Name: ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学ぶLC-MS分析によるヒト血小板のミトコンドリア代謝評価法。ロテノン処理による代謝適応を同位体トレーシングで定量し、疾患メカニズム解明と治療法開発への応用が期待されます。

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倫理文：ヒトサンプルの治療に関するすべてのプロトコルは、大学のペンシルベニア州の人間研究倫理委員会のガイドラインに従ってください。 緩衝液および100倍ストック溶液の調製<ol><li>ベースタイロード緩衝液1 Lを用意。 8.123グラムのNaClを組み合わせ、1.428グラムのNaHCO 3、0.466グラムの塩化カルシウム2∙2 H 2 O、0.224グラムのKCl、および0.095グラムののMgCl 2はのddH 2 Oで1 Lに総音量を調整しますフィルタは、ベースタイロード緩衝液を殺菌します。 </li><li>グルコースとパルミチン酸の100倍のストック溶液を準備します。 100Xグルコースストック溶液のために、のddH 2 O 1ml中の100mgのグルコースまたは[13 C 6] -グルコースを溶解100Xパルミチンソリューションについては、パルミチン酸の2.56ミリグラムまたはエタノール1ml中の[13 C 16] -パルミチン酸の2.72ミリグラムを溶解します。フィルタは、100×ストック溶液を滅菌します。 </li><li>適切なエンリッチドタイロードバッファを準備します<ol&gt; <li>非標識試験については、1 100×グルコースストック溶液のmlおよびベースタイロード緩衝液の98ミリリットルを100倍パルミチン酸原液の1ミリリットルを追加します。 </li><li>グルコース標識研究のために、ベースタイロード緩衝液の98ミリリットルに100倍パルミチン酸原液の1 100×[13 C 6] -グルコースストック溶液のミリリットルと1ミリリットルを追加します。 </li><li>パルミチン酸標識研究のために、1ミリリットルの100倍のグルコースストック溶液とベースタイロード緩衝液の98ミリリットルに[13 C 16] -パルミチン酸原液の1ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li>ロテノン治療のためのソリューションを準備<ol><li>ジメチルスルホキシド（DMSO）にロテノンの10mMストック溶液を調製します。 </li><li>非標識の用量応答研究のために、1.4.3に進みます。単回投与での標識研究については、1.4.5に進みます。 </li><li> 1 nMの〜100μMの範囲のロテノンの濃度の溶液を得るために、DMSO中の10mMロテノンストックの連続希釈を行います。これらは、100×ストックしています秒。 </li><li> 10時から1μMまでのロテノンの濃度の溶液を準備するために1.3.1からベースタイロード緩衝液+グルコース+パルミチン酸の5ミリリットルにそれぞれ株式の50μLを加えます。また、車両制御として機能するようにDMSOの50μlを添加します。 2.1に進んでください。 </li><li> 10μMの作業溶液を得るために、DMSO中の10mMストック溶液を1000倍に希釈します。 </li><li> 5ミリリットルベースタイロード緩衝液+のそれぞれに、この株式の50μLを加える[13 C 6] -グルコース+パルミチン酸を1.3.2からとベースタイロード緩衝液+グルコース+ [13 C 16] 1.3.3から-パルミチン酸。最終濃度は、100nMのロテノンです。また、車両のコントロールとして機能するように、各バッファにDMSOの50μlを添加します。 </li></ol></li></ol> 2.血小板の分離注：このメソッドは、いずれかの全血からまたは血小板バッグ由来の血小板に適しています。ここに含まれるデータ例を調製しました血小板バッグ由来の血小板を使用。 Basuさんらを参照してください。5全血から単離した血小板を使用してについての詳細は。 <ol><li>全血からの血小板の単離 注：血小板の袋から血小板を単離する場合は、2.2.1に進みます。 <ol><li>ノーブレーキと15分間175×gで遠心分離全血。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、上部多血小板血漿（PRP）層の1ミリリットルを。 </li><li> 5分間400×gでPRPを遠心分離します。 </li><li>上清を吸引し、3.1または3.2に進みます。 </li></ol></li><li>血小板バッグから血小板の単離<ol><li> 1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し血小板懸濁液の1ミリリットルを。 </li><li> 5分間400×gで懸濁液を遠心。 </li><li>上清を吸引し、3.1に進みます。または3.2。 </li></ol></li></ol> 3.実験の実行<ol><li>生体異物の影響を決定するために、治療（ 例えば、ロテノン）関心の代謝産物のレベルでは、（ 例えば、アセチルCoA）、3.1.1に進みます。関心の下流の代謝物に代謝前駆体の取り込みに対する生体異物（ 例えば 、ロテノン）の効果を決定するために、3.2.1に進みます。 <ol><li>各条件のために何よりも少ない3つの生物学的複製物を使用していない、ステップ1.4.4からの各溶液1ミリリットルのステップ2.1.4または2.2.3から血小板ペレットを再懸濁します。 </li><li>湿度95％、5％CO 2で1時間、37℃に設定した水ジャケットCO 2インキュベーター中に再懸濁した血小板をインキュベートします。 4.1に進み 注：ここでは、用量反応実験を記述する。代替的に、時間経過実験を行うことができるが、ここでの用量を固定し、インキュベーションの長さではなく、変化させました。 </li></ol></li><li>関心の下流の代謝物に代謝前駆体の取り込みに対する生体異物処理の効果を判定すること。 <ol><li> U各条件について3つの生物学的複製物よりも少ないを歌っていない、ステップ1.4.6からの標識されたタイロードバッファの各製剤の1ミリリットルのステップ2.1.4または2.2.3から血小板ペレットを再懸濁します。 </li><li>湿度95％、5％CO 2で1時間、37℃に設定した水ジャケットCO 2インキュベーター中に再懸濁した血小板をインキュベートします。 4.1に進みます。 </li></ol></li></ol> 4.焼入れとCoAの抽出<ol><li> 3分間3000×gで遠心分離することにより、血小板をペレット化。 </li><li>上清を吸引。 </li><li> 750μlの氷冷10％トリクロロ酢酸で再懸濁した血小板（w / vで）。 </li><li>適切な安定同位体標識内部標準を追加します。例えば、目標は、前述のように、酵母から得られた安定同位体標識されたアシルCoAチオエステル（SILEC技術）29の混合物100μLを使用し、試料を横切るのCoA種のレベルを比較する場合。 </li><li>パルス超音波処理0.5秒のパルスを用いて、各試料を30回。 </li><li> 4℃で10分間、16,000×gで遠心分離サンプル。 </li><li>真空マニホールドにC18固相抽出（SPE）カラムを取り付けます。 </li><li> 1ミリリットルのメタノールでカラムをコンディショニング。 </li><li> 1ミリリットルののddH 2 Oでカラムを平衡化</li><li>カラムを通して試料由来の上清（この場合は約850μl）を実行します。 </li><li> 1ミリリットルの水でカラムを洗浄します。 </li><li>溶出画分を収集するための真空マニホールドへの負荷10mlのガラス遠心管。 </li><li>メタノール中の25mM酢酸アンモニウム1mlでカラムを溶出します。 </li><li>窒素ガス下で乾燥した溶出液。 </li><li> 50μlの5％（w / v）の5-スルホサリチル酸で乾燥残渣を再懸濁し、HPLCバイアルに移します。 </li></ol> 5. HPLCセットアップ<ol><li> HPLCシステムのための制御ソフトウェアを使用して、 表1に示すように、標的分析物と利用カラム用に最適化されたHPLC条件付きメソッドを作成します。 注：列temperatこのデータの生成に使用されるUREは、25℃であったが、具体的なパラメータは、機器によって、目的の化合物に関して変化するであろう。アシルCoAの定量化のために、LC-MS分析の複数の方法が報告されており、異なるLC条件14,19,20中の異なる分析物のための検証します。 </li><li> HPLCは十分に平衡化させます。 注：これは、メソッドの開始溶媒条件でカラムのカラムと平衡を取り付ける前に、溶媒の両方のプライミングを含める必要があります。平衡量は製造元の指示に従ってください、そして得られた流出物は無駄に転用されるべきです。 注：HPLCの設定に関する詳細についてはBasuさんとブレア5を参照してください。 </li></ol> 6.質量分析計のセットアップ<ol><li>質量分析計の制御ソフトウェアを使用して、目的の化合物のイオン化形態を検出するための標的化方法を作成します。パラメータが提示されています表2に示します。 注：これらの化合物の安定同位体類似体は、正または負のモードでは、優れた感度を与えるかどうかを決定し、それらの検出のためのソースと光学条件を最適化するために使用されるべきです。質量分析法の総検出時間は、関連するHPLC法の時間成分に対応する必要があります。 注意：前述のように、アシル-CoA分析の複数の方法は、正14と負イオン15モードと高分解能質量分析計17ではなく三連四重極機器28の使用を含め、報告されています。 </li><li>清潔で、楽器を校正分析計に安定したスプレーを確立し、キャリブレーション・ソリューションのための時間が十分に製造元の指示に従ってソースおよび光学系から放散することができます。 </li><li>質量分析計の制御ソフトウェアを持つすべてのサンプルのシーケンスを設定します。院生名前または数値識別子を解除し、適切な注入量と機器方法を示しています。最初のサンプルの前に空白を実行し、キャリーオーバーまたはマトリックス影響を緩和するために、必要に応じてサンプル間の他のブランクおよび洗浄を実行します。 注：選択された分析物」液体クロマトグラムのピークを統合するための処理方法は、多くの場合、この配列内に設定するか、またはその後のデータ処理に適用することができます。 </li><li>シーケンスを開始し、圧力変動やシステム障害や実行時の信号強度の損失などの問題のために定期的に質量分析計やHPLCシステムを監視します。 注：重度の問題や永続的な実行の失敗は、ランとパージと再平衡化HPLCシステムだけでなく、洗浄を停止し、質量分析計の校正が必要な場合があります。 MSの設定やデータ処理に関する詳細についてはBasuさんとブレア5を参照してください。 </li></ol>

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<li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma%3A+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).</li>
</ol>

著者には、競合する金融利益を宣言しません。

ここでは、摂動ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとして、単離された血小板の有用性を示しています。具体的には、ロテノンにより複合体Iの阻害に応答して、代謝適応を特徴としています。 本研究は、ヒト血小板の細胞株におけるロテノンによって複合体I阻害の役割に以前に報告の調査結果を拡張しました。重要なことに、これはロテノンはまた、血小板のスクシニルCoAの形成を阻害することを明らかにした、血小板βHBブチリル-CoAの増加を刺激し、アセチルCoAの血小板レベルに影響を及ぼしませんでした。 細心の注意は、このタイプのいずれかの分析の妥当性と再現性を保証するために注意しなければなりません。血小板が全血から単離する場合、リンパ球の汚染および血小板活性化を防止するために、上記のように、分離は、リンパ球のundisを含むバフィーコートを残すに専念特別な注意を払って、正確に進めるべきturbed。用量応答曲線は意味のあるものにするためには、連続希釈液は、各ステップで均質に混合しながら、正確に行わなければなりません。血小板再懸濁させた...

機能不全のミトコンドリアの代謝は、神経変性、癌、および心血管疾患30を含む広範囲の疾患に関与しています。このように、多大な努力は、疾患の病因に寄与する代謝欠陥を特徴付ける上に置かれています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）は、複雑な生物学的マトリックスからの分析物の定量のためのゴールドスタンダードと考えられ、多くの場合、代謝研究の8のために使用されます。多くの場合、生物医学研究の場合のようにしかし、ヒトの疾患に関連するアクセスと明確に定義されたモデルを達成することが課題です。 多くの研究は、細胞の代謝7,9上の生体異物または遺伝的異常の影響をプロービングするための細胞モデルを変革採用します。癌細胞において起こる代謝再プログラミングは、交絡因子21を導入し 、従って、理想的ではないことができます。これらの問題はcircumveすることができます代謝分析のために十分なバイオマスを得ることが困難な場合がありますが、一次電池モデルとnted。また、培養に用いられる抗生物質の多量の影響は、潜在的な交絡ミトコンドリア研究16として強調されています。 ヒト血小板は、代謝研究5,22,27,32のための十分なミトコンドリアのコンテンツを持つ一次細胞モデルを利用する機会を与えます。血液は、個々のドナーから、または血液銀行から大量に描画し、したがって外部要因を容易に制御することができるモデルを提供〜第血小板を容易に取得することができます。第二に、それらの小さいサイズのために、血小板は容易も最小限備え実験室5内の最小の準備作業で他の血液成分から単離することができます。注目すべきは、血小板は核を含有しないため、独立して転写調節の代謝に変化を研究するために使用することができます。ここでは、ことを示していますアシル - コエンザイムA（COA）チオエステルの相対的定量化に加えて、単離された血小板のシステムは、炭素代謝を調べるために使用することができます。具体的には、我々は重要な代謝産物のアセチルへの[13 C] -labelの取り込みを調べるために安定同位体（非放射性）標識された[13 C 6] -グルコースおよび[13 C 16]パルミチンで代謝標識の使用を報告しますCoAの糖または脂肪酸酸化を介し。これは、生化学的経路13,24におけるアシルCoA種の広範な関与と、このようなロテノン3,33との複合体Iの阻害などの他の変数を、テストするには、このシステムの扱い易に、強力な一般化、および汎用性の高いプラットフォームを提供します。以下のプロトコルで提供される情報に加えて、同位体標識のためとLC-MSベースの分析のために使用される方法の広範な説明はBasuさんとブレア4に記載されています。

<table><tbody><tr><td><強>試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物(CaCl2 * H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>パルミチン酸</td><td>ケイマン10006627</td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C16-パルミチン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>605573</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>5-スルホサリチル酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390275</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirle</td><td>Fischer Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>水 (H2O)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>W7-4</td><td>(オプティマ)</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>85171</td><td>(オプティマ)</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>A454-4</td><td>(オプティマ)</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A639-500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml エッペンドルフ チューブ</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td></td></tr><tr><td>LC バイアル (プラスチック)</td><td>ウォーターズ</td><td>186002640</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ガラス遠心分離チューブ</td><td>キンブル チェイス</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>オアシス固相抽出 (SPE) カラム</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT094225</td><td></td></tr><tr><td>パスチューアー ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>企業</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2ウォータージャケットインキュベータ</td><td>ーNuaire</td><td>オートフローNU-8500</td><td></td></tr><tr><td>トリプル四重極質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Finnigan TSQ Quantum</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ソース</td><td>Thermo Scientific</td><td>HESI II</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム</td><td>Phenomenex</td><td>Luna C18</td><td>3 &mu;M粒度、200mm×2mm</td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のlc-ms分析

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

摂動されたミトコンドリア代謝は、さまざまな疾患の原因となる役割を果たすものとして新たな関心を集めています。代謝経路の変化を調べるには、外的要因を適切に制御し、再現性のある有意義な結果が得られるモデルが必要です。多くの研究では、これらの目的のために形質転換細胞モデルが採用されています。しかし、多くのがん細胞株で起こる代謝リプログラミングは、交絡変数を導入する可能性があります。このため、初代細胞が望ましいですが、代謝研究に十分なバイオマスを得ることは困難です。ここでは、ヒト血小板が、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析と組み合わせて代謝研究を実施するためのプラットフォームとして利用できることを示します。このアプローチは、特定の代謝経路の活性を調べるための相対定量および同位体標識に適しています。 個々のドナーまたは血液銀行からの血小板の利用可能性により、このモデルシステムは臨床研究に適用でき、スケールアップが可能です。ここでは、単離された血小板を利用して、複合体I阻害剤ロテノンに応答して以前に同定された代償性代謝シフトを確認します。より具体的には、解糖系の減少は、アセチルCoAレベルを維持するための脂肪酸酸化の増加を伴う。私たちの結果は、血小板が細胞代謝に対する生体異物の影響を調べるための、簡単にアクセス可能で医学的に関連するモデルとして使用できることを示しています。

我々は以前にロテノンへの暴露から生じる補償代謝適応を説明。の一般化を再現しており、この手法の有用性を実証するために、この知見は、以前に細胞培養モデルにおいて同定されたこの調査は、この代謝シフトはまた、無核および細胞培養と同様の実験アーティファクトする傾向はない血小板で発生するかどうかを試験することを目的としました。彼らは代謝活性を保持していたが、この作品は、人間の注入のために古すぎるとみなされていたペン外傷センターから6日齢の血小板を用いて行きました。 図1に示すように、単離を行った。合計ワークフローがもはや患者への注入のために有用である血小板の利用可能性と、96ウェルプレートベースのスループットに臨床サンプル又は実験条件の限定された数から容易にスケーリングすることができます。 図2）複合体の阻害に起因すると仮定されている細胞株に...

ここでは、単離されたヒト血小板は私がロテノンを阻害複雑に応じて代謝適応を研究するためにアクセス可能なex vivoでのモデルとして使用できることを示します。このアプローチは、液体クロマトグラフィー - 質量分析法によって同位体トレースおよび相対的定量化を使用し、研究デザインの多様に適用することができます。

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

この手順の全体的な目的は、ゼノバイオティクス処理または疾患状態が細胞代謝をどのように変化させるかを決定することです。この手法により、疾患状態または投与された毒素が細胞代謝にどのような影響を与えるかを明らかにできる可能性があります。そして、それが判明すれば、何らかの介入によってその欠陥を矯正できるかどうかを明らかにすることが可能です。この手法の主な利点は、形質転換細胞株に依存しないため、ヒトの健康に直接的に関連する結果が得られる可能性が高いことです。本手順を開始するために、ジメチルスルホキシドを用いて10 millimolarのロテノンストック溶液を調製します。10 millimolarのロテノンストック溶液を段階的に希釈し、ロテノン濃度が1 nanomolarから100 micromolarの範囲となる溶液を得ます。次に、あらかじめ調製した濃縮Tyrode緩衝液 5 mL に、各ストックソリューションを 50 µL ずつ加え、rotenone 濃度が 10 pM から 1 µM の範囲となる溶液を調製します。溶媒コントロールとして、緩衝液サンプルの一つに DMSO を 50 µL 加えます。全血から血小板を分離するため、全血サンプルを 175 x g で 15 分間、ブレーキをかけずに遠心分離します。完了後、上層の血小板豊富血漿を1 mL、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。血小板豊富血漿を移す際は、血小板ペレットにリンパ球が混入しないよう、バフィーコートを乱さないように注意してください。血小板豊富血漿層を400 x gで5分間遠心分離します。次に、上清を吸引します。各条件につき3回以上の生物学的反復を用いて、血小板ペレットを、あらかじめ調製した各ロテノネ溶液1 mLで再懸濁します。その後、再懸濁した血小板を、湿度95%・5% carbon dioxide、37 °Cに設定したウォータージャケット付き二酸化炭素インキュベーター内で1時間インキュベートします。ここで、サンプルを 3000 x g で 3 分間遠心分離し、血小板をペレット化します。上清を吸引した後、適切な安定同位体標識内部標準物質を添加します。次に、氷冷した 10% 三クロロ酢酸 750 µL で血小板を再懸濁します。各サンプルを0.5秒のパルスで30回パルスソニケーションします。遠心分離後、C18固相抽出カラムを真空マニホールドに取り付けます。1 mLのメタノールでカラムをコンディショニングします。次に、1 mLの2回蒸留水でカラムを平衡化します。サンプル由来の上清をカラムに通します。終了後、1 mLの水でカラムを洗浄します。次に、溶出分画を回収するため、10 milliliterのガラス製遠心チューブを真空マニホールドにセットします。25 millimolarの酢酸アンモニウムとメタノールの混合液1 milliliterを用いて、カラムを溶出させます。溶出液を窒素ガス下で乾燥させた後、乾燥残渣を5% 5-sulfosalicyclic acid 50 microlitersに再懸濁し、分析用にHPLCバイアルに移します。SH-SY5Y細胞で以前に報告された通り、ロテノンに応答したアセチルCoAチオエステルの相対レベルの変化は、複合体Iの抑制に起因すると仮説を立てている。具体的には、アセチルCoAレベルは不変である一方で、サクシニルCoAの用量依存的な減少と、同時にβ-ヒドロキシブチリルCoAの増加が認められた。ロテノン処理したヒト血小板の解析では、非常に一貫した結果が得られており、独自の実験データセットを提供している。血小板には核がないため、この観察結果はロテノンに対する反応がミトコンドリアに依存していることを強調している点に留意することが重要です。この手順の後、以下のようなさらなる疑問に答えるために、代謝トレーシングなどの他の手法を実施できます：この処置や疾患状態は基質の利用にどのように影響するか？ある代謝物のレベルに変化が認められた場合、なぜ変化しているのか？経路のどのステップが、どのように影響を受けるのでしょうか。このビデオを視聴することで、全血から血小板を分離し、制御されたex-vivoチャレンジを実施し、LCMS分析のためにアセチルCoAチオエステルを抽出する方法について、十分に理解できるはずです。

lc-ms-analysis-human-platelets-as-platform-for-studying-mitochondrial

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環境

パーキンソン病の原因遺伝子に変異を有する患者からの線維芽細胞は、簡単にアクセスを表す...

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ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

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ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

血小板代謝は、特に出血および血栓性疾患における血小板の過活動および低活動性の役割に関連しているため、興味深いものです。血漿からの血小板の単離は、一部の代謝アッセイに必要です。ここで紹介するのは、洗浄した血小板から細胞内代謝産物を単離する方法です。...

定量的代謝フラックス研究のための洗浄済みヒト血小板の調製

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壊死、アポトーシス、血小板活性化の特徴を示す凝固促進血小板の包括的解析

私たちは、無傷のツリーの師部を保存し、それを観察するための準備をする技術を提供します。 師部組織に生息する節足動物や微生物などの生物を導入・観察するための師部サンドイッチという装置を創製しています。...

ツリー組織内節足動物と微生物群集を研究するための技術

この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。...

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

学ぶLC-MS分析によるヒト血小板のミトコンドリア代謝評価法。ロテノン処理による代謝適応を同位体トレーシングで定量し、疾患メカニズム解明と治療法開発への応用が期待されます。

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

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