ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

この手順の全体的な目標は、生体異物治療または病状のいずれかが細胞代謝をどのように変化させるかを決定することです。この方法は、疾患状態や適用された毒素が細胞代謝にどのように影響するかを明らかにする可能性を秘めています。そして、これがわかれば、私たちの方法は、ある種の介入が欠陥を修正できるかどうかを明らかにする能力を持っています。

この技術の主な利点は、形質転換細胞株に依存しないため、人間の健康に直接関連する答えが得られる可能性が高いことです。この手順を開始するには、ジメチルスルホキシド中のロテノンの10ミリモルのストック溶液を準備します。10ミリモルのロテノンストック溶液の段階希釈を行い、1ナノモルから100マイクロモルの範囲のロテノン濃度の溶液を得ます。

次に、各ストック溶液50マイクロリットルを、以前に調製した濃縮タイロード緩衝液5ミリリットルに加えて、10ピコモルから1マイクロモルの範囲のロテノン濃度の溶液を調製します。緩衝液サンプルの1つに50マイクロリットルのDMSOを添加して、車両制御として機能します。全血から血小板を単離するには、全血サンプルを175 x gで15分間、休憩なしで遠心分離します。

終了したら、上部多血小板血漿層の1ミリリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。多血小板血漿を移送するときは、血小板ペレットがリンパ球によって汚染されないように、バフィーコートを乱さないように注意してください。.多血小板血漿層を400 x gで5分間遠心分離します。

次に、スーパーナテントを吸引します。各条件に対して3回以上の生物学的複製を使用して、血小板ペレットを以前に調製した各ロテノン溶液の1ミリリットルに再懸濁します。.これに続いて、再懸濁した血小板を、湿度95%、二酸化炭素5%に設定したウォータージャケット付き二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で1時間インキュベー

この時点で、サンプルを3000 x gで3分間遠心分離することにより、血小板をペレット化します。スーパーナテントを吸引した後、適切な安定同位体標識内部標準を添加します。次に、血小板を氷冷した10%トリクロロ酢酸750マイクロリットルに再懸濁します。

各サンプルを0.5秒パルスで30回パルス超音波処理します。遠心分離後、C18固相抽出カラムを真空マニホールドに貼り付けます。カラムを1ミリリットルのメタノールでコンディショニングします。

次に、カラムを1ミリリットルの二重蒸留水で平衡化します。サンプルから派生した上清を列に通します。終了したら、カラムを1ミリリットルの水で洗います。

次に、10ミリリットルのガラス製遠心チューブを真空マニホールドに装填し、溶出画分を回収します。1ミリリットルの25ミリモル酢酸アンモニウムとメタノールでカラムを溶出します。溶出液を窒素ガス下で乾燥させた後、乾燥した残留物を50マイクロリットルの5%5-スルホサリチル酸に再懸濁し、サンプルをHPLCファイルに移して分析します。

SH-SY5Y細胞で以前に報告されたように、ロテノンに応答したアセシルCoAチオエステルの相対レベルの変化は、複合体の阻害に起因すると仮定されています。具体的には、サクシニルCoAの用量依存的な減少とβ-ヒドロキシブチリルCoAの同時増加がありますが、アセチルCoAレベルは変化しませんでした。ロテノンで処理したヒト血小板の分析により、非常に一貫性のある結果が得られ、独自の実験データが得られます。

この観察結果は、血小板が核を欠いているため、ロテノンに対する応答のミトコンドリア依存性を強調していることに注意することが重要です。この手順に続いて、代謝追跡のような他の方法を実行して、次のような追加の質問に答えることができます:この治療または病状は基質の利用にどのように影響しますか?ある代謝物のレベルの変化を特定した場合、なぜそれは変化しているのでしょうか?

経路のどのステップが、どのように影響を受けるのか?このビデオを見れば、全血から血小板を単離する方法、制御された ex-vivo チャレンジを行う方法、LCMS 分析用のアセイル CoA チオエステルを抽出する方法について十分に理解できるはずです。