラインを提供することです。この手法は、遺伝子発現の再編成におけるポリソーム内のリボソーム組織化の影響を理解するなど、翻訳および翻訳制御の分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、サンプルの固定や標識が不要であること、および生理的条件に近い状態で測定が行えるため、リボソームと裸のRNA鎖を容易に識別できることです。この手法は哺乳類のポリリボソームの組織化に関する知見を提供できるだけでなく、酵母、細菌、昆虫などの他の微生物や、遺伝子発現の翻訳制御が関与する状態にも適用可能です。ポリソームサンプルのマイカへの吸着や洗浄ステップの操作は非常に繊細であり、熟練した技術と経験を要するため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。手順のデモンストレーションは、Paola BernaboとLorenzo Lunelliが行います。まず、付随するテキストプロトコルに従って脳組織を回収し、凍結させます。次に、凍結組織をフリーザーから取り出し、作業台に置きます。あらかじめ冷却しておいた乳鉢に凍結脳組織と液体窒素を入れ、乳棒を用いて粉末状になるまで粉砕します。約25 milligramsの脳パウダーを冷えたマイクロ遠心チューブに移し、直ちに0.8 millilitersの溶解バッファーを加えます。混合液をピペットで25回素早く上下に吸引・吐出させ、細胞を破砕します。次に、チューブを4 °Cで12,000 x g、1分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、氷上で15分間保持します。次に、チューブを5分間遠心分離し、核とミトコンドリアをペレット化します。続いて、あらかじめ調製しておいたショ糖密度勾配の上部から1 mLを慎重に取り除きます。細胞質溶解液の上清を、ショ糖層の上に1滴ずつ静かに重ねます。サンプルがグラジエントの上にロードされた状態で、チューブと釣り合いチューブをスイングローターのバケットに慎重に設置します。グラジエントを100分間遠心分離します。超遠心分離後、勾配を安定させるため、チューブをバケットに入れたまま4°Cで20分間静置します。その後、サンプルチューブを慎重に取り出し、密度勾配分画システムの回収装置にセットします。UV可視光検出器を用いて260 nmにおける核酸の吸光度をモニタリングしながら、1 mLずつ分画し、氷上に置きます。次に、目的の分画を30-40 µLずつ分注し、氷上で保持します。サンプルをすぐに使用しない場合は-80 °Cで保存し、凍結融解サイクルの回数を制限するようにしてください。AFMイメージング用のサンプルを調製するには、まず洗浄したマイカシートに1 mMの硫酸ニッケル(II) 200 µLを滴下し、室温で3分間インキュベートします。その後、溶液を取り除き、圧縮空気で表面を乾燥させ、ペトリ皿を氷上に置きます。次に、目的の分画のアリコート全量を、マイカ上に一滴ずつゆっくりと滴下します。100 µLまたは200 µLのチップを用いて、サンプルをマイカの表面全体に広げ、氷上で3分間インキュベートします。次に、マイカシートに冷えたAFMバッファーを200 µLずつ滴下して覆い、サンプルを氷上で1時間インキュベートします。ポリリボソームの構造を維持するためには、サンプルを40度以下に保つこと、およびRNaseフリー水で調製した冷たいバッファーを使用することが重要です。インキュベーション後、バッファーを慎重に取り除き、冷えたAFMバッファー200 µLでマイカを3〜4回洗浄して、余分なスクロースを除去します。次に、マイカを冷たい洗浄液で3回洗浄し、紙を用いてマイカから余分な水分を取り除きます。ポリソーム内のリボソームと裸のRNAの両方を切り離したため、吸着サンプルからショ糖を完全に除去することが極めて重要です。シャーレの蓋を部分的に開けた状態で、サンプルを化学薬品用フード内で乾燥させてください。2時間後、シャーレに蓋をします。サンプルは室温で保存可能です。準備したサンプルを、両面テープを用いてAFMのサンプルホルダーに固定します。次に、製造元の指示に従って、サンプルホルダーをAFMステージに挿入します。キャリブレーション後、カンチレバーのチップが表面に接触するまでサンプルに近づけます。スキャン領域を2 x 2 µmに、解像度を512 x 512ピクセル以上に設定し、ライブ背景減算モードを選択して、Zスケールを20-25 nmに設定します。次に、画像取得を開始します。空気中で画像を取得する際、高さが10から15 nanometersである球状の物体が存在するか画像を確認してください。次に、鋭利な物体が可視化されるまで、セットポイントとフィードバックパラメータを調整します。良好なサンプルでは、背景は比較的平坦で、2〜4 nmの高さの物体がいくつか見られるはずです。画像の状態が良いことが確認できたら、サンプルの異なる領域で2 $\mu$m $\times$ 2 $\mu$mのスキャンを数回行います。マイカ上にスクロース分注液を滴下した後、AFMを用いることで、密に凝集したリボソームのクラスターとして観察される単一ポリソームの正確なサイズ記述が可能になります。断面解析を用いてリボソームのピークの一つを詳細に観察すると、リボソームピークの高さは約14 nanometersであることがわかります。これは、空気乾燥後のヒトリボソームおよびポリソームで以前に観察された結果と一致しています。右側の画像では、マクロを使用してリボソームの位置を特定し、各リボソームを赤色の円でマークしています。これらの情報を用いて、ポリソームあたりのリボソーム数の頻度分布を解析することができます。この実験的分布をガウス曲線でフィッティングしたところ、ポリソームあたり5.8個のリボソームを中心とし、標準偏差は1.3となりました。熟練すれば、脳の粉砕からポリリボソーム画像の取得に至るまでの一連の技術は、適切に行えば8時間以内に完了させることが可能です。この手順を実施する際は、サンプルを氷上で保持し、マイカへのサンプル滴下には冷やしたバッファーを使用することが重要です。本手順に従い、論文で公開可能な開発者のImageJプラグインを使用することで、ポリソームあたりのリボソーム数を正確に計数できます。この手法を確立することで、ポリソーム形成のキネティクスの理解や、異なる細胞または組織条件下におけるポリソーム構造の変化の特定への道が開かれます。このビデオを視聴することで、ポリソームの組織化を体系的に分析・研究するために、数千枚のポリソーム画像を取得する方法について十分に理解することができます。

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

このビデオでは、組み立てられたヌクレオソームを視覚化するための静的原子間力顕微鏡法を実演します。この高解像度イメージング技術により、ヌクレオソーム構造の研究が可能になります。...

アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

出典: Lunelli, L., et.al. 原子間力顕微鏡で脳ポリソームを覗き込む. J. Vis.

原子間力顕微鏡を用いたマウス脳から単離されたポリソームのイメージング

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。...

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

jove_content&lt;この論文では、原子間力顕微鏡(AFM)を使用してタンパク質の光受容体の構造を調査する方法について説明しています&gt;PeakForce Quantitative Nanomechanical Property...

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

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